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    高效液相色譜法用于丙酸睪酮注射液的含量測定

    2016-12-28 14:28:01徐文峰徐碩馬捷
    中國醫(yī)藥導報 2016年30期
    關鍵詞:含量測定高效液相色譜法

    徐文峰+徐碩+馬捷

    [摘要] 目的 應用高效液相色譜(HPLC)建立丙酸睪酮注射液中丙酸睪酮的含量測定方法。 方法 采用Alltima C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇-水(80∶20,v/v)為流動相,流速1.0 mL/min,檢測波長241 nm,進樣體積10 μL為色譜條件建立丙酸睪酮注射液含量測定方法,考察方法的線性、精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率情況,并用藥典方法驗證該方法含量測定結果。 結果 在本方法中,丙酸睪酮的線性良好,相關系數(shù)(r)為0.9999,線性范圍為120.86~282.01 μg/mL;精密度和穩(wěn)定性良好,RSD均小于1.0%;丙酸睪酮的平均加樣回收率良好,為100.1%(n = 9);運用該方法測得四個批號丙酸睪酮注射液的含量分別為標示量的99.5%、97.6%、98.4%、97.1%,相同批號樣品藥典方法含量測定結果為98.2%、98.5%、97.3%、95.9%,說明該方法與藥典方法測定結果一致。 結論 該方法準確、簡單、快速,可用于測定丙酸睪酮注射液中丙酸睪酮的含量。

    [關鍵詞] 高效液相色譜法;丙酸睪酮注射液;含量測定

    [中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2016)10(c)-0134-04

    [Abstract] Objective To establish a content determination method for testosterone propionate in Testosterone Propionate Injection using high performance liquid chromatography (HPLC). Methods An Alltima C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) was used for the separation with methanol: purified water (80∶20, v/v) as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min with 241 nm as the detection wavelength and 10 μL as the injection volume. The linearity, precisions, stability and spiked recovery of the established method were inspected and the determination results of this method were verified using the method in Chinese Pharmacopoeia. Results The method showed good linearity with correlation coefficient of 0.9999 for testosterone propionate in the linear range 120.86-282.01 μg/mL. The precisions and stability were satisfactory with the relative standard deviations (RSD) below 1.0%. The average spiked recovery of testosterone propionate was 100.1% (n = 9). The determination results of four batches of Testosterone Propionate Injection were 99.5%, 97.6%, 98.4% and 97.1% using this method. The contents of the same four batches of Testosterone Propionate Injection were 98.2%, 98.5%, 97.3% and 95.9% measured by the method in Chinese Pharmacopoeia, which suggested that the determination results of this method were consistent with the method of Chinese Pharmacopoeia. Conclusion The established method is accurate, simple and fast, and can be used for determination of testosterone propionate in Testosterone Propionate Injection.

    [Key words] HPLC; Testosterone propionate injection; Determination

    丙酸睪酮是人工合成的睪酮類雄性激素藥物(化學結構式見圖1),具有較強的生理活性,藥理學研究表明丙酸睪酮能抑制雙氧水誘導淚腺上皮細胞的凋亡,影響缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬、皮層膠質原纖維酸性蛋白的表達,影響大腸桿菌解旋酶結構和功能,影響大鼠胸腺細胞凋亡及胸腺中B淋巴細胞瘤-2基因的表達,拮抗促凋亡基因的表達等[1-9]。臨床研究表明丙酸睪酮能促進男性器官及副性征的發(fā)育、成熟。大劑量時有對抗雌性激素作用,抑制子宮內(nèi)膜生長及卵巢、垂體功能,還有促進蛋白質合成及骨質形成等作用[10]。注射液是丙酸睪酮唯一一種藥物劑型,被《中國藥典》2015年版二部收載,主要有1 mL∶10 mg,1 mL∶25 mg,1 mL∶50 mg,1 mL∶100 mg四種規(guī)格[11]。丙酸睪酮注射液臨床適應證為原發(fā)性或繼發(fā)性男性性功能減低;男性青春期發(fā)育遲緩;絕經(jīng)后女性晚期乳腺癌姑息性治療等。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站的最新數(shù)據(jù)顯示,全國共六家企業(yè)生產(chǎn)丙酸睪酮注射液,分別為上海通用藥業(yè)股份有限公司、天津金耀藥業(yè)有限公司、廣州白云山明興制藥有限公司、遠大醫(yī)藥(中國)有限公司、河南科倫藥業(yè)有限公司及福州海王福藥制藥有限公司?!吨袊幍洹?015年版中丙酸睪酮注射液含量測定的前處理環(huán)節(jié)復雜,采用了提取、復溶、離心等方法,整個過程操作繁瑣,影響因素較多[11]。結合文獻[12-20],本實驗改進了丙酸睪酮注射液含量測定中供試品的前處理方法,簡化了藥典方法中復雜的前處理環(huán)節(jié),收到了滿意的效果。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Agilent 1260液相色譜系統(tǒng),配有G1311C四元梯度泵,G1329B自動進樣器,G1316A柱溫箱,G4212B DAD檢測器(Agilent Technologies,美國);Mettler XP-205電子天平(Mettler Toledo,瑞士);KQ-800KDE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(Millipore,美國)。

    1.2 試藥

    甲醇(色譜純,批號:155175,F(xiàn)isher公司);實驗室用水為超純水;丙酸睪酮對照品(批號:100008-201206,中國食品藥品檢定研究院,純度:99.8%);丙酸睪酮注射液(規(guī)格:1 mL∶25 mg;產(chǎn)品批號:1507111、 1411171;天津金耀藥業(yè)有限公司)。丙酸睪酮注射液(規(guī)格:1 mL∶25 mg;產(chǎn)品批號:130609, 121202;上海通用藥業(yè)股份有限公司);注射用大豆油(產(chǎn)品批號:150709;中航(鐵嶺)藥業(yè)股份有限公司)。

    2 方法與結果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Alltima C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇: 純水(80∶20,v/v);流速:1.0 mL/min;檢測波長241 nm;進樣體積:10 μL;柱溫為室溫。進樣前,所用溶液均用0.22 μm孔徑尼龍濾膜過濾。

    2.2 對照品溶液的制備

    精密稱定丙酸睪酮對照品約200 mg于100 mL容量瓶中,加甲醇適量,超聲使溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即為丙酸睪酮儲備液(2.0 mg/mL)。精密量取丙酸睪酮儲備液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于25 mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,獲得丙酸睪酮濃度均約為120、160、200、240、280 μg/mL的對照品溶液。中間濃度的對照品溶液作為含量測定用的對照品溶液。

    2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備

    精密量取本品2 mL(約相當于丙酸睪酮50 mg),置50 mL容量瓶中,用甲醇分數(shù)次洗滌移液管內(nèi)壁,洗液并入容量瓶中,加甲醇適量,超聲30 min,甲醇定容至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密量取注射用大豆油2 mL,按上述方法操作,即得陰性對照溶液。

    2.4 專屬性實驗和系統(tǒng)適應性實驗

    分別對陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液進樣分析,考察樣品中輔料對丙酸睪酮定量的干擾。根據(jù)圖2顯示:樣品中輔料不干擾丙酸睪酮的測定。理論板數(shù)按丙酸睪酮計算不低于4000。

    2.5 線性和靈敏度

    對“2.2”項不同濃度的對照品溶液分別進樣,以峰面積為縱坐標,濃度(μg/mL)為橫坐標作標準曲線。得到丙酸睪酮的線性方程為Y =27.6083X-9.8635,線性相關系數(shù)(r)為0.9999,線性范圍120.86~282.01 μg/mL,說明方法在該范圍內(nèi),線性相關性良好。

    將對照品溶液用甲醇逐級稀釋后,以信噪比(S/N)約為3.0時的濃度為最低檢測限(LOD),S/N約為10.0時的濃度為最低定量限(LOQ),測得丙酸睪酮的LOD和LOQ分別為0.013、0.032 μg/mL。

    2.6 精密度試驗

    對中間濃度的對照品溶液連續(xù)進樣6次,對照品溶液中丙酸睪酮峰面積的RSD(n = 6)為0.18%,說明儀器精密度良好。

    2.7 重復性試驗

    對批號1507111的丙酸睪酮注射液獨立制備供試品溶液6份,分別進樣分析,計算得到丙酸睪酮含量的RSD(n = 6)為0.56%,說明方法的重復性良好。

    2.8 加樣回收率試驗

    精密量取丙酸睪酮注射液1 mL(約相當于丙酸睪酮25 mg),置50 mL容量瓶中,用甲醇分數(shù)次洗滌移液管內(nèi)壁,洗液并入容量瓶中,分別精密加入丙酸睪酮儲備液10.0、12.5、15.0 mL,加甲醇適量,超聲30 min,甲醇定容至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,過濾。每個濃度制備3份樣品,共9份樣品。進樣測定,計算加樣回收率和RSD,結果顯示,丙酸睪酮的平均加樣回收率為100.1%(n=9),RSD為1.46%(n=9),表明方法的加樣回收率良好。見表1。

    2.9 穩(wěn)定性試驗

    對批號1507111的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析,計算得到24 h內(nèi)丙酸睪酮色譜峰面積RSD(n = 6)為0.27%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.10 樣品含量測定

    應用本研究建立的方法及《中國藥典》方法[11]對批號為1507111、1411171(天津金耀藥業(yè)有限公司)、130609、121202(上海通用藥業(yè)股份有限公司)的丙酸睪酮注射液進行含量測定,每個樣品制備2份,取平均值。測定結果顯示該方法與藥典方法含量測定結果一致,說明方法準確可靠,可用于丙酸睪酮注射液的含量測定。見表2。

    3 討論

    3.1 提取過程更簡便

    藥典方法選擇乙醚作為提取溶劑,需要將乙醚水浴揮散后甲醇復溶提取物,并需要通過多次振搖后離心的方式去除溶解在乙醚而不溶于甲醇的輔料成分[11],操作相對繁瑣;本實驗采用甲醇直接超聲提取丙酸睪酮,操作簡單,盡可能減少操作中引入的誤差及減少輔料中的成分對丙酸睪酮含量測定時的干擾。

    3.2 實驗過程更快捷

    藥典方法需要用甲醇振搖4次(5、5、5、3 mL)復溶丙酸睪酮乙醚提取物,每次需振搖10 min,之后還需離心15 min,處理一份樣品共計100 min[11]。本實驗超聲提取一份樣品僅需30 min,方法更快捷。

    3.3 含量測定結果準確可靠

    本實驗在保證丙酸睪酮注射液供試品的取樣量(約相當于丙酸睪酮50 mg),稀釋倍數(shù)(250倍),對照品溶液濃度(200 μg/mL),流動相的選擇(甲醇-水,80∶20),檢測波長(241 nm),丙酸睪酮峰的保留時間(約12 min)均與藥典方法一致的前提下,對供試品前處理方法加以優(yōu)化,保證測試結果只受樣品前處理方法的影響。結果顯示該方法與藥典方法含量測定結果一致,說明方法準確可靠,可用于丙酸睪酮注射液的含量測定。

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    (收稿日期:2016-07-10 本文編輯:趙魯楓)

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