清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療非小細(xì)胞肺癌的臨床及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

凌綿聰　樊偉　熊婷　王天磊　潘嘉欣　莫燕麗　劉建浩

〔摘要〕 目的 探討清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）的臨床效果，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立清金保肺湯多成分-多靶點(diǎn)-多通路的中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合小鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)于NSCLC的作用機(jī)制。方法 選取三亞市中醫(yī)院2019年1月至2020年12月收治的NSCLC患者80例作為研究對(duì)象，分為對(duì)照組40例（常規(guī)治療）與觀察組40例（在對(duì)照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療），治療1個(gè)月后觀察兩組治療效果及評(píng)估兩組不良反應(yīng)，監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群百分比及絕對(duì)計(jì)數(shù)的變化情況。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選肺癌腫瘤樣本與正常樣本的差異基因;運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)搜索清金保肺湯藥物有效活性成分以及藥物作用靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);利用R語(yǔ)言進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析、基因本體論（GO）富集分析。采用NSCLC細(xì)胞株A549右腋下接種建立NSCLC荷瘤模型，蛋白質(zhì)免疫印跡法對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 觀察組有效率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），不良反應(yīng)率顯著低于對(duì)照組（P<0.05），CD3⁺T、CD4⁺T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著上升（P<0.05），B細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著下降（P<0.05）。網(wǎng)絡(luò)藥理分析共篩選得到35個(gè)靶點(diǎn)基因、59個(gè)有效活性成分;PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析顯示，絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）、EFGR-酪氨酸激酶抑制劑、核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）等可能是清金保肺湯治療NSCLC的重要靶點(diǎn)。KEGG通路富集分析顯示，清金保肺湯治療NSCLC主要與酪氨酸激酶受體信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17、MAPK等多條信號(hào)通路有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，給藥后清金保肺湯低、高劑量組小鼠腫瘤組織中NF-κB和B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.01），Bcl-2相關(guān)X蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01），驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。

結(jié)論 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并結(jié)合小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，初步探究了清金保肺湯治療肺癌的基因靶向作用以及通路蛋白等信息，為進(jìn)一步深入研究清金保肺湯對(duì)于肺癌的治療機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 肺癌;清金保肺湯;作用機(jī)制;臨床效果;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號(hào)通路;小鼠

〔中圖分類號(hào)〕R285? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕B? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.012

Clinical and network pharmacology study of Qingjin Baofei Decoction combined with

acupuncture in the adjuvant treatment of non-small cell lung cancer

LING Miancong， FAN Wei， XIONG Ting， WANG Tianlei， PAN Jiaxin， MO Yanli， LIU Jianhao*

（Sanya Hospital of Traditional Chinese Medicine， Sanya， Hainan， 572000 China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the clinical effect of Qingjin Baofei Decoction combined with acupuncture in the adjuvant treatment of non-small cell lung cancer （NSCLC）. By means of network pharmacology， the regulation network and relationship

network of Qingjin Baofei Decoction with multi-component， multi-target and multi-pathway were established， and its mechanism of action on NSCLC was studied in vivo in mice. Methods 80 NSCLC patients admitted to Sanya Hospital of Traditional Chinese Medicine from January 2019 to December 2020 were selected as the research objects， and they were divided into control group 40 cases （routine treatment） and observation group 40 cases （on the basis of control group， Qingjin Baofei Decoction combined with acupuncture treatment was applied）. After one month of treatment， the therapeutic effect and adverse reactions of the two groups were observed， and the percentage and absolute count of lymphocyte subsets were monitored. GEO database was used to screen the differential genes between lung cancer samples and normal samples. The traditional Chinese medicine systems pharmacology （TCMSP） were used to search the active ingredients and drug targets of Qingjin Baofei Decoction. Cytoscape 3.7.2 software was used to construct the component-target gene network and protein-protein interaction （PPI） network. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） metabolic pathway enrichment analysis and Gene Ontology （GO） enrichment analysis were performed using R language. NSCLC line A549 was inoculated under the right axilla to establish a tumor bearing model. The key targets screened by network pharmacology were verified by Western blot. Results The effective rate of observation group was significantly higher than that of control group （P<0.05）， and the adverse reaction rate was significantly lower than that of control group （P<0.05）. The absolute count of CD3⁺T， CD4⁺T cells were significantly increased （P<0.05）， but the absolute count of B cells was significantly decreased （P<0.05）. A total of 35 target genes and 59 active ingredients were screened by network pharmacology analysis. PPI network and topological network analysis showed that mitogen-activated protein kinase （MAPK）， EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance and nuclear factor-κB （NF-κB） may be important targets of Qingjin Baofei Decoction in the treatment of NSCLC. KEGG pathway enrichment analysis showed that the treatment of NSCLC by Qingjin Baofei Decoction was mainly related to tyrosine kinase receptor signaling pathway， interleukin 17， MAPK and other signaling pathways. Animal experimental results confirmed that， after administration， the expression levels of NF-κB and B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） in tumor tissues of mice in Qingjin Baofei Decoction low-dose and high-dose groups decreased （P<0.01）， the expression level of Bcl-2 related X protein increased （P<0.01）， which verified the results of network pharmacology. Conclusion Based on network pharmacology and in vivo experiment in mice， this study preliminarily explores the gene targeting effect and pathway protein of Qingjin Baofei Decoction in the treatment of lung cancer， which lays a theoretical foundation for further verifying the therapeutic mechanism of Qingjin Baofei Decoction for lung cancer.

〔Keywords〕 lung cancer; Qingjin Baofei Decoction; mechanism of action; clinical effect; network pharmacology; signaling pathway; mice

現(xiàn)今，肺癌的發(fā)病率與死亡率一直呈上升態(tài)勢(shì)，是增長(zhǎng)速度最快、威脅人類健康和生命安全的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）兩個(gè)亞型[1]。有資料顯示，約75%的肺癌患者確診時(shí)已處于晚期[2]，且約85%為NSCLC[3]。目前，西醫(yī)治療肺癌仍然以化療為主，會(huì)產(chǎn)生惡心嘔吐、脫發(fā)等不良反應(yīng)，同時(shí)，患者需承受腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移帶來(lái)的焦慮等負(fù)面心理，影響治療效果以及癌癥預(yù)后，故傳統(tǒng)療法越來(lái)越被臨床所采用[4-5]。

清金保肺湯記載于《萬(wàn)氏家抄方》，具有滋陰清熱、宣散肺氣、止咳平喘等作用。本院多用于治療肺炎、肺癌、肺結(jié)核等肺部疾病，療效佳且無(wú)不良反應(yīng)，患者容易接受，但治療機(jī)制尚不明確。針灸療法是中醫(yī)藥特有的一種非藥物治療手段，在呼吸道疾病中的療效較為突出，可以減輕放療、化療對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。針灸治療肺癌的具體機(jī)制包括增加免疫功能、發(fā)揮抗炎作用、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)等方面，針?biāo)幝?lián)合也是目前中醫(yī)臨床治療的常見(jiàn)方法[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可揭示疾病-靶蛋白-藥物之間的緊密聯(lián)系，對(duì)于深入研究多途徑、多靶點(diǎn)、多成分的中藥復(fù)方提供了借鑒和思路，有效解決了中醫(yī)藥復(fù)方研究的困難[7-8]。因此，本文針對(duì)NSCLC，對(duì)比觀察清金保肺湯聯(lián)合針灸輔助治療的臨床效果，同時(shí)借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討清金保肺湯對(duì)肺癌的作用機(jī)制并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為中醫(yī)藥治療肺癌提供新思路，也為清金保肺湯的臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)，同時(shí)有利于針灸療法這一中醫(yī)藥特有的非藥物治療手段的推廣使用。

1 資料與方法

1.1? 臨床分析

1.1.1? 一般資料? 80例研究對(duì)象均為2019年1月至2020年12月于三亞市中醫(yī)院腫瘤科住院的意識(shí)清晰、未經(jīng)過(guò)放化療、無(wú)糖尿病史及免疫系統(tǒng)疾病、生存預(yù)期>6個(gè)月的NSCLC患者，排除妊娠期或哺乳期婦女和患有血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全及精神疾病者。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為對(duì)照組（40例，常規(guī)治療）和觀察組（40例，在對(duì)照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療），兩組患者性別、年齡、體質(zhì)量一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)表1），本實(shí)驗(yàn)通過(guò)三亞市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：ZYYLL201901023）。

1.1.2? 治療方法? （1）對(duì)照組對(duì)癥應(yīng)用常規(guī)化療治療，靜脈滴注順鉑（75 mg/m²）。（2）觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上應(yīng)用清金保肺湯聯(lián)合針灸治療。清金保肺湯組方：麥冬（去心）6 g，桔梗9 g，天冬（去心）9 g，黃芩9 g，荊芥9 g，知母9 g，杏仁6 g，天花粉12 g，玄參12 g，牛蒡子9 g，五味子4 g。文火煎熬40 min，水煎液500 mL，早晚服用，1劑/d。針灸：選取患者壓痛點(diǎn)和天泉穴、風(fēng)門穴、肺俞穴、尺澤穴、膏肓穴、心俞穴、中府穴進(jìn)行針灸，每次留針30 min，1次/d。觀察兩組治療1個(gè)月后的治療效果。

1.1.3? 觀察指標(biāo)? 臨床療效評(píng)定包括治療效果評(píng)估、不良反應(yīng)評(píng)估和免疫功能評(píng)估。（1）治療效果評(píng)估：以隨訪1個(gè)月內(nèi)腫瘤病灶縮小程度作為評(píng)判指標(biāo)。進(jìn)展（progress degree， PD）：腫瘤病灶未縮小或面積擴(kuò)大表示惡化;無(wú)變化（no change， NC）：腫瘤病灶發(fā)生縮小但縮小未超過(guò)50%表示穩(wěn)定;部分緩解（part relief， PR）：腫瘤病灶縮小超過(guò)50%，隨訪1個(gè)月內(nèi)未發(fā)生復(fù)發(fā)情況表示部分緩解;完全緩解（complete relief， CR）：腫瘤病灶完全消失，隨訪1個(gè)月內(nèi)未發(fā)生復(fù)發(fā)情況表示完全緩解。（2）不良反應(yīng)評(píng)估：主要觀察患者惡心、嘔吐、白細(xì)胞降低的發(fā)生情況。（3）免疫功能評(píng)估：選用四色淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒（美國(guó)BD公司），使用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），檢測(cè)外周血中淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+細(xì)胞、自然殺傷（natural killer cell， NK）細(xì)胞、B細(xì)胞百分比及絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用“例（%）”表示，行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1? 正常樣本與肺癌樣本的差異基因篩選? 在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），選定GEO DataSets通過(guò)搜索庫(kù)肺癌相關(guān)的文章，并以“Entry type”下的“Series”“Top Organisms”下的“Homo sapiens”“Study type”下的“Expression profiling by array”為限定條件，以便篩選文章引用文章中的數(shù)據(jù)，下載獲得同一篇文章的相關(guān)文件。利用R語(yǔ)言軟件，以logFCfilter=1且adjPfilter=0.05為篩選條件，最終得到差異基因，并分別取出上調(diào)最顯著的20個(gè)基因和下調(diào)最顯著的20個(gè)基因制作差異熱圖及差異火山圖。

1.2.2? 清金保肺湯中藥相關(guān)基因篩選? 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional chinese medicine systems pharmacology， TCMSP， https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中根據(jù)口服生物利用度（OB>30%）和類藥性（DL>0.18）篩選清金保肺湯組方中各味中藥的活性化合物。

1.2.3? 清金保肺湯有效成分的靶基因和肺癌差異交集基因? 通過(guò)Perl（http：//Strawberryperl.com/）軟件，用清金保肺湯有效成分的靶基因在肺癌的差異基因中進(jìn)行篩選，以便得到有效成分與部分差異基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.2.4? 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建? 借助Cytoscape 3.7.2（the cytoscape consoritum， http：//cytoscape.org）軟件構(gòu)建清金保肺湯與肺癌的“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5? 交集基因的蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactions， PPI）的構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件中的Bisogenet插件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)繪制。結(jié)合Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為選擇節(jié)點(diǎn)度值（degree centrality）大于61，構(gòu)建一個(gè)子網(wǎng)絡(luò);接下來(lái)以介數(shù)中心度（betweenness centrality）大于100為篩選標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建另一個(gè)子網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6? 基因功能富集（GO）及通路富集分析（KEGG）

利用R軟件，選擇生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個(gè)模塊進(jìn)行基因功能富集分析;利用R軟件對(duì)清金保肺湯與肺癌的交集基因做KEGG信號(hào)通路分析，同時(shí)利用Cytoscape 3.7.2將KEGG通路與其相關(guān)基因構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.3? 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1? 實(shí)驗(yàn)材料? C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，7周齡，體質(zhì)量18～22 g，雄性。動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度（23±2） ℃，相對(duì)濕度50%±10%，照明條件為12 h光照/12 h暗循環(huán)，自由攝食飲水，所用小鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

NSCLC細(xì)胞株A549（批號(hào)：C1002，杭州亦博生物科技有限公司）;注射用順鉑（規(guī)格：10 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021356，齊魯制藥有限公司），使用時(shí)用無(wú)菌生理鹽水配制成濃度為0.4 mg·mL-1的順鉑溶液;核因子-κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl2-associated X， Bax）、肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G、增強(qiáng)型RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、廣譜磷酸酶抑制劑混合物（100×）（批號(hào)：BOS113213951、16D16B02、B031132BP51、AA？鄄64132、BST14B25C15I27、14K16B06、025B1050、16L？鄄

21C83，博士德生物工程有限公司）;Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）（批號(hào)：20201125，北京索萊寶科技有限公司）。

GeneGnome成像系統(tǒng)（基因有限公司）;ImageJ軟件（ImageJ2，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）。

清金保肺湯藥液的制備：取清金保肺湯文火煎熬40 min，制成生藥濃度為8、16 mg·mL-1的藥液，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2? 模型的制備、分組與給藥? 取非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化，離心（1200 r/min，10 min，離心半徑8.359 6 cm），制成單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為1×10⁷/mL）。所有小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為正常組10只和造模組40只。造模組小鼠皮下接種單細(xì)胞懸液0.2 mL，正常組小鼠皮下注射無(wú)菌生理鹽水0.2 mL。待皮下結(jié)節(jié)長(zhǎng)徑生長(zhǎng)至8 mm左右，即成功建立非小細(xì)胞肺癌荷瘤模型，本研究中造模組所有小鼠均造模成功[9-10]。

將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、清金保肺湯低劑量組、清金保肺湯高劑量組和順鉑組，各10只。模型組和正常組均腹腔注射無(wú)菌生理鹽水5 mL·kg^-1，灌胃給予蒸餾水5 mL·kg^-1;清金保肺湯低、高劑量組分別腹腔注射無(wú)菌生理鹽水5 mL·kg^-1，灌胃給予8、16 mg·mL^-1清金保肺湯藥液5 mL·kg^-1;順鉑組腹腔注射0.4 mg·mL^-1順鉑溶液5 mL·kg^-1，灌胃給予蒸餾水5 mL·kg^-1。均每天1次，連續(xù)14 d。

1.3.3? 標(biāo)本采集與處理? 末次給藥次日，注射過(guò)量1%戊巴比妥鈉處死小鼠，取出腫瘤組織（正常組取正常組織）稱重，切成3 mm×3 mm左右碎塊，-80 ℃凍存，備用。

1.3.4? Western blot法檢測(cè)小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平[11]? 取“1.3.3”中備用組織，使用T-PER組織蛋白提取試劑提取蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE法分離30 μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜1 h;TBST洗膜后，用NF-κB、Bcl-2、Bax、β-actin一抗工作液室溫震蕩孵育1 h;TBST洗膜后，HRP標(biāo)記山羊抗兔灌胃G二抗室溫孵育1.5 h。GeneGnome成像系統(tǒng)曝光，ImageJ軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以“x±s”表示。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 臨床效果分析

觀察組總有效率達(dá)80%，顯著高于對(duì)照組的52.5%（P<0.05）。同時(shí)，觀察組呈現(xiàn)更少的不良反應(yīng)，發(fā)生率僅為52.5%，顯著低于對(duì)照組的90%（P<0.05）。見(jiàn)表2-3。對(duì)比兩組治療前淋巴細(xì)胞亞群百分比、絕對(duì)計(jì)數(shù)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;治療后與對(duì)照組相比，觀察組CD3⁺T、CD4⁺T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著上升（P<0.05），B細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2? 網(wǎng)絡(luò)藥理分析

經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)處理，共得到正常樣本20組、腫瘤樣本30組，以R語(yǔ)言為平臺(tái)，以logFC=0.01、P=0.05為閾值對(duì)正常樣品和肺癌樣品進(jìn)行差異分析，共得到肺癌疾病差異基因4212個(gè)，其中對(duì)于正常組上調(diào)的差異基因共計(jì)有2315個(gè)，對(duì)于正常組下調(diào)的差異基因總共有1897個(gè)，并將其繪制差異熱圖（圖2A） 和差異火山圖（圖2B）。

通過(guò)TCMSP平臺(tái)，得到128個(gè)活性成分（經(jīng)過(guò)OB>30%，DL>0.18%篩選得到），藥物作用靶點(diǎn)8322個(gè)，經(jīng)OB與DL篩選重復(fù)項(xiàng)后得1845個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。運(yùn)用Perl軟件對(duì)藥物有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行整理，共篩選出35個(gè)靶點(diǎn)基因、59個(gè)有效活性成分。

將藥物有效成分與交集靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，即中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示。藥物分子中槲皮素（quercetin）（Degree=19）、木犀草素（luteolin）（Degree=11）、甲基原薯蕷皂苷元-qt（methylprotodioscin-qt）（Degree=8）、山柰酚（kaempferol）（Degree=6）度值（degree centrality， DC）較大，作用靶點(diǎn)較多，說(shuō)明這幾個(gè)活性成分在肺癌治療過(guò)程中起著主要作用。交集基因中環(huán)加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1， PTGS1）（Degree=40）、檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1， CHEK1）（Degree=14）、毒蕈堿型膽堿能受體1（cholinergic receptor muscarinic 1， CHRM1）（Degree=14）、孕激素受體（progesterone receptor， PGR）（Degree=14）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase3β， GSK3β）（Degree=11）度值較大，說(shuō)明藥物分子主要作用于這些靶點(diǎn)而對(duì)肺癌起到一定的治療效果。

將交集靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，借助Bisogenet插件制作PPI網(wǎng)絡(luò)，得到2484個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖4A），根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣髦担枚戎蹬c介度中心數(shù)（betweenness centrality， BC）計(jì)算進(jìn)行拓?fù)浞治?，并以DC>61為篩選條件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到471個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖4B），以BC>600為篩選條件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得到核心網(wǎng)絡(luò)，其中包含84個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖4C）。

探討清金保肺湯對(duì)肺癌的治療機(jī)制，以P<0.05為條件對(duì)交集靶基因進(jìn)行GO富集分析，共得到314個(gè)生物信息有關(guān)術(shù)語(yǔ)，其中生物過(guò)程相關(guān)術(shù)語(yǔ)274條、細(xì)胞組分相關(guān)術(shù)語(yǔ)9條、分子功能相關(guān)術(shù)語(yǔ)31條。選擇P值較低的點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，其可視化分析所得到得柱狀圖如圖5所示。

將交集靶基因以P<0.05為篩選條件進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到102條KEGG信號(hào)通路，選擇其中P值較小的20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析，主要信號(hào)通路為酪氨酸激酶受體信號(hào)通路（ErbB）、白細(xì)胞介素17信號(hào)通路（IL-17）、焦點(diǎn)粘連（Focal adhesion）、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）、EFGR絡(luò)氨酸激酶抑制劑耐藥等，其可視化分析柱狀圖如圖6A。并篩選出前20條通路用Cytoscape軟件繪制KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖6B）。

2.3? 各組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

與正常組相比，模型組小鼠腫瘤組織NF-κB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01），Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01）。與模型組相比，清金保肺湯低、高劑量組及順鉑組小鼠腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01）;Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。與清金保肺湯低劑量組相比，清金保肺湯高劑量組NF-κB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01）;Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。以上結(jié)果表明，清金保肺湯可調(diào)節(jié)小鼠腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax的表達(dá)水平，對(duì)肺癌起到一定的治療作用。見(jiàn)圖7。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合針灸及現(xiàn)代藥理學(xué)探究臨床效果的同時(shí)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究清金保肺湯對(duì)肺癌的作用機(jī)制，并結(jié)合小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用清金保肺湯對(duì)非小細(xì)胞肺癌荷瘤模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療肺癌提供一定的思路與方向。TCMSP平臺(tái)篩選出槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分對(duì)于肺癌治療有較強(qiáng)的靶向作用。槲皮素能降低MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549凋亡[12-13]。木犀草素可促使A549肺癌細(xì)胞凋亡、阻礙A549肺癌細(xì)胞的侵襲[14]。山柰酚能夠阻礙雌激素相關(guān)受體α（ERRα）效應(yīng)的發(fā)揮而降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移能力[15]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及拓?fù)浞治龅玫角褰鸨７螠委煼伟┑年P(guān)鍵靶點(diǎn)。P53腫瘤抑制因子（tumor protein 53， TP53）基因可以抑制細(xì)胞增殖、誘發(fā)細(xì)胞凋亡而起到抗腫瘤的作用[16-17]。鼠雙微體2（murine double minute 2， MDM2）是TP53腫瘤抑制蛋白的一個(gè)靶基因，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致TP53因子徹底失活而引起癌變[18]。

GO富集分析得到清金保肺湯治療肺癌的相關(guān)靶點(diǎn)功能，主要包括機(jī)械刺激反應(yīng)、生長(zhǎng)因子結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，清金保肺湯作用于肺癌的通路主要為ErbB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述通路涉及免疫調(diào)節(jié)、腫瘤與炎癥等方面。ErbB通路靶點(diǎn)最多，表明清金保肺湯最有可能通過(guò)該通路發(fā)揮作用。MAPK通路的異?；罨c腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，因此可作為抗肺癌靶點(diǎn)[19]。

NF-κB可抑制細(xì)胞凋亡，在人類肺癌組織和細(xì)胞中，其異常激活且不受控制，被認(rèn)為是治療非小細(xì)胞肺癌的新靶點(diǎn)[20]。其中Bax為促凋亡因子，Bcl-2為抗凋亡因子，二者相互拮抗，在腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用[21]。NF-κB可通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株右腋下接種建立非小細(xì)胞肺癌荷瘤模型，對(duì)小鼠腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)清金保肺湯可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這一結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理研究相佐證，為肺癌的中醫(yī)藥治療提供了參考。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將針灸療法應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的輔助治療，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究清金保肺湯對(duì)肺癌的作用機(jī)制，并結(jié)合小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果，為肺癌的臨床治療提供了新思路。

4 結(jié)論

清金保肺湯聯(lián)合針灸組療效明顯高于對(duì)照組，清金保肺湯治療肺癌的有效成分很有可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分，這些成分通過(guò)ErbB、IL-17等通路作用于TP53、MDM2、EFGR、MAPK1、MAPK8等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控蛋白激酶活性與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于機(jī)械刺激的反應(yīng)等，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)肺癌組織細(xì)胞凋亡等作用，從而對(duì)肺癌起到一定的治療作用。

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