基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析丹參山楂組分配伍抗動脈粥樣硬化的作用機制研究

張建永 王嵐 梁日欣 楊濱

[摘要]該文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測及體外細胞驗證的方法，對丹參山楂有效組分配伍（SC121）抗動脈粥樣硬化（AS）的作用機制進行了探討。根據(jù)SC121所含成分的結(jié)構(gòu)類型及藥效活性報道，選取丹酚酸B、丹參酮ⅡA、丹參素、表兒茶素及原花青素B2作為SC121的主要活性成分，用于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析。運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選上述5個主要成分作用于心血管疾病的網(wǎng)絡(luò)靶點；結(jié)合KEGG和Uniprot數(shù)據(jù)庫，進行信號通路和生物途徑分析，預(yù)測其作用機制。 在網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測的基礎(chǔ)上，建立體外細胞模型，觀察SC121對oxLDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （HUVEC）和巨噬細胞RAW2647損傷及泡沫化的保護作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，SC121可通過作用同一靶點或不同靶點發(fā)揮抗AS作用， 其作用機制與調(diào)節(jié)PPAR，reninangiotensin system等多通路，參與炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細胞保護及脂質(zhì)生物合成和代謝等多生物途徑有關(guān)。細胞實驗結(jié)果表明，SC121可減輕oxLDL對HUVEC和RAW2647的損傷程度， 降低RAW2647細胞內(nèi)活性氧水平，減少泡沫細胞面積，并呈一定的量效關(guān)系。即在體外細胞模型上，SC121可抑制內(nèi)皮細胞損傷、抗氧化等，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學的預(yù)測結(jié)果，綜合闡釋了SC121抗AS的作用機制。

[關(guān)鍵詞]丹參山楂有效組分配伍； 動脈粥樣硬化； 網(wǎng)絡(luò)藥理學； HUVEC； RAW2647； 泡沫細胞

Explore antiatherosclerotic mechanism of component compatibility of

Danshen and Shanzha based on network pharmacology and cell level

ZHANG Jianyong1， 2， WANG Lan1， LIANG Rixin1*， YANG Bin1*

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2 Pharmacy School， Zunyi Medical university， Zunyi 563009， China）

[Abstract]To explore the antiatherosclerotic mechanism of active component compatibility of Danshen and Shanzha （SC121） based on network pharmacology and in vitro research validation with cell model On one hand， according to the chemical structures and pharmacological activities of the compounds reported in Danshen and Shanzha， 5 compounds， ie， salvianolic acid B， tanshinone ⅡA， tanshinol， epicatechin and procyanidin B2 were chosen and used for network pharmacology analysis Then the TCMSP（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp）was used for finding the network targets for 5 compounds from SC121 The signaling pathway associated with cardiovascular disease was analyzed by KEGG mapping， the biological process associated with cardiovascular disease was analyzed by Uniprot And， the mechanism of SC121 was predicted by network pharmacology In vitro cell model was subsequently performed for validation HUVEC and RAW2647 cell injuries and foam cell formation were constructed by oxLDL， and the intervention effects of SC121 were assayed The result showed that SC121 not only alleviated the damage of HUVEC and RAW2647， lowered the ROS level， but also decreased the area of foam cell in a dosedependent manner， which indicated that SC121 could inhibit the damage of endothelial cells and lower the oxidative stress The experimental data validated the prediction of network pharmacology， and elucidated the mechanism of SC121′s effect on AS

[Key words]active component compatibility of Danshen and Shanzha； atherosclerosis； network pharmacology； HUVEC； RAW2647； foam cells

doi：10.4268/cjcmm20162319

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)， 是一個復(fù)雜的進展性的病變過程，其發(fā)展過程包括了血管內(nèi)皮細胞功能障礙、巨噬細胞激活和平滑肌增殖和遷移等因素參與[1]。研究表明，在AS發(fā)生的早期階段，在各種致病因素的誘發(fā)下，血管內(nèi)皮細胞會釋放一系列黏附因子和趨化因子，促使血循環(huán)中的單核細胞黏附到血管壁，發(fā)生細胞黏附，遷移至血管內(nèi)膜，分化成巨噬細胞，進而形成AS樣脂肪紋[2]。另一方面，巨噬細胞的激活也在AS發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，巨噬細胞被激活后，其引發(fā)的細胞毒和炎性反應(yīng)將被擴大，產(chǎn)生大量的自由基和炎性因子[3]。因此，干預(yù)早期AS樣變化的血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞對于抑制AS發(fā)展具有一定意義。

丹參山楂有效組分配伍（SC121）是課題組在前期工作的基礎(chǔ)上設(shè)計的組分中藥方，由丹參水溶性提取物（DSA）、丹參脂溶性提取物（DSF）、山楂水溶性提取物（SZA）組成。整體動物實驗結(jié)果表明，SC121可減緩AS大鼠的病變過程，其作用機制可能與降低AS大鼠的血脂水平，增強機體抗氧化，保護內(nèi)皮細胞及抗炎作用等有關(guān)[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學是從系統(tǒng)水平研究藥物作用規(guī)律和機制的一種有效手段，已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病復(fù)方藥物的研究，為中藥復(fù)雜作用機制研究提供了新的思路[5]。眾多的研究結(jié)果表明，oxLDL是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的主要因素，可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏附因子，導(dǎo)致白細胞聚集，加速AS的發(fā)展[6]。同時oxLDL可被巨噬細胞識別后吞噬，加重巨噬細胞的負擔，形成泡沫細胞，是AS早期的典型病理變化[7]。因此，本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，分析丹參山楂組分配伍的作用機制，在此基礎(chǔ)上采用oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）和RAW2647損傷模型進行驗證，旨在明確SC121抗 AS 的作用機制，為SC121的深入開發(fā)研究提供線索。

1材料

小鼠RAW2647巨噬細胞系（中國醫(yī)學科學院細胞庫）；HUVEC（中國中醫(yī)科學院中藥研究所崔紅玉惠贈）；SC121[4]（取丹參水溶性提取物84 mg、丹參脂溶性提取物25 mg、山楂水溶性提取物128 mg， 混勻即得，自制）；Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基（批號NWK0484，美國Thermo公司）；胎牛血清（批號121005，美國Gibco公司）；谷氨酰胺（Sigma公司，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心分裝）；025%胰酶（批號1155732，美國Gibco公司）；DMSO （ACS級，美國Amereso公司）；MTT（Sigma 公司，北京科海榮京生物技術(shù)科技發(fā)展有限公司分裝）；oxLDL（批號20121007，質(zhì)量濃度1 g·L-1，北京協(xié)生生物技術(shù)有限公司）；H2O2（批號LE60M12，北京J&K Scientific公司）；油紅O（Sigma公司，北京科海榮京生物技術(shù)科技發(fā)展有限公司分裝）；DCFHDA ROS試劑盒（批號20120920，南京建成生物工程研究所）。

Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；SWCF2FD雙人單面超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；MCO15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；H2SH型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；LDZ408型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

2方法

21網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

211成分的選擇SC121由丹參水溶性提取物、丹參脂溶性提取物和山楂水溶性提取物組成。以丹酚酸B為代表的丹酚酸類成分和以丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分分別是丹參水溶性和脂溶性提取物的主要化學成分及藥效成分[8]；表兒茶素和原花青素B2是山楂水溶性提取物的主要化學成分及藥效成分[910]；另外，丹酚酸類成分易水解生成丹參素。故在本研究中，將丹酚酸B、丹參酮ⅡA、丹參素、表兒茶素及原花青素B2作為SC121的主要活性成分，用于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析。

212網(wǎng)絡(luò)靶點分析將上述5個成分代入TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp#），TCMSP是一個全面的中藥成分系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫，用于查詢作用靶點等信息[11]。在TCMSP中獲取作用靶點，剔除非人源靶點，采用PharmGKb（https：//wwwpharmgkborg/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（http：//www.drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫對網(wǎng)絡(luò)靶標進行確認，獲得SC121抗AS的網(wǎng)絡(luò)靶點群。采用cytoscape 321構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)，分析SC121的作用特點。

213網(wǎng)絡(luò)作用機制分析將上述確定的靶點帶入KEGG（http：//wwwkeggjp/）進行通路分析，尋找與心血管疾病相關(guān)的通路，通過查閱文獻進一步求證，構(gòu)建靶點作用通路網(wǎng)絡(luò)，同時整合Uniprot （http：//wwwuniprotorg/）中網(wǎng)絡(luò)靶點參與的生物途徑，構(gòu)建靶點生物途徑網(wǎng)絡(luò)，進而綜合分析SC121中5種主要成分抗AS的作用機制。

22細胞培養(yǎng)

221HUVEC細胞培養(yǎng)復(fù)蘇HUVEC，接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入20% FBS DEMEM培養(yǎng)基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日換液，2～3 d待細胞長至融合后，以025%胰酶EDTA消化傳代，常規(guī)凍存，3～8代細胞用于實驗研究。

222RAW2647細胞培養(yǎng)RAW2647細胞以10% FBS DEMEM高糖培養(yǎng)基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液，保持細胞密度不大于70%。實驗前用倒置顯微鏡觀察，狀態(tài)良好的細胞用于實驗，如細胞出現(xiàn)多足，則不能用于實驗。

23SC121最大無毒濃度的篩選

231對HUVEC細胞的最大無毒濃度取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，胰酶消化后以5 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用 24 h后，MTT檢測細胞存活率，以未給藥組（control，ctrl）的存活率為100%，計算給藥組的存活率。

232對RAW2647細胞的最大無毒濃度取對數(shù)生長期RAW2647細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板中，待細胞生長至70%左右，換為無血清培養(yǎng)12 h后，分別給予500，250，120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用24 h后，MTT檢測細胞存活率，以ctrl組為對照，比較不同濃度給藥后細胞的存活率。

24SC121對oxLDL誘導(dǎo)細胞損傷的影響

241SC121對不同濃度oxLDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響oxLDL造模濃度參考文獻報道方法[3]，取生長狀態(tài)良好的HUVEC細胞，胰酶EDTA消化，以5 000個/孔接種于96孔板中，實驗分為6組（每組5個復(fù)孔）：空白對照組（ctrl組， 給予空白培養(yǎng)液）、oxLDL組（分別加入200，150 mg·L-1的oxLDL）、SC121組（質(zhì)量濃度分別為60，30，15，75 mg·L-1），其中SC121組預(yù)先給藥24 h，ctrl和oxLDL組在同等條件下給予等量的完全培養(yǎng)基。吸棄上清，分別加入終濃度為 200，150 mg·L-1的oxLDL，同時ctrl組給予等量的完全培養(yǎng)基，24 h后檢測不同給藥濃度的存活率。

242SC121對oxLDL誘導(dǎo)的RAW2647損傷的影響取對數(shù)生長期的RAW2647細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板中，待細胞生長至70%左右，換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，分別給予60，30，15，75 mg·L-1的SC121作用12 h，同時設(shè)ctrl組和oxLDL組，給予等量的培養(yǎng)液；12 h后棄上清，oxLDL組和各給藥組給予 200 mg·L-1 oxLDL，ctrl組給予等量的培養(yǎng)液，作用12 h后棄上清，MTT檢測細胞存活率。

25SC121對oxLDL誘導(dǎo)RAW2647細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影響

取對數(shù)生長期的RAW2647細胞，以4×105個/mL的密度鋪至6孔板中，37 ℃過夜孵育24 h，更換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液饑餓12 h，無菌PBS洗滌2遍，每孔加入工作濃度5 μmol·L-1的DCFHDA（將10 mmol·L-1 DCFHDA以1∶1 000稀釋即得）1 mL，37 ℃孵育30 min，吸棄上清，PBS洗滌細胞2次，除去未進入細胞內(nèi)的DCFHDA，分別加入60，30，15，75 mg·L-1SC121溶液預(yù)孵育6 h，吸棄上清，加入200 mg·L-1的oxLDL溶液孵育30 min后，測定相對熒光強度，計算ROS的含量。

26SC121對oxLDL誘導(dǎo)RAW2647泡沫細胞的影響

取對數(shù)生長期RAW2647細胞，接種于預(yù)先放入蓋玻片的24孔板中，待細胞長至70%，換為無血清的培養(yǎng)基饑餓12 h，去掉培養(yǎng)基，分為6組（n=4），oxLDL組、ctrl組和4個給藥組。4個給藥組中分別加入無血清配制的60，30，15，75 mg·L-1的SC121溶液預(yù)作用6 h，再加入50 mg·L-1的oxLDL溶液誘導(dǎo)18 h。同時設(shè)ctrl組（未加oxLDL及藥干預(yù)）給予無血清培養(yǎng)液，oxLDL組加50 mg·L-1oxLDL。收集細胞培養(yǎng)上清，備用。油紅O染色觀察巨噬細胞的脂質(zhì)積累。在光學顯微鏡下拍照，采用Image ProPlus 60 軟件計算泡沫細胞面積。

27統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS 130軟件，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用Ttest，以P<005被認為有顯著性差異，P<001被認為有極顯著性差異。

3結(jié)果

31網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測SC121的作用機制

311成分靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析SC121中5個主要成分的靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1，采用cytoscape自帶分析工具network analyzer 分析，結(jié)果表明，5個成分共作用于41個與心血管疾病相關(guān)的靶點，平均每個成分118個網(wǎng)絡(luò)靶標，其中28個獨立網(wǎng)絡(luò)靶點（僅與1個成分連接），13個網(wǎng)絡(luò)靶點（與2～3個成分連接），即SC121具有作用于同一靶點及不同靶點的綜合協(xié)同作用方式。

312靶點通路及靶點生物途徑網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及作用機制分析將靶點代入KEGG數(shù)據(jù)庫映射后，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)靶點信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，發(fā)現(xiàn)SC121

作用的靶點中32個可映射到與心血管相關(guān)通路29個，如與心血管疾病密切相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor， PPAR）信號通路（PPAR siginaling pathway），花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism），腎素血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system）等，從網(wǎng)絡(luò)角度揭示了SC121抗AS的作用通路。

為了全面反映不同網(wǎng)絡(luò)靶點的作用，將41個網(wǎng)絡(luò)靶點代入Uniprot后，構(gòu)建靶點生物途徑網(wǎng)絡(luò)，見圖3，提取到與心血管疾病密切相關(guān)的生物途徑共8個，其中與靶點連接度高的有炎癥反應(yīng)（inflammatory reaction）、內(nèi)皮細胞保護（endothelial cell protection）、脂質(zhì)生物合成和代謝（lipid biosynthesis and metabolism）、巨噬細胞分化及泡沫化（macrophage derived foam cell differentiation）等，從網(wǎng)絡(luò)角度揭示了SC121抗AS的多靶點、多途徑的作用機制。

32SC121對HUVEC和RAW2647的最大無毒濃度篩選

MTT結(jié)果見圖4，當SC121質(zhì)量濃度達到120 mg·L-1時，抑制了HUVEC的生長（P<005），故選擇SC121的最大無毒濃度為60 mg·L-1。類似地，質(zhì)量濃度為500，250，120 mg·L-1的SC121溶液作用于RAW2647后，細胞的存活率較ctrl組顯著降低（P<005）；當SC121質(zhì)量濃度為60，30，15，75 mg·L-1時，可顯著升高細胞的存活率（P<005），因此選擇SC121的最大無毒濃度為60 mg·L-1，見圖5。

33SC121對不同濃度oxLDL損傷HUVEC的保護作用

與ctrl組比較，150 mg·L-1 oxLDL可顯著降低HUVEC的存活率（P<001）；預(yù)孵育24 h后，低濃度SC121 （75，15 mg·L-1） 對HUVEC存活率無明顯影響；高濃度SC121 （30，60 mg·L-1） 可升高HUVEC的存活率（P<005），見圖6。

36SC121對oxLDL誘導(dǎo)RAW2647泡沫細胞的干預(yù)作用

50 mg·L-1oxLDL作用18 h后，巨噬細胞內(nèi)被染上較強的紅色脂質(zhì)，巨噬細胞開始變形，體積變大；SC121預(yù)干預(yù)6 h的巨噬細胞中脂質(zhì)沉積顯著降低，并呈明顯的量效關(guān)系，見圖9。采用Image ProPlus 60軟件計算泡沫細胞面積，oxLDL作用18 h后，oxLDL組的泡沫細胞面積顯著增加（P<001），不同濃度SC121干預(yù)后，泡沫細胞面積顯著減小（P<001），并呈一定的量效關(guān)系，其中，60 mg·L-1SC121效果最顯著，見圖10。

4討論

丹參山楂是治療心血管疾病的經(jīng)典藥對，臨床也多用其治療心血管疾病，課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，二者配伍的水合煎劑可干預(yù)大鼠AS的形成，同時可降低血脂水平，提升抗氧化能力，保護內(nèi)皮細胞[12]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，丹參中水溶性組分、脂溶性組分和山楂水溶性組分是其抗AS的主要成分[9]，正交設(shè)計發(fā)現(xiàn)3種組分不同比例配伍均具有抗AS作用，且不同配伍的作用優(yōu)勢不同，體現(xiàn)了中藥作用的多途徑特點，同時發(fā)現(xiàn)SC121是抗AS的較優(yōu)配伍[4]，但其在細胞水平上的作用尚不清楚。

本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討了SC121中主要成分的作用機制，發(fā)現(xiàn)丹酚酸B等5種成分可通過共享靶點和獨立靶點發(fā)揮抗AS作用，涉及到脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮細胞保護、炎性反應(yīng)等生物途徑及通路，部分功能已被實驗驗證，如丹酚酸B可減輕H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性[13]；原花青素B2可抑制脂多糖誘導(dǎo)的人巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，同時具有較強抑制環(huán)氧合酶2活性的作用[14]。綜上可知， SC121可通過多靶點、多信號通路及多生物途徑的方式協(xié)同抗AS。

在上述基礎(chǔ)上，本研究采用HUVEC和RAW2647細胞模型驗證SC121的作用機制。本研究采用200 mg·L-1oxLDL誘導(dǎo)HUVEC損傷和RAW2647損傷，給藥后發(fā)現(xiàn)SC121可劑量依賴性地保護oxLDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷和RAW2647巨噬細胞損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)SC121可抑制損傷細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，推測其保護巨噬細胞和抑制泡沫細胞形成的作用可能與抗氧化活性相關(guān)。為了進一步探索其機制，本實驗觀察了SC121對RAW2647泡沫細胞的影響，在研究中首先分別以200，150，100，50 mg·L-1 oxLDL來建立RAW2647泡沫細胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以200～100 mg·L-1的oxLDL建模，模型細胞損傷較大，死亡較多，且損傷后出現(xiàn)脂質(zhì)泄露的現(xiàn)象，不利于觀察藥效，因此本研究采用50 mg·L-1oxLDL建立RAW2647泡沫細胞模型，RAW2647泡沫細胞可吞噬oxLDL，同時無泄漏發(fā)生，與文獻報道的濃度相似[15]。結(jié)果表明，不同濃度SC121均可抑制RAW2647的泡沫細胞面積，且呈一定的量效關(guān)系，提示抑制泡沫細胞形成是SC121抗AS的機制之一。 綜上，在體外細胞模型上，SC121可抑制內(nèi)皮細胞損傷、抗炎及泡沫細胞的形成等，在細胞水平上驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學的預(yù)測結(jié)果，對于下一步從蛋白分子水平上揭示SC121的抗AS作用機制具有重要意義。

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[責任編輯馬超一]