牡蠣多糖蘋果果醋的制備及其抗氧化活性研究

蔡成呈++李欣遙++佟長(zhǎng)青++李偉

摘 要：以蘋果醋為主要原料，添加牡蠣多糖采用正交實(shí)驗(yàn)研制牡蠣多糖蘋果果醋，并測(cè)定了牡蠣多糖蘋果果醋、牡蠣多糖及蘋果醋的ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和還原能力。結(jié)果表明，牡蠣多糖蘋果果醋的最佳配方為：牡蠣多糖添加量0.3%，酵母添加量0.1%，檸檬酸添加量0.1%，蜂蜜添加量10%，其感官評(píng)定得分為86.6?？寡趸瘻y(cè)定結(jié)果表明，牡蠣多糖蘋果果醋ABTS自由基清除率為95.81%，DPPH自由基清除率為95.11%，還原力為0.66，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：牡蠣多糖；蘋果醋；正交實(shí)驗(yàn)；抗氧化活性

牡蠣（Oyster）是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣中含有多種生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血脂等生物活性[1]。滕瑜等用牡蠣多糖對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖大鼠進(jìn)行降血糖的研究，發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖提取物可降低血糖、尿糖，改善臨床癥狀[2]。于婭等采用酶解方法制備了牡蠣短肽，HPLC法定量馬尿酸測(cè)定ACE抑制活性，結(jié)果表明，0.4 mg/mL的牡蠣短肽的ACE抑制率為51.4%[3]。劉塞等發(fā)現(xiàn)牡蠣提取物能夠顯著降低高血脂鵪鶉的血漿總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白B的水平，從而起到降血脂作用[4]。Shi等發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[5]。

果醋被譽(yù)為第四代飲料，它不但具有醋原有的功能，還具有保健功能[6]。由于其具有濃郁的香味，果酸含量較為豐富，所以其風(fēng)味和口感都比食醋要好[7]。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，果醋對(duì)人體具有良好的功效。它具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、降低膽固醇的含量、加快酒精在人體內(nèi)的分解代謝、健胃消食等作用，因此是公認(rèn)的集多種療效于一身的健康飲品[8-14]。目前，尚未見到牡蠣多糖蘋果果醋的報(bào)道。本研究將牡蠣多糖添加到果醋中，研制出牡蠣多糖蘋果果醋。它不僅具有濃郁的果香及酸甜的口感，而且具有較好的抗氧化活性，是一種理想的保健飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果醋飲料 河南鄭新天源食品有限公司；雜花蜂蜜 大連蜂產(chǎn)品有限公司；高活性干酵母 安琪酵母有限公司；牡蠣多糖（CGPS-1） 實(shí)驗(yàn)室自制；DPPH（2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽） 美國(guó)Sigma 公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸及無(wú)水乙醇 大連沅義科技有限公司。

BS110S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；IEC微量臺(tái)式小型離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；UV-754紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣多糖蘋果果醋的制備 牡蠣多糖蘋果果醋的加工工藝如下：牡蠣多糖與酵母加水混合均勻，30 ℃發(fā)酵30 min；然后加入一定量的檸檬酸、蜂蜜及蘋果醋調(diào)味，8 000 r/min離心10 min使調(diào)制的果醋澄清，制得牡蠣多糖蘋果果醋。

1.2.2 感官評(píng)定 經(jīng)培訓(xùn)、考核、再培訓(xùn)選出十位感官評(píng)定員，對(duì)牡蠣多糖蘋果果醋外觀、風(fēng)味及口感進(jìn)行評(píng)分，三項(xiàng)評(píng)分的和即為最后得分，并進(jìn)行方差分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以感官評(píng)分表為標(biāo)準(zhǔn)，考察牡蠣多糖、酵母、檸檬酸、蜂蜜的添加量對(duì)牡蠣多糖蘋果果醋外觀、風(fēng)味及口感的影響。設(shè)定多糖添加量為0.3%，酵母添加量為0.25%，檸檬酸添加量為0.1%，蜂蜜添加量為10%，其他條件不變，依次改變單因素含量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。多糖添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；酵母、檸檬酸添加量為0.1%、0.25%、0.4%、055%、0.7%；蜂蜜添加量為2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定牡蠣多糖、酵母、檸檬酸、蜂蜜的添加量，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表如表2所示。

1.2.5 果醋理化指標(biāo)的測(cè)定 總酸（以乙酸計(jì)）含量按照國(guó)標(biāo)《食品中總酸的測(cè)定》（GB/T 12456-2008）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。蘋果酸含量參照國(guó)標(biāo)《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》（GB/T 5009.157-2003）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。乳酸含量參照行標(biāo)《進(jìn)出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測(cè)方法 高效液相色譜法》（SN/T 2007-2007）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)pH計(jì)、糖度計(jì)對(duì)牡蠣多糖蘋果果醋pH、糖度含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測(cè)定 ABTS法測(cè)定的為物質(zhì)的總抗氧化能力，參照文獻(xiàn)[15]并略微改動(dòng)。將7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的K2S2O8混合，黑暗室溫下放置12 h制得ABTS自由基溶液。用95%乙醇將ABTS自由基溶液稀釋至734 nm處吸光度值為0.7±0.01。將2 mL稀釋后的ABTS自由基溶液加入到0.9 mL不同濃度的樣液中，25 ℃水浴6 min，734 nm測(cè)定吸光度為Ai。相同條件下測(cè)定不同濃度的0.9 mL樣液溶液與2 mL 95%乙醇的吸光度值為Aj；2 mL ABTS+與0.9 mL蒸餾水的吸光度值為Ao。

ABTS自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

式中：Ao為空白對(duì)照的吸光度值； Ai為樣液的吸光度值； Aj為本底的吸光度值。

1.2.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定 DPPH可作為典型的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[16]測(cè)定牡蠣多糖蘋果果醋對(duì)DPPH自由基清除能力。將不同濃度的2 mL樣液溶液與2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液混合均勻，于室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度為Ai。相同條件下測(cè)定不同濃度的2 mL樣液溶液與2 mL 95%乙醇的吸光度值為Aj；2 mL DPPH·與2 mL蒸餾水的吸光度值為Ao。

DPPH自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

式中：Ao空白對(duì)照的吸光度值；Ai樣液的吸光度值；Aj本底的吸光度值。

1.2.8 還原力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]方法且略有改動(dòng)。取不同濃度的樣液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L pH為6.6的磷酸緩沖液1.25 mL，1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液1.25 mL。充分混合均勻后，50 ℃恒溫水浴20 min，取出冷卻后，加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液1.25 mL，并于8 000 r/min的條件下離心10 min。移取1.25 mL上清液，加入1.25 mL蒸餾水及0.1 g/100 mL的三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后于700 nm處測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)spss 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣多糖蘋果果醋制備

由圖1可知，隨著牡蠣多糖添加量的增加，得分先升高后下降，在0.2%～0.4%時(shí)得分較高，0.3%時(shí)得分達(dá)到最大值。因牡蠣多糖具有腥味，添加量過(guò)大時(shí)會(huì)使牡蠣多糖蘋果果醋口感不協(xié)調(diào)，而添加量過(guò)低會(huì)影響其生物活性，因此選擇添加量為0.2%～0.4%。

由圖2可知，酵母添加量為0.25%時(shí)得分最高為71.5。繼續(xù)增加酵母添加量后，得分不斷下降。原因是酵母本身具有特殊風(fēng)味，其添加量越大，對(duì)牡蠣多糖蘋果果醋口感及風(fēng)味影響越大。

由圖3可知，隨著檸檬酸添加量增加，得分下降，添加量為0.1%時(shí)得分最高。添加檸檬酸可掩蓋牡蠣多糖的腥味，起到調(diào)節(jié)口感的作用，但蘋果醋本身酸味較濃，檸檬酸添加量過(guò)高會(huì)使蘋果醋偏酸，讓人無(wú)法接受。

由圖4可知，蜂蜜添加量越大，得分越高，添加量為10%時(shí)，得分達(dá)到最大值。如果蜂蜜添加量繼續(xù)增大，就會(huì)使制得的果醋液體渾濁，嚴(yán)重影響其外觀及口感。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定牡蠣多糖添加量為0.2%、0.3%、0.4%；酵母及檸檬酸添加量為0.1%、0.25%、0.4%；蜂蜜添加量為6%、8%、10%，并以此設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

根據(jù)表3可知，影響牡蠣多糖蘋果果醋感官品質(zhì)的順序?yàn)锽>A>D>C，即酵母>牡蠣多糖>蜂蜜>檸檬酸。其極差分析得最優(yōu)組合為A2B1C1D3，即牡蠣多糖添加量為0.3%，酵母添加量為0.1%，檸檬酸添加量為0.1%，蜂蜜添加量為10%。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出了最優(yōu)組合并做了驗(yàn)證試驗(yàn)，此組合最終得分為86.6。因此確定牡蠣多糖蘋果果醋的最佳配方為多糖含量為0.3%、酵母0.1%、檸檬酸0.1%、蜂蜜10%。蔣楊等在研制近江牡蠣多糖口服液中采用活性炭濾紙脫腥法、酵母脫腥法和β-環(huán)糊精包埋法三種方法進(jìn)行脫腥。相比之下，酵母脫腥法具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉等特點(diǎn)[18]。本實(shí)驗(yàn)添加酵母去除牡蠣多糖的腥味，檸檬酸及蜂蜜可使果醋口感協(xié)調(diào)，因此制備的牡蠣多糖蘋果果醋口感清爽、風(fēng)味獨(dú)特、色澤金黃。

2.2 牡蠣多糖蘋果果醋理化指標(biāo)

牡蠣多糖蘋果果醋的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表4。牡蠣多糖蘋果果醋的pH為2.69，糖度為9%，蘋果酸含量為560.5 mg/kg以及乳酸含量為17.79 mg/kg。有文獻(xiàn)報(bào)道果醋中總酸含量為4.6 g/kg、pH為3.0[19]，糖度為13.2%[20]。

2.2 牡蠣多糖蘋果果醋抗氧化活性

如圖5所示，牡蠣多糖蘋果果醋與蘋果醋均具有較好的ABTS自由基清除能力且具有濃度依賴性。在濃度為0.51 mg/mL時(shí)，牡蠣多糖蘋果果醋清除率為95.81%。本實(shí)驗(yàn)不再增加樣本濃度是因?yàn)樵?.51 mg/mL時(shí)，牡蠣多糖蘋果果醋與蘋果醋的自由基清除率幾乎相同。

如圖6所示，牡蠣多糖蘋果果醋展現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。隨濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到1.65 mg/mL后，清除率緩慢增加，本實(shí)驗(yàn)樣本的最大濃度為1.95 mg/mL，此時(shí)清除率達(dá)到最大值為95.11%，均高于牡蠣多糖與蘋果醋。原因可能是牡蠣多糖蘋果果醋中一些其他具有生物活性的成分起到了協(xié)同增效的作用。

圖7為還原能力測(cè)定結(jié)果，牡蠣多糖蘋果果醋的還原力與蘋果醋、牡蠣多糖相比較強(qiáng)，且具有濃度依賴性。還原能力可以作為潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)制備出的牡蠣多糖蘋果果醋最佳配方為牡蠣多糖添加量為0.3%、酵母添加量為0.1%、檸檬酸添加量為0.1%及蜂蜜添加量為10%；制備出的牡蠣多糖蘋果果醋具有色澤金黃、果香濃郁、口感柔和飽滿、酸甜適中的特點(diǎn)?？寡趸钚匝芯勘砻?，牡蠣多糖蘋果果醋具有較強(qiáng)的抗氧化活性且高于牡蠣多糖及蘋果醋。因此，牡蠣多糖蘋果果醋不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有開發(fā)價(jià)值。

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