雞骨草葉總生物堿的含量測(cè)定及其體外抗氧化活性研究

劉燕等

[摘要] 目的 通過對(duì)雞骨草葉總生物堿的體外抗氧化活性研究，為充分利用雞骨草資源提供理論依據(jù)。 方法 料液比為（g∶mL）1∶9，超聲輔助功率60 W，提取時(shí)間30 min，提取2次，提取溫度70℃，提取劑為70%乙醇。通過紫外-可見分光光度法測(cè)定雞骨草葉中總生物堿的含量及其提取物清除自由基活性的能力。 結(jié)果 雞骨草葉提取物中總生物堿含量為1.89 mg/g；其提取物具有一定還原Fe3+的能力；對(duì)DPPH自由基活性具有較好的清除能力，樣品體積為400 μL時(shí)，其清除率是90%；樣品體積為100 μL時(shí)，清除率為85.53%。 結(jié)論 雞骨草葉總生物堿有較好的抗氧化活性，其總生物堿具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性隨著體積的增大而增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 雞骨草葉；總生物堿；含量測(cè)定；抗氧化活性

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（a）-0025-04

Determination and antioxidant activities of total alkaloids from the leaves of Abrus Cantoniensis Hance

LIU Yan1 LIU Yan1 MA Yuying1 CHENG Shijia1 LI Yuan1 LIANG Qingqing1 HUANG Suoyi2.3 YU Qiaorong3，4

1.College of Clinical Medicine， Youjiang Medical University for Nationalities， the Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise 533000， China； 2.College of Pharmacy， Youjiang Medical University for Nationalities， the Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise 533000， China； 3.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley， the Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise 533000， China； 4.College of Pharmacy， Guangxi University of traditional Chinese Medicine， the Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise 530299， China

[Abstract] Objective To study on the antioxidant ability of total alkaloids from the leaves of Abrus Cantoniensis Hance， to provide a theoretical basis for full use of the Abrus Cantoniensis Hance resources. Methods Solid-liquid ratio （g∶mL） 1∶9， ultrasound-assisted power 60 W， extraction time 30 min and extraction 2 times， extraction temperature 70℃， extraction solvent 70% ethanol， determining the total alkaloids content of the leaves of Abrus Cantoniensis Hance and ability to clear free radicalsthg by UV visible spectrophotometric. Results Abrus Cantoniensis Hance extract contained higher total alkaloids （1.89 mg/g）， extract had stronger ability to scavenge free radicals. The clear rate was 90% when the sample volumn was 400 μL， and 85.53% when 100 μL. Conclusion The total alkaloids of Abrus Cantoniensis Hance has a good antioxidant activity， and antioxidant activity becomes enhanced with increasing volume.

[Key words] Abrus cantoniensis Hance Leaves； Total alkaloids； Determination； Antioxidant activity

雞骨草（Hance）是一種流行的中國蔬菜食用的飲料、湯或民間醫(yī)藥。它是豆科相思子屬植物廣州相思子（Abrus Cantoniensis Hance）的干燥全草，是一種常用中藥材，其性涼，味甘淡[1]，具有清熱解毒，疏肝止痛之療效，雞骨草還可在春夏季節(jié)用來煲湯作為食療，是臨床常用中藥，廣泛用于治療黃疸，脅肋不舒，胃脘脹痛，急、慢性肝炎及肝硬化腹水等疾病[2-3]。具有對(duì)肝臟的保護(hù)作用，抗菌和抗病毒作用，抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，降脂作用，對(duì)羥基自由基的清除作用等[4]。原產(chǎn)地于廣西、廣東等南部省區(qū)，以廣西的種植面積最大，是兩廣的地道藥材，其植株含相思子堿、糖類化合物、皂苷、黃酮苷、膽堿、甾醇類、氨基酸等化學(xué)成分[2-5]。也是含天然生物堿豐富的植物之一。

總生物堿是存在于自然界（大部分存在于植物[6]，但在一些動(dòng)物上也有發(fā)現(xiàn)）中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，有似堿的性質(zhì)，因此以前又稱為贗堿。大多數(shù)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素多包含在環(huán)內(nèi)，具有明顯的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一。具有光學(xué)活性。目前研究表明[7-9]，由于氧化損傷的機(jī)制在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，所以中藥的抗氧化作用是其達(dá)到治療效果的重要因素。很多疾病包括腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆等都不同程度地與自由基活性損傷有關(guān)。而生物堿類化合物具有很強(qiáng)的抗菌活性[10]、抑制活性氧、清除自由基等[11]作用，同時(shí)毒副作用相對(duì)小于化學(xué)合成藥，因此一直是人們竭力于開發(fā)新藥的重要研究領(lǐng)域。 目前國內(nèi)外對(duì)雞骨草黃酮類和多糖類成分測(cè)定和含量測(cè)定的研究較多，而有關(guān)生物堿類的成分及含量測(cè)定的研究國內(nèi)外報(bào)道較少見。但是，近年來，對(duì)雞骨草葉總生物堿的研究引起了人們極大的興趣。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)材料

雞骨草（Abrus Cantoniensis Hance）葉購于廣西百色市右江區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)教研室覃道光副教授鑒定為豆科相思子屬植物雞骨草的葉。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、752N紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、電子分析天平FA1204（上海天美天平儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A型（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)DF-15（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、電熱式恒溫水浴鍋HHS-214（江蘇金壇宏凱儀器廠）、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試劑

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212）、ABTS對(duì)照品（上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：C18H24N606S4）；DPPH對(duì)照品（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：217-591-8）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 生物堿的提取

稱取雞骨草葉粉末500 g，提取條件是：超聲輔助功率60 W，提取時(shí)間30 min/次，提取2次，料液比（g∶mL）1∶9，提取溫度70℃，提取劑70%乙醇，合并濾液，經(jīng)石油醚去除色素，用氯仿萃取2次，取下層液體水浴蒸發(fā)濃縮至褐色浸膏[12]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取5.0 mg干燥的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解置50 mL容量瓶中，稀釋至容量瓶的刻度線，搖勻備用。用移液管從中精密吸取5.0 mL該溶液于25 mL的容量瓶中，加入0.1 mol/L的鹽酸溶液并稀釋至容量瓶的刻度線，制0.02 mg/mL的液體作為鹽酸小檗堿對(duì)照品母液[13]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取0.02 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L的鹽酸溶液定容，搖勻備用，作為實(shí)驗(yàn)組，在波長為345 nm下測(cè)定其吸光值（A）[14]。選擇等體積的0.1 mol/L的鹽酸溶液，作為空白對(duì)照組，在相同的條件下測(cè)定其吸光值（A），以橫坐標(biāo)為濃度C，縱坐標(biāo)為吸光值（A），得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.23+1.2675C（r2=0.9997）。

2.2.3 樣品含量的測(cè)定 稱取提取物5.0 g置于燒杯中，用蒸餾水溶解，置于250 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，制成0.02 g/mL的液體混合均勻備用；精密吸取5.0 mL提取物溶液至10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液定容，混合均勻備用；采用二倍稀釋法得到5 mg/mL的溶液[15]，再次用紫外-可見分光光度法于345 nm波長下測(cè)定其吸光值（A），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總生物堿含量為1.89 mg/g[16]。

2.3 總生物堿體外抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 測(cè)定總生物堿還原Fe3+活性的能力 取5支試管中，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的0.02 g/mL樣品，體積少于0.5 mL則用蒸餾水補(bǔ)至體積相等。加入1%鐵氰化鉀及pH=6.6磷酸緩沖液各2.5 mL于50℃水浴箱中恒溫20 min后，立即加入10%三氯乙酸2.5 mL，置于4000 r/min的轉(zhuǎn)數(shù)下離心10 min，取上清溶液2.5 mL，加入2.5 mL的蒸餾水及0.5 mL的0.1%三氯化鐵，10 min后，采用紫外-可見分光光度法于波長700 nm處測(cè)吸光度值（A）[17]。

2.3.2 總生物堿對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定 取5支試管，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品，加蒸餾水補(bǔ)至體積相等。在避光條件下分別加入4 mL濃度為24 mg/L的DPPH乙醇（95%）溶液搖勻，作為實(shí)驗(yàn)組，常溫下避光30 min，采用紫外-可見分光光度法在517 nm處測(cè)吸光度（Ai），以等量不加樣品提取液的DPPH乙醇（95%）液為對(duì)照組，采用同樣的方法測(cè)定對(duì)照組吸光度（A0）。清除率=（1-Ai/A0）×100%[18]。

2.3.3 總生物堿對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定 分別將7 mmol/L的ABTS溶液50 mL與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液50 mL在常溫下混合，將混合后溶液作為ABTS儲(chǔ)備液，并在室溫下避光16 h，用甲醇將置于暗處16 h后的溶液稀釋至734 nm波長下的吸光度為0.7。分別吸取樣品20、40、60、80、100 μL，置于支試管中，再用80%乙醇溶液補(bǔ)至體積相等，分別加入2 mL的ABTS儲(chǔ)備液，常溫下反應(yīng)6 min后，在相同的波長下測(cè)定其吸光度值（Ai）。測(cè)定2 mL的ABTS儲(chǔ)備液與100 μL 80%乙醇溶液混合后的吸光度值（A0）；以2 mL甲醇代替ABTS儲(chǔ)備液，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定其吸光度值（Aj）。清除率=[（A0-Ai+Aj）/A0]×100%[19]。

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 雞骨草葉總生物堿還原Fe3+的能力 吸光度值（A）越大代表被測(cè)樣品還原Fe3+的能力的越強(qiáng)，雞骨草葉總生物堿具有一定還原Fe3+的能力，樣品量越大其吸光度值就越大，即還原Fe3+的能力就越強(qiáng)[20]。

2.4.2 總生物堿對(duì)DPPH自由基活性的清除 1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH·）是一種很穩(wěn)定的自由基[10]，雞骨草葉總生物堿對(duì)DPPH自由基活性具有較好的清除能力；樣品體積為400 μL時(shí)， 其清除率是90%。樣品體積越大清除率就越大，兩者呈量效關(guān)系，樣品體積在300～400 μL范圍內(nèi)，總生物堿對(duì)DPPH自由基活性具有較強(qiáng)的清除作用。見圖2。

2.4.3 總生物堿對(duì)ABTS自由基活性的清除 雞骨草葉總生物堿對(duì)ABTS自由基活性具有顯著的清除作用，樣品體積在100 μL時(shí)，清除率為85.53%。在20～100 μL范圍內(nèi)，雞骨草葉總生物堿對(duì)ABTS自由基活性的清除作用隨著樣品體積的增加而增強(qiáng)。見圖3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在綜合了前人對(duì)雞骨草成分提取的研究[4]以及一般總生物堿的提取、含量測(cè)定的研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用較為簡單的超聲輔助乙醇溶劑提取法提取雞骨草葉總生物堿，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定[21]。

根據(jù)生物堿具有抗氧化能力的性質(zhì)得出，雞骨草葉總生物堿具有一定還原Fe3+的能力和對(duì)DPPH自由基活性、 ABTS自由基活性具有一定的清除能力，不同體積樣品的抗氧化能力活性差異顯著。雞骨草葉總生物堿各抗氧化活性指標(biāo)均隨樣品體積的增加而增強(qiáng)，與樣品體積存在劑量依賴關(guān)系。廣西雞骨草資源豐富，開發(fā)潛力巨大，其藥用價(jià)值和食用價(jià)值備受關(guān)注。雞骨草葉總生物堿具有良好的抗氧化能力，具有低毒、副作用小的特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

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（收稿日期：2016-06-20 本文編輯：趙魯楓）