HMGB1介導(dǎo)NF—kB通路促進(jìn)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗細(xì)胞模型的凋亡

王隆卉 管宇 倪曉容

〔摘要〕 目的 探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）對胰島素抵抗的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞IkB/NF-kB信號通路的影響。方法 體外培養(yǎng)正常大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，設(shè)對照組、不同濃度胰島素干預(yù)組，不同濃度HMGB1干預(yù)組，胰島素抵抗+si-HMGB1干預(yù)組等，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定葡萄糖、HMGB1、雄激素、TNF-α、磷酸化NF-kB p65的含量；免疫印跡檢測IkBa、pIkBa、Caspase3和Cleaved Caspase3的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，胰島素過高導(dǎo)致大鼠卵巢細(xì)胞的葡萄糖含量明顯降低（P<0.05）；雄激素及相關(guān)炎癥因子HMGB1、TNF-α明顯升高（P<0.01），并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p65并使其磷酸化程度明顯升高 （P<0.05）。隨著HMGB1濃度升高，雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表達(dá)量較對照組均明顯升高（P<0.05 or P<0.01）；而當(dāng)胰島素抵抗的卵巢顆粒細(xì)胞中加入HMGB1的干擾小分子，則發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗帶來的副作用得到緩解，較胰島素抵抗對照組雄激素、Cleaved Caspase3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表達(dá)量均顯著性下降（P<0.05 or P<0.01）。結(jié)論 HMGB1在多囊卵巢綜合征（PCOS）胰島素抵抗卵巢顆粒細(xì)胞模型中促使炎癥因子升高，可能介導(dǎo)了NF-kB信號通路的激活，促進(jìn)胰島素抵抗卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，參與了PCOS的發(fā)病。

〔關(guān)鍵詞〕 高遷移率族蛋白1；多囊卵巢綜合征；胰島素抵抗；卵巢顆粒細(xì)胞

〔中圖分類號〕R711.35 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of HMGB1 on IkB/NF-KB signaling pathway in ovarian granulosa cells of rats with insulin resistant. Methods The ovarian granulosa cells in vitro were cultured， and the control group， different concentrations of insulin intervention groups， different concentrations of HMGB1 intervention groups and insulin resistance+si-HMGB1 group and others were designed. The levels of glucose， HMGB1， androgen， TNF-α and phosphorylated NF-kB p65 were determined by enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. The concentrations of IkBa， pIkBa， Caspase3 and Cleaved Casepase3 were detected by Western blotting. Results Compared with the control group， high insulin significantly decreased the glucose of rats （P<0.05）， increased the androgen， HMGB1 and TNF-α （P<0.01） in ovarian granulosa cells， and then activated transcription factor NF-kB p65， significantly increased phosphorylated NF-kB p65（P<0.05）. Androgen， phosphorylated IKBa， phosphorylated NF-kB p65 and TNF-a increased significantly with the increase of HMGB1 （P<0.05 or P<0.01）. When adding HMGB1 interference small molecules into the ovarian granulosa cells， side effects induced by insulin resistance relieved， and the expression of androgen， Cleaved caspase 3， TNF-α， phosphorylated IkBa and phosphorylated NNF-kB p65（P<0.05 or P<0.01） were significantly lower than the control group. Conclusion HMGB1 could promote the increase of inflammatory factors in the PCOS insulin resistance ovarian granulosa cell model. HMGB1 may mediate the NF-kB signaling pathway， promote the cell apoptosis in insulin resistance ovarian granulosa cells， also involve in the pathogenesis of PCOS.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome； high mobility group protein 1； insulin resistance； ovarian granulosa cells

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是病因尚不明確的異質(zhì)性、進(jìn)行性、難治性的婦科內(nèi)分泌疾病。其臨床表現(xiàn)以高雄激素血癥為普遍特征，涉及月經(jīng)失調(diào)、不孕、肥胖、多毛、痤瘡等諸多方面[1]。此外，PCOS還通常伴有或引發(fā)多種并發(fā)癥，如，胰島素抵抗，子宮內(nèi)膜癌、高血壓、代謝性綜合癥以及心血管系統(tǒng)疾病[2-3]。西醫(yī)認(rèn)為卵巢顆粒細(xì)胞凋亡與PCOS排卵障礙具有密切關(guān)系[4-5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein， HMGB1） 介導(dǎo)了胰島素抵抗（insulin resistant，IR）誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[6]。本文旨在研究體外PCOS模型中HMGB1促進(jìn)胰島素抵抗誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路及其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2013-0003），SPF級，鼠齡3～4周，體質(zhì)量50～100 g。室溫18～20 ℃，濕度為65%～70%，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（GIBCO 公司），孕馬血清促性腺激素（寧波第二激素廠產(chǎn)品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。合成的si-HMGB1（貨號：1027280）購自德國QIAGEN公司。青霉素、鏈霉素，HMGB1試劑（H4652-1MG），葡萄糖含量檢測試劑盒（Lot#SLBH0679V），雄激素（12850）購自美國Sigma公司。pNF-kBp65檢測試劑盒（ab176647），TNF-α檢測試劑盒（ab46070），HMGB1抗體（ab79823），IkBa抗體（ab32518）購自英國ABCAM公司。pIkBa抗體（#5209），Caspase3抗體（#9662P），Cleaved Caspase3抗體（#9661S）購自美國CST公司。辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（A0208，A0216）購自碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），Autoblotsystem 20型全自動蛋白印跡儀（新加坡Genelabs公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的原代分離 SD大鼠（10只）腹腔注射PMSG（8～10 U）48 h后腹腔麻醉，無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，用PBS緩沖液清洗3次，在體視顯微鏡下去除其周圍脂肪和被膜，用1 mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞釋放出來，加入1 g/L透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，用孔徑為200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min。棄上清，用PBS緩沖液清洗3次，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEN/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+0.5 μg/mL兩性霉素2B+體積分?jǐn)?shù)10%FBS）重懸，而后計(jì)數(shù)，鑒定，活力測定。

1.2.2 多囊卵巢綜合征細(xì)胞模型的建立[6]及分組 分離獲得的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)5 d后，傳代培養(yǎng)至60%時(shí)，加葡萄糖（glucose）和胰島素（insulin）處理48 h，收集細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的IR模型，分組設(shè)置分別為對照組（+glucose4.5 g/L，-insulin），IR0.1 ？滋mol/L組（+glucose4.5 g/L，+insulin0.1 ？滋mol/L），IR0.5 ？滋mol/L組（+glucose4.5 g/L，+insulin0.5 ？滋mol/L），IR1.0 ？滋mol/L組（+glucose4.5 g/L，+insulin1.0 ？滋mol/L）。

體外檢測不同濃度HMGB1刺激對卵巢顆粒細(xì)胞的影響，設(shè)置分組為對照組，HMGB1低濃度組（10 ng/mL），HMGB1中濃度組（60 ng/mL），HMGB1高濃度組（150 ng/mL）。

檢測IR的卵巢顆粒細(xì)胞通過HMGB1介導(dǎo)炎性及凋亡效應(yīng)，設(shè)置分組為：IR（-）+Si-HMGB1（-）組，IR（-）+Si-HMGB1（50 nmol/L）組，IR（1.0 ？滋mol/L）+Si-HMGB1（-）組，IR（1.0 ？滋mol/L）+Si-HMGB1（50 nmol/L）組。

1.2.3 ELISA法測定葡萄糖、HMGB1、雄激素（androgen）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）p65的含量 將樣品上樣至96孔板，室溫孵育1～2 h，PBS洗板，加一抗，室溫孵育2 h，PBS洗板，加二抗，室溫孵育1 h，加顯色液，450 nm波長讀值并計(jì)算。不同試劑盒按說明節(jié)操作。

1.2.4 Western blot檢測IkBa、pIkBa、Caspase3和Cleaved Casepase3的蛋白表達(dá) 不同細(xì)胞分組后處理48 h，收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，測定總蛋白濃度。并取等量蛋白上樣，電轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加對應(yīng)一抗（詳見試劑，1∶1 000-1∶5 000稀釋），室溫孵育3 h，TBST清洗，加相應(yīng)二抗（詳見試劑，1∶1 000-1∶2 000稀釋）室溫孵育45 min到1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色，掃描并統(tǒng)計(jì)分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)，以標(biāo)準(zhǔn)差“x±s”表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01代表差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞的原代分離及培養(yǎng)

大鼠原代卵巢細(xì)胞分離后，剛開始接種時(shí)顆粒細(xì)胞呈球形，10 h 后貼壁生長，培養(yǎng)24 h后，形態(tài)不規(guī)則，呈多角形或梭形（圖1∶5 d）。培養(yǎng)10 d時(shí)可鋪滿皿底，形成單層的顆粒細(xì)胞（圖1∶10 d）。部分顆粒細(xì)胞還出現(xiàn)聚集生長的特征，形成胚胎干細(xì)胞樣集落。圖1顯示大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的原代分離比較成功。

2.2 PCOS卵巢顆粒細(xì)胞模型的構(gòu)建

胰島素對卵巢顆粒細(xì)胞的影響，加入不同濃度的胰島素培養(yǎng)48 h后，收集并裂解細(xì)胞，檢測其細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)高濃度胰島素處理細(xì)胞后，會導(dǎo)致PCOS特征性因素葡萄糖相比未加胰島素對照組明顯降低（P<0.05），雄激素較對照組明顯升高（P<0.01）；同時(shí)相關(guān)炎癥因子HMGB1、TNF-α較對照組明顯升高（P<0.01），并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p65使其磷酸化程度較對照組明顯升高（P<0.05）。由此可見，HMGB1，TNF-α和NF-kB均被胰島素正向調(diào)控，呈現(xiàn)表達(dá)量明顯上升。顯示本實(shí)驗(yàn)建立的PCOS細(xì)胞模型相對有代表性[6]，且胰島素過高造成的IR可能與炎癥反應(yīng)及NF-kB通路直接相關(guān)。見圖2。

2.3 HMGB1介導(dǎo)p-IkBa 和TNF-α表達(dá)升高

隨著HMGB1濃度升高，雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表達(dá)量都較對照組明顯升高（P<0.05 or P<0.01）。見圖3。

2.4 在PCOS卵巢顆粒細(xì)胞模型中HMGB1通過TNF-α/NF-kB通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡

當(dāng)IR的卵巢顆粒細(xì)胞中加入HMGB1的干擾小分子，則發(fā)現(xiàn)IR帶來的炎癥現(xiàn)象得到有效緩解。與IR對照組相比，雄激素、Cleaved Caspase-3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表達(dá)量都發(fā)生了顯著性下降（P<0.05 or P<0.01），更加確定了HMGB1在此過程中起重要作用。見圖4。

3 討論

50%～90%的PCOS患者存在IR、高胰島素血癥，使得其發(fā)生代謝綜合征、II型糖尿病、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)較普通人群增加5～10倍[1]。深入探索PCOS患者高雄激素水平與糖脂代謝失衡之間的關(guān)系，對該疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及早期干預(yù)治療具有重要意義。

有研究表明PCOS患者中炎癥因子水平升高，在其發(fā)生發(fā)展的過程中存在低度慢性炎癥[6]。目前發(fā)現(xiàn)和PCOS密切相關(guān)的有c反應(yīng)蛋白（c-reactive protein，CRP）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α、NF-kB等慢性炎癥因子的異常[7-8]。其中TNF-α是一種非糖化蛋白[8-10]，由多種炎癥細(xì)胞合成和分泌，可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)組織釋放TNF-α，而TNF-α可以通過多種作用機(jī)制影響胰島素的敏感性，是重要的IR介質(zhì)：它可以減少胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的酪氨酸磷酸化，抑制胰島素信號向IRS-1的傳導(dǎo)[11-12]；下調(diào)多種脂肪細(xì)胞中多種細(xì)胞分子和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致IR。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者TNF-α水平顯著高于正常人群[4]，且肥胖者升高更明顯[13]。

TNF-α能夠誘導(dǎo)NF-kB結(jié)合雄激素受體啟動子，使其活性增加，降低顆粒細(xì)胞芳香酶活性，使得雄性激素轉(zhuǎn)化成雌激素減少，引起高雄激素血癥[14]。NF-kB的激活使得炎癥因子表達(dá)增多，IR水平加重，雄激素水平升高，誘導(dǎo)PCOS的產(chǎn)生。而NF-kB通路中最關(guān)鍵的上游因子即為HMGB1。

HMGB1是較新發(fā)現(xiàn)的一種炎性細(xì)胞因子，普遍存在于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞核中，參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能[15]。胞外的HMGB1能夠通過不同的受體途徑影響NF-kB的活性，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。除此以外，大量的研究證實(shí)，HMGB1與其受體相互作用，通過激活NF-kB等信號通路，介導(dǎo)了如IR等許多病理過程的發(fā)生[14-15]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)IR的卵巢顆粒模型細(xì)胞中HMGB1水平較正常對照組表達(dá)明顯增加。而當(dāng)IR的卵巢顆粒細(xì)胞中加入HMGB1的干擾小分子，則發(fā)現(xiàn)IR帶來的副作用得到緩解。較IR對照組而言，雄激素明顯下降以及凋亡明顯降低（Cleaved Caspase3），建議可作為PCOS治療的靶點(diǎn)。TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表達(dá)量較對照組顯著性下降，提示PCOS與炎癥反應(yīng)相關(guān)，并經(jīng)HMGB1參與NF-kB通道，該機(jī)制可能參與了PCOS的發(fā)病。

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