一測多評法測定山荷降脂粉中4種成分的含量

張嬌 蔣倩倩 余婷婷 魏屹

[摘要] 目的 建立一測多評法測定山荷降脂粉中4種成分的含量的測定方法，并驗證該方法的準確性和可行性。方法 采用高效液相色譜法測定山荷降脂粉中4種成分的含量，色譜柱：KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，流速：0.8 mL/min，柱溫：25℃，芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的檢測波長分別為330、354、375、363 nm，進樣量10 μL。以槲皮素為內(nèi)標物，建立槲皮素與芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的相對校正因子，并計算4種成分的含量，實現(xiàn)一測多評;同時采用外標法測定該4種成分的含量，比較計算值與實測值的差異，以驗證一測多評法的準確性和可行性。 結(jié)果 芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的平均回收率分別為1.21%、1.08%、0.94%、1.33%，槲皮素與芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的平均相對校正因子分別為1.23%、0.53%、1.41%，3批山荷降脂粉中4種成分的計算值與實測值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 一測多評法測定山荷降脂粉中4種成分準確可行，對山荷降脂粉質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞] 一測多評法;山荷降脂粉;相對校正因子;含量測定

[中圖分類號] R283.6;R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0117-05

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of four constituents in Shanhe Jiangzhi Powder by quantitative analysis of multi-components by single marker， and to verify the accuracy and feasibility of the method. Methods The contents of four components in Shanhe Jiangzhi powder were determined by high performance liquid chromatography. The chromatographic column was KromstarTM C18 （4.6 mm x 250 mm， 5 μm）， mobile phase was acetonitrile （A） - 0.4% phosphoric acid aqueous solution （B）， gradient elution， flow rate was 0.8 mL/min， column temperature was 25 ℃， the detection wavelength of sinapine thiocyanate， hyperoside， quercetin and kaempferol were 330， 354， 375， 363 nm， respectively， and the injection volume was 10 μL. With quercetin as the internal standard， the relative positive factors of quercetin and sinapine thiocyanate， Hyperoside and kaempferol were established， and the contents of four components were calculated to achieve multi-evaluation. At the same time， the contents of the four components were determined by external standard method， and the differences between calculated values and measured values were compared to verify the accuracy and feasibility of the method of quantitative analysis of multi-components by single marker. Results The average recoveries of sinapine thiocyanate， hyperoside， quercetin and kaempferol were 1.21%， 1.08%， 0.94% and 1.33%， respectively. The relative positive factors of quercetin and sinapine thiocyanate， hyperoside， kaempferol were 1.23%， 0.53% and 1.41%， respectively. There was no significant difference between the calculated and measured values of the four components in three batches of Shanhe lipid-lowering powder （P > 0.05）. Conclusion It is accurate and feasible to determine the four components in Shanhe Jiangzhi Powder by quantitative analysis of multi-components by single marker， which has guiding significance for the quality control of Shanhe Jiangzhi Powder.

[Key words] Quantitative analysis of multi-components by single marker; Shanhe Jiangzhi Powder; Relative correction factors; Content determination

中藥類保健性食品是以中藥標準控制的中藥為主要原料，依據(jù)中醫(yī)藥理論組成配方，并經(jīng)過安全性和功能性評價的保健食品[1]。自古以來，我國就有“藥補不如食補”的經(jīng)驗之談[2]。山荷降脂粉是山楂、荷葉、萊菔子、昆布等藥食兩用中藥為主要原料，均為實驗室采用正交試驗設(shè)計法，優(yōu)選出經(jīng)濟、可行的提取工藝，按照一定比例復(fù)配自主制備的中藥保健食品[3]?，F(xiàn)代研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油等成分具有降血壓、降血脂等多方面的藥理活性。山楂[6-7]、荷葉[8]、萊菔子[9]中均含有黃酮類成分，山楂中三萜類[10-11]和甾體類[12]等化學(xué)成分及荷葉中的生物堿均具有降血脂功能[13]。同時，萊菔子中含生物堿成分[14]，其水溶性生物堿提高了高密度脂蛋白膽固醇的含量，從而起到降血脂作用[15]。

一測多評法（QAMS）[16-18]是中藥主要成分進行定量分析的一種方法，被認為是中藥質(zhì)量控制的有效方法[19]。QAMS法解決了多指標的質(zhì)量控制模式需要對照品的種類和數(shù)量均比較大，且部分對照品價格較貴的問題[20]。目前，生姜、黃連、丹參等中藥材的QAMS法已被2015年版《中華人民共和國藥典》收載[21]。本研究以槲皮素為內(nèi)標物，建立槲皮素與芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的QAMS，并進行含量計算，為探索各成分在降血脂中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀配Waters 2998二極管陣列檢測器、色譜柱：KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、AUY 220型電子分析天平（萬分之一）、KQ-250 DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試藥

芥子堿硫氰酸鹽（批號：151218）、金絲桃苷（批號：160904）、山奈酚（批號：170224）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度>98%;槲皮素（批號：wkq 16063005）購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度>98%。其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B）溶液，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫25℃，芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚檢測波長分別為330、354、375、363 nm，進樣量10 μL。洗脫梯度：0～25 min，18%A;25～30 min，18%→35%A;30～50 min，35%A。對照品混合溶液及山荷降脂粉供試品溶液色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密取芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚適量，加甲醇溶液溶解定容，即得各對照品溶液儲備液，分別精密量取芥子堿硫氰酸鹽儲備液1.4 mL（0.32 g/L）、金絲桃苷儲備液0.5 mL（0.32 g/L）、槲皮素儲備液1.0 mL（0.33 g/L）、山奈酚儲備液0.1 mL（0.30 g/L）置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，即得混合對照品溶液，于4℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

山荷降脂粉由本實驗室經(jīng)過生產(chǎn)工藝優(yōu)化后按照一定比例自主制備。精密稱取實山荷降脂粉1.0 g，置錐形瓶中，加甲醇-25%鹽酸（4∶1）50 mL，超聲處理30 min，取濾液用0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 標準曲線繪制

分別精密進樣“2.2”項下混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的回歸方程。見表1。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL按照“2.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.99%、0.34%、0.32%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h按照“2.1”色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.06%、1.05%、0.87%、1.08%，表明山荷降脂粉供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取山荷降脂粉1.0023、1.0026、1.0032、1.0030、1.0039、1.0029 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，進樣量10 μL，按照“2.1”色譜條件測定芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的平均含量分別為2.9173、0.7982、1.9870、0.1801 mg/g，RSD分別為0.86%、0.95%、1.17%、1.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的山荷降脂粉共6份，分別置于6個錐形瓶中，分別加入芥子堿硫氰酸鹽對照品儲備液4.50 mL，金絲桃苷對照品儲備液1.25 mL，槲皮素對照品儲備液3 mL，山奈酚對照品儲備液0.30 mL。按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”色譜條件進行測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.9 各成分與內(nèi)標物間相對校正因子的確定

取“2.2正項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、18、20 μL按照“照 合”色譜條件進樣，記錄色譜圖。以槲皮素為內(nèi)標物，按公式fsi=fs/fi=As×Ai/Ai×As（其中As為內(nèi)標物對照品s峰面積;ms為內(nèi)標物對照品s質(zhì)量;Ai為某待測成分對照品i面積;mi為某待測成分對照品i質(zhì)量）計算槲皮素對芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的相對校正因子。結(jié)果見表3。

2.10 相對校正因子耐用性考察

2.10.1柱溫變化對各成分相對校正因子的影響? 取“2.2”項下混合對照品溶液，分別在柱溫（25±5）℃條件下分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL分析，計算芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的相對校正因子值分別為1.5174、1.6284、0.8870，其RSD值均小于2%，溫度變化對相對校正因子影響不大。

2.10.2 流速變化對各成分相對校正因子的影響? 取“2.2” 項下混合對照品溶液，分別在流速（0.8±0.2）mL/min條件下，分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL分析，計算芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的相對校正因子值分別為1.548 9、1.635 9、0.890 2，其RSD值均小于2%，流速變化對相對校正因子影響不大。

2.10.3 色譜柱對各成分相對校正因子的影響? 選取實驗室Waters C18、Kromasil C18、Phenomenex C18不同色譜柱。取“2.2譜項下混合對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL分析，計算芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、山奈酚的相對校正因子值，其RSD值均小于2%，表明3種成分的相對校正因子在色譜柱上都有較好的重現(xiàn)性。

2.11 QAMS法與外標法測定結(jié)果的比較

精密秤定實驗室自制山荷降脂粉3批各1.0 g，按“2.3”制備供試品溶液，按照“2.1”色譜條件進樣10 μL，測定峰面積。分別采用外標法和QAMS法計算山荷降脂粉中芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，結(jié)果見表4。外標法實測含量值與QAMS計算含量值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)果表明，QAMS法用于山荷降脂粉中4種成分的質(zhì)量評價是可靠的。

3 討論

3.1 供試品制備溶液的優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑的選擇? 本研究分別考察了不同提取溶劑制備供試品溶液，比較了甲醇、甲醇-25%鹽酸（4∶1）、甲醇-50%鹽酸（4∶1）三種提取溶劑的提取效果，其中甲醇提取的樣品中槲皮素含量較低。上述提取方法得到的大部分是黃酮苷類化合物。槲皮素糖苷是槲皮素和糖通過縮合反應(yīng)形成的糖苷化合物，其中的糖苷鍵在堿性條件下穩(wěn)定，酸性條件下易發(fā)生水解，故甲醇提取的樣品中槲皮素含量較低[22]。黃酮苷類化合物在酸性提取條件下水解，甲醇-25%鹽酸（4∶1）條件下提取，黃酮類成分的提取率均有所升高。為進一步提高黃酮類成分含量，可通過增加酸的濃度來實現(xiàn)。甲醇-50%鹽酸（4∶1）條件下進行提取，其黃酮類成分含量雖有提高，但芥子堿硫氰酸鹽含量降低。綜合考慮，選用甲醇-25%鹽酸（4∶1）為提取溶劑。此條件下，目標成分的含量較高且干擾雜質(zhì)峰較少。

3.1.2 提取方法的選擇? 本研究比較超聲提取和加熱回流兩種提取方法。結(jié)果顯示，兩種提取方式所得到的各成分含量都比較接近，但考慮到超聲法簡單、易操作，故選取超聲法作為供試品溶液制備的提取方法。

3.2 流動相溶劑的選擇

本研究考察了乙腈-0.4%甲酸、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液流動相的對待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，乙腈-0.4%甲酸、乙腈-0.4%磷酸流動相酸對待測物質(zhì)分離度、出峰時間等基本無影響，均可實現(xiàn)待測物質(zhì)的有效分離，但乙腈-0.4%磷酸條件下，理論塔板數(shù)稍高。因待測物質(zhì)芥子堿硫氰酸鹽多在堿性條件下分離，考察了乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液對實驗結(jié)果的影響，乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液條件下，芥子堿硫氰酸鹽分離度較好，峰形得到改善，但是其黃酮類成分峰形變差，說明堿性條件下，不適于黃酮類成分的分離。綜合以上考慮選擇乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相，且柱后處理簡便。

綜上所述，本研究采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚最佳檢測波長分別為330、354、375、363 nm。槲皮素在330～375 nm均有紫外吸收，且考慮到槲皮素對照品價廉易得、性質(zhì)穩(wěn)定，故選擇槲皮素作為內(nèi)標物進行色譜峰定位，實現(xiàn)對其他成分的同時測定。本研究將QAMS法用于山荷降脂粉中4個成分的含量測定，與外標法實際所測值接近，無明顯差異，說明QAMS法可用于藥材多指標成分的測定，這對控制山荷降脂粉質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2018-06-01? 本文編輯：王? ?蕾）