HPLC法測(cè)定彝藥火把花根中雷公藤甲素的含量

郭菊玲++楊勇幫++蔣春艷

摘要：目的建立系統(tǒng)、科學(xué)的火把花根中雷公藤甲素的提取和含量測(cè)定的方法，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制火把花根的質(zhì)量提供了可靠的方法。 方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流動(dòng)相為水-甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm；柱溫為35℃。 結(jié)果火把花根中雷公藤甲素的峰得到有效的分離，HPLC檢測(cè)條件、方法的專屬性、線性、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率良好，該方法可以用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。 結(jié)論該方法對(duì)今后的火把花根的質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：火把花根；雷公藤甲素；HPLC；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）11-0071-04

火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落葉披散或蔓狀灌木植物，又名雷公藤、斷腸草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生長(zhǎng)于向陽(yáng)山坡、路邊或灌木叢中，通常作為藥用的部位為根和皮，昆明山海棠為中國(guó)特有的植物，民間藥用中草藥。主要分布于我國(guó)的西南地區(qū)，云南省境內(nèi)尤為多見(jiàn)，主要集中分布于昆明、楚雄、紅河、玉溪等地?；鸢鸦ǜ驼Z(yǔ)為“一姑妹班”、“多爭(zhēng)唯”意譯為“開(kāi)花像火把樣通紅的植物。在西南地區(qū)彝族藥用歷史悠久。主要用于治療慢性腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等?；鸢鸦ㄒ幻驾d于《本草綱目》，李時(shí)珍集解曰：“生滇南者花紅，呼為火把花。[1]昆明山海棠有效成分研究多有報(bào)道，但是其含量測(cè)定研究少見(jiàn)?；鸢鸦ǜ幉氖蛰d于《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》（1974年）、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)·彝族藥（2005年）?，F(xiàn)行《中國(guó)藥典》收載的昆明山海棠片以重量法進(jìn)行含量測(cè)定，且測(cè)定方法相對(duì)簡(jiǎn)單，檢驗(yàn)靈敏度、重現(xiàn)性還有待提高[2]。上述標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)火把花根藥材的含量測(cè)定項(xiàng)目，有必要對(duì)此項(xiàng)目進(jìn)行研究。

火把花的化學(xué)成分較為復(fù)雜，長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)火把花中含有生物堿類雷公藤堿（wilfordie）、雷公藤次堿（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其中最主要的活性成分為雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素為環(huán)氧二萜類內(nèi)脂化合物，其藥理作用為：抗排斥作用、抗腫瘤作用、抗生育作用等。[4]雷公藤甲素有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，并具有廣譜、高效等特點(diǎn)，可以用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫疾病和炎性疾病的治療。[5]目前，對(duì)于火把花根中的雷公藤甲素的含量測(cè)定方法已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，但是由于研究的方法不夠完善和統(tǒng)一，得出的結(jié)果差異性較大。因此，本次研究在現(xiàn)有的火把花根中雷公藤甲素的含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用HPLC色譜法，對(duì)火把花根藥材進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)，建立了一個(gè)對(duì)火把花根中雷公藤甲素進(jìn)行含量測(cè)定的方法，為以后科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制雷公藤藥材的質(zhì)量提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司真空在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器），賽多利斯BSA224S-CW電子天平，賽多利斯BP211D電子天平，DHG-9104型鼓風(fēng)干燥箱，KQ-500E型超聲波清洗器，YS-04A小型高效粉碎機(jī)，Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度儀。

1.2試藥雷公藤甲素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）批號(hào)為：111567-201404，標(biāo)示量為：99.8%；分析純：甲醇（四川西隴化工有限公司）、三氯甲烷（四川西隴化工有限公司）、乙醚（四川西隴化工有限公司）、乙酸乙酯（四川西隴化工有限公司）、中性氧化鋁（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，200-300目），批號(hào)為：20130328色譜純?yōu)榧状迹ǖ聡?guó)默克試劑公司）；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別取本品粉末約5 g，加80%甲醇30 mL，超聲30 min，放冷至室溫，濾過(guò)，取濾液。濾液加三氯甲烷振搖提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，并將濾液低溫蒸干。殘?jiān)?ml甲醇完全溶解后用含5 g中性氧化鋁的洗脫柱（內(nèi)徑為1.2 cm，200目），洗脫液為甲醇：乙酸乙酯：乙醚=1：2；1 60 mL進(jìn)行洗脫至無(wú)色，蒸干洗脫液，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷—乙醚（2：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%3，5—二硝基苯甲酸乙醇溶液與2mol/l氫氧化鈉乙醇液的混合液（臨用前按1：3混合）作為顯色劑，噴霧顯色，自然光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取雷公藤甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為雷公藤甲素對(duì)照品溶液。取雷公藤甲素對(duì)照品溶液經(jīng)紫外分光光度儀進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為217 nm。結(jié)果如圖1，由圖1可知，雷公藤甲素的檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm。圖1雷公藤的全波長(zhǎng)掃描圖譜

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱：Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流動(dòng)相：甲醇-水（40：60）檢測(cè)波長(zhǎng)：217 nm柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣：10 uL；分析時(shí)間：40 min。

2.4溶液的制備

2.4.1對(duì)照品溶液的制備對(duì)照品溶液制備：取雷公藤甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.4.2供試品溶液的制備供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，濾液移置分液漏斗中，加水7 mL，用氯仿振搖提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)D(zhuǎn)移至中性氧化鋁柱用60 mL洗脫液進(jìn)行洗脫（中性氧化鋁：5 g；洗脫柱內(nèi)徑：1.2 cm；洗脫液體積：60 mL；洗脫液：甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1），收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1專屬性考察在檢測(cè)波長(zhǎng)：217 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 uL；流動(dòng)相：甲醇-水（40：60）；的HPLC色譜條件下，將雷公藤甲素對(duì)照品溶液、樣品溶液進(jìn)行HPLC分析，得到相應(yīng)的色譜圖。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照品的保留時(shí)間與樣品的保留時(shí)間一致，說(shuō)明該檢測(cè)條件、方法專屬性良好。圖2雷公藤樣品圖譜

2.5.2線性關(guān)系考察取雷公藤甲素對(duì)照品，分別配制成濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，以進(jìn)樣濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（mAU*s）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=20507X-6.3579，R2=0.9999，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在進(jìn)樣濃度為0.01mg/ml～0.06mg/ml的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5.3重復(fù)性考察按照供試品溶液的制備方法重復(fù)處理六份供試品溶液，進(jìn)樣10 uL，進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)，并記錄雷公藤甲素的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2，由檢測(cè)結(jié)果可知RSD%<3%，表明高效液相色譜法檢測(cè)條件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。

2.5.4精密度考察精密吸取同一對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 uL，平行進(jìn)樣5次，記錄雷公藤甲素色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD%值。結(jié)果見(jiàn)表3，可知RSD%<3%，表明HPLC檢測(cè)條件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。

2.5.5穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、18、20、24 h進(jìn)樣10 uL，并記錄雷公藤甲素的峰面積，帶入Y=20507X-6.3579，R2=0.9999計(jì)算含量，計(jì)算RSD%值為1.74%，結(jié)果顯示此方法樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6回收率試驗(yàn)分別精密稱取已知含量（0.0186 mg/g）的供試品3個(gè)重量梯度共6份，分為3組，每組兩份，配制一個(gè)濃度（0.02 mg/mL）的雷公藤甲素對(duì)照品溶液，分別向樣品溶液中加入3.4 mL、4.65 mL、5.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將上述6份樣品分別樣品分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定雷公藤甲素的峰面積，計(jì)算相應(yīng)回收率及RSD%值。結(jié)果為：平均回收率為98.9%，RSD%為1.80%，表明該HPLC檢測(cè)條件、方法的可靠性強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表5。

3討論

（1）火把花根的化學(xué)成分復(fù)雜，而且雷公藤甲素的本身含量極低，用普通的提取方法很難將雷公藤甲素從火把花根中提取出來(lái)，大量文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法很少有給出色譜圖，有色譜圖的雷公藤甲素的峰面積較小且分離度不夠，本次研究通過(guò)大量的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用氯仿萃取后通過(guò)中性氧化鋁柱層析，加洗脫液進(jìn)行洗脫后，雷公藤中雷公藤甲素的得到了很好的分離。調(diào)整洗脫液的用量，雷公藤甲素洗脫完全，雷公藤甲素的含量也明顯增加。此次研究反復(fù)多次對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行來(lái)探索，為使用HPLC法測(cè)定火把花根中雷公藤甲素的含量打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該含量測(cè)定方法對(duì)今后的火把花根的質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

（2）含量測(cè)定方法確立的過(guò)程中，樣品前處理至關(guān)重要。前期薄層色譜篩查的時(shí)候，因?yàn)闃悠分欣坠偌姿睾亢艿?，但其又是藥理活性成分。所以選其為質(zhì)控目標(biāo)物?？v觀整個(gè)樣品處理過(guò)程對(duì)藥品企業(yè)藥品生產(chǎn)工藝有實(shí)際指導(dǎo)意義。民族民間使用火把花根大多以酊劑，以用乙醇溶液浸泡的形式出現(xiàn)，藥效顯著；使用湯劑的很少。本次研究中，也用過(guò)水以及不同的甲醇溶液進(jìn)行提取。最終發(fā)現(xiàn)用甲醇提取時(shí)，雷公藤甲素的提取效率最大。這就提醒我們從事傳統(tǒng)民族民間藥物的現(xiàn)代工藝開(kāi)發(fā)研究一定要尊重傳統(tǒng)民間醫(yī)藥的用藥習(xí)慣，才能有的放矢。才能真正推動(dòng)民族藥的發(fā)展。

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