補(bǔ)腎藥膳方對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠CTX—Ⅰ指標(biāo)及骨組織形態(tài)的影響

林靜 張潔 陳燕

〔摘要〕 目的 觀察補(bǔ)腎藥膳方對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）模型大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）指標(biāo)及骨組織形態(tài)的影響。方法 SPF級(jí)雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎藥膳方高劑量組、補(bǔ)腎藥膳方低劑量組、骨疏康組，每組10只。除正常組、假手術(shù)組外，其他組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除，適應(yīng)性飼養(yǎng)15 d后，分組干預(yù)12周，ELISA法檢測(cè)血清中骨代謝標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度表達(dá)情況，HE染色鏡下觀察骨組織形態(tài)。結(jié)果 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)腎藥膳方高、低劑量組、骨疏康組大鼠血清CTX-Ⅰ濃度均升高（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎藥膳方高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度顯著降低（P<0.05），低劑量組血清CTX-Ⅰ濃度雖低于高劑量組、骨疏康組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在骨形態(tài)上，模型組骨小梁明顯變細(xì)，出現(xiàn)明顯斷裂，有扭曲，形態(tài)結(jié)構(gòu)差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴(kuò)大融合明顯，高劑量組、低劑量組與骨疏康組均能一定程度上改善骨形態(tài)。結(jié)論 補(bǔ)腎藥膳方各劑量對(duì)CTX-I濃度的影響與骨疏康顆粒療效相當(dāng)，一定程度能降低骨吸收標(biāo)志物水平，減少骨吸收，改善骨形態(tài)，緩解骨質(zhì)疏松，但在劑量精確方面仍可待將來研究。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎藥膳方；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；CTX-Ⅰ指標(biāo)；骨形態(tài)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R681 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of reinforcing kidney medicinal diet on CTX-Ⅰindex and bone morphological changes in postmenopausal osteoporosis （PMOP） model rats. Methods SPF female SD rats were randomly divided into normal group， sham operation group， model blank group， high dose group， low dose group and Gushukang group， with 10 rats in each group. Except normal group and sham operation group， other rats were ovariectomized. After 15 days of adaptive feeding， the rats were given intervention treatment for 12 weeks. The expression of CTX-Ⅰ in serum was detected by ELISA method. Bone morphology was observed by HE staining. Results Compared with the normal group and sham-operation group， the concentration of CTX-Ⅰin model blank group， high dose group， low dose group， Gushukang group increased significantly （P<0.05）. Compared with the model blank group， the concentration of CTX-Ⅰ in high dose group， low dose group and Gushukang group decreased significantly （P<0.05）. CTX-1 in low dose group was lower than the high dose group and Gushukang group， but the difference between them was not significant（P>0.05）. In the bone morphology， the trabecular bone of the model blank group was significantly thinner， with obvious fracture， twisting， poor shape and structure， increased gap between the trabecular bone and bone marrow cavity. The bone marrow cavity expanded and merged obviously. The high dose group， the low dose group and the Gushukang group could improve bone morphology to some extent. Conclusion The effect of reinforcing kidney medical diet on the concentration of CTX-I is comparable with that of Gushukang granules. It could reduce the level of bone resorption markers， reduce bone resorption， improve bone shape and alleviate osteoporosis to a certain extent. The accuracy of dose should be further studied.

〔Keywords〕 rreinforcing kidney medicinal diet； postmenopausal osteoporosis； CTX-Ⅰindex； bone morphology

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量降低和骨結(jié)構(gòu)退化為特點(diǎn)，危害中老年健康的全身骨代謝疾病[1]。婦女絕經(jīng)后，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要原因是天癸漸竭，腎氣漸衰，骨髓化生無(wú)源，致筋骨不堅(jiān)，髓枯骨脆[2]。因此研究抗骨質(zhì)疏松藥物可以從補(bǔ)腎藥物著手。WHO明確提出治療骨質(zhì)疏松癥應(yīng)從補(bǔ)鈣、運(yùn)動(dòng)與飲食方面著手，其中飲食療法是防治骨質(zhì)疏松的重要方案。隨著中醫(yī)理論的發(fā)展，有學(xué)者根據(jù)“腎主藏精”理論進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為補(bǔ)腎中藥對(duì)OP各個(gè)病理環(huán)節(jié)有著一定的調(diào)節(jié)作用，杜仲、牛膝等中藥對(duì)抗骨質(zhì)疏松作用有增強(qiáng)趨勢(shì)[3-4]。目前有研究認(rèn)為[5-6]藥膳方能夠有效地防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，操作便利，既可治療和保健，又可調(diào)養(yǎng)身心。為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎藥膳方在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過專家認(rèn)定的補(bǔ)腎藥膳方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠，觀察其對(duì)大鼠血清I型膠原C端肽（CTX-I）濃度及骨組織形態(tài)的影響，探討其對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雌性SD大鼠60只（4～5月齡，未曾交配，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體質(zhì)量200～220 g，所有SPF級(jí)大鼠喂養(yǎng)在恒溫恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1） ℃，濕度為70%，每天12小時(shí)光照/黑暗，進(jìn)食大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和凈化水。對(duì)每只大鼠進(jìn)行編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，共分為6組，每組10只。第一組為正常組，第二組為假手術(shù)組，第三組為模型組，第四組為補(bǔ)腎藥膳方高劑量藥膳組，第五組為補(bǔ)腎藥膳方低劑量藥膳組，第六組為骨疏康顆粒組，所有動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)組：補(bǔ)腎藥膳方食材：狗肉200 g，羊腎150 g，山藥30 g，枸杞30 g，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供。將上述食材清水洗凈后放入砂鍋，食材再加水2 000 mL，武火煮沸后，改用文火煲1 h，取湯汁，食材再加水煎煮1次，合并兩次煎煮湯汁，加熱濃縮至100 mL備用，為高劑量。

對(duì)照組：骨疏康顆粒，遼寧康辰藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20033255。成分是淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)、黃芪、丹參、木耳、黃瓜籽，20 g/d用于治療腎虛，氣血不足所致的中老年骨質(zhì)疏松癥，伴有腰脊酸痛，足膝酸軟，神疲乏力。

藥膳及藥物準(zhǔn)備均在湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 PMOP模型的建立

所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模，除正常組外，模型組、高劑量藥膳組、低劑量藥膳組、骨疏康組均用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），腹腔注射麻醉大鼠，無(wú)菌條件下從下腹部進(jìn)入腹腔，完整摘除雙側(cè)卵巢，切下卵巢送病理科經(jīng)病理切片證實(shí)卵巢正常。假手術(shù)組與模型組處理相同，但不切除雙側(cè)卵巢，僅切除卵巢周圍等體積的脂肪。對(duì)進(jìn)行手術(shù)的大鼠仔細(xì)止血，逐層縫合，并用青霉素（0.8 mL/250 g）腹腔注射3 d進(jìn)行抗感染治療。

1.4 動(dòng)物灌胃、觀察、取材

造模15 d后灌胃12周，正常組和假手術(shù)組、模型空白組用一般飼料飼養(yǎng)，藥膳組用補(bǔ)腎藥膳方灌胃，骨疏康顆粒組用骨疏康灌胃。陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組用藥劑量按人體給藥劑量的6.0倍計(jì)算[7]。高劑量組：濃縮補(bǔ)腎藥膳方湯汁100 mL，每mL含藥膳4.1 g，折算大鼠的給藥劑量為41 g/kg·d；低劑量組：在高劑量組的基礎(chǔ)上等比遞減，每mL含藥膳2.05 g，折算大鼠的給藥劑量為20.5 g/kg·d；骨疏康顆粒組：骨疏康顆粒成人1 d為20 g，折算大鼠的給藥劑量為2 g/kg·d。

實(shí)驗(yàn)過程中大鼠出現(xiàn)的死亡情況：模型組灌胃致死2只，高劑量組灌胃致死1只，標(biāo)本采集前共57只。大鼠在最后一次灌胃后禁食24 h，處死后立即取材。用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉（0.4 mL/100 g），麻醉后用碘伏消毒手術(shù)部位，消毒手術(shù)剪剪開腹腔，采集標(biāo)本。

用一次性采血針采集靜脈血。暴露腹主動(dòng)脈沿下腔靜脈方向采血，取血量：8 mL/只，血液在不含抗凝劑的試管中低溫（4 ℃）靜置4 h后低溫離心，3 000 g×30 min，取上層血清，按組別分裝，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用來檢測(cè)CTX-I。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清I型膠原C端肽（CTX-I）的含量水平。實(shí)驗(yàn)前將試劑盒及待測(cè)樣本放置室溫平衡20 min。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL。37 ℃孵育90 min棄去液體，甩干，每孔加入生物素化抗體工作液100 μL。37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，甩干并用配制好的濃縮洗滌液洗板3次，每孔加入酶結(jié)合工作液100 μL。37 ℃溫育30 min，棄去孔內(nèi)液體，甩干并洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光溫育15 min，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔顯示明顯梯度時(shí)，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程，根據(jù)方程計(jì)算每個(gè)樣本的濃度。病理切片統(tǒng)一采用光鏡下采圖并分析圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，劑量數(shù)據(jù)用“x±s”表示，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析及多重比較，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EIISA法檢測(cè)各組大鼠血清CTX-I濃度表達(dá)

與正常組和假手術(shù)組比較，模型組（高、低）劑量組，骨疏康組CTX-I濃度均升高（P<0.05），與模型組比較，補(bǔ)腎藥膳方高劑量組、補(bǔ)腎藥膳方低劑量組、骨疏康組CTX-I濃度均降低（P<0.05）；補(bǔ)腎藥膳方高、低劑量組、骨疏康組CTX-I濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 大鼠右股骨石蠟切片HE染色顯微形態(tài)

正常組：光鏡顯示骨小梁排列整齊、規(guī)則并連接成網(wǎng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔大小正常。假手術(shù)組：光鏡顯示骨小梁排列整齊、規(guī)則并連接成網(wǎng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔大小正常，與正常組類似。模型組：骨小梁明顯變細(xì)，出現(xiàn)明顯斷裂，有扭曲，形態(tài)結(jié)構(gòu)差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴(kuò)大融合明顯。高劑量組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列稍微規(guī)則，斷裂少，部分區(qū)域骨小梁間的間隙增大小于模型組，骨髓腔稍有擴(kuò)大。低劑量組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列規(guī)則，斷裂很少，形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，骨髓腔大小較正常。骨疏康組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列規(guī)則，斷裂很少，形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，骨髓腔大小較正常，與低劑量組類似。見圖1。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名，在中醫(yī)古文獻(xiàn)中并無(wú)“骨質(zhì)疏松”病名。但骨質(zhì)疏松所表現(xiàn)的腰背疼痛、頭眼昏花、易發(fā)生骨折等臨床表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制與中醫(yī)學(xué)中“骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”論述極為相似，因此通常將此病認(rèn)為是“骨痿”“骨痹”的范疇[8]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》謂骨痿“骨枯而髓減”，謂骨痹“腎脂枯不長(zhǎng)”，并未描述二者之間的不同。《金匱要略》中認(rèn)為骨痹是骨痿的進(jìn)一步發(fā)展。張從正從臨床表現(xiàn)說明了兩者的不同，認(rèn)為關(guān)節(jié)疼痛為主屬于骨痹，軟弱無(wú)力屬于骨痿，指出骨痿與骨痹應(yīng)當(dāng)區(qū)分來論治，提出以其寒熱區(qū)別病之新舊。這些論述對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松與骨痿、骨痹間的關(guān)系均有一定的參考價(jià)值。目前大多數(shù)研究者認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松仍舊屬于“骨痿”的范疇[9-10]。

目前PMOP公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制主要是腎虛[11-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PMOP的發(fā)生與腎臟關(guān)系密切，腎藏精，為先天之本，主骨主生髓，髓以養(yǎng)骨，骨的生發(fā)依賴于腎氣的滋養(yǎng)?！澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，“……腎病則骨極，牙齒苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利……”，“髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)……”，以上中醫(yī)理論均認(rèn)為腎精氣盛衰與骨強(qiáng)勁與否有著根本的聯(lián)系，若腎虛，骨髓便不能濡養(yǎng)骨骼，骨骼軟脆無(wú)力，出現(xiàn)疼痛，引發(fā)骨質(zhì)疏松。腎主宰著人體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖與女性的月經(jīng)潮止，女子二七而潮，七七而絕，說明隨著年齡的增長(zhǎng)腎精氣由盛轉(zhuǎn)衰，骨骼得不到充分的濡養(yǎng)，易造成骨質(zhì)丟失，引發(fā)骨質(zhì)疏松。因此補(bǔ)腎是防治骨質(zhì)疏松的基本立足點(diǎn)[13]。

本研究為保障實(shí)驗(yàn)同質(zhì)性，經(jīng)咨詢專家對(duì)食材予以組方：狗肉，羊腎，山藥，枸杞。狗肉為主藥，狗肉味咸、酸，性溫，有溫腎壯陽(yáng)，助氣力、補(bǔ)血脈的功效，且含有豐富的蛋白質(zhì)，容易吸收；羊腎為臣藥，羊腎味甘，性溫，補(bǔ)腎氣、益精髓；山藥和枸杞各為佐使藥，山藥性味甘、平，補(bǔ)脾養(yǎng)胃，益腎澀精；枸杞性味甘、平，養(yǎng)肝滋腎。以動(dòng)物類補(bǔ)腎藥為主，植物類補(bǔ)腎藥為輔，相互補(bǔ)充，增強(qiáng)療效，全方共奏補(bǔ)腎強(qiáng)骨生髓之效。陽(yáng)性對(duì)照組選取骨疏康進(jìn)行灌胃，有骨疏顆粒的前期研究表明其能有效治療OP，是常用的臨床經(jīng)驗(yàn)用方[14]。

大鼠的骨變化與人類有較多相似之處，目前公認(rèn)與臨床最接近的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是去卵巢大鼠模型。去勢(shì)后的大鼠雌激素缺乏致骨轉(zhuǎn)換率增加，成骨速率小于骨吸收速率，骨代謝平衡被破壞，單位體積內(nèi)骨組織量減少[15]。所以本研究對(duì)雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后切除大鼠雙側(cè)卵巢，導(dǎo)致大鼠雌激素水平降低，模擬由于雌激素水平缺乏而引起PMOP的臨床特征，實(shí)質(zhì)是復(fù)制婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型。本研究顯示，造模3個(gè)月后，與正常組和假手術(shù)比較，模型組、高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度均升高（P<0.05）；各組實(shí)驗(yàn)大鼠股骨在HE染色光鏡下形態(tài)也發(fā)生了變化，骨小梁明顯變細(xì)，出現(xiàn)明顯斷裂，有扭曲，形態(tài)結(jié)構(gòu)差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴(kuò)大融合明顯，認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功。

在PMOP的診斷、治療過程中，血清骨代謝指標(biāo)變化早于BMD的改變，有助于早期發(fā)現(xiàn)OP和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，是其診斷、判斷療效和調(diào)整治療方案有效而簡(jiǎn)便的方法[16]。近年，作為骨吸收指標(biāo)I型膠原降解時(shí)產(chǎn)生的末端肽及吡啶交聯(lián)物備受關(guān)注，I型膠原被降解量較少，當(dāng)骨代謝正常時(shí)，血中能檢測(cè)到的含量極微[17]。研究表明[18]I型膠原C端肽（CTX-I）是代表性較強(qiáng)的骨吸收標(biāo)志物之一，當(dāng)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)時(shí)，I型膠原降解也增高，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換加快，血中CTX-I水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度顯著降低（P<0.05），補(bǔ)腎藥膳方、骨疏康顆粒干預(yù)可降低PMOP大鼠血清CTX-Ⅰ濃度。其中低劑量組血清CTX-Ⅰ濃度雖低于高劑量組、骨疏康組，但差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可認(rèn)為補(bǔ)腎藥膳方各劑量之間對(duì)CTX-I濃度無(wú)明顯影響，與骨疏康顆粒療效相當(dāng)。

4 小結(jié)

隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，OP患者越來越多，合并骨折等并發(fā)癥發(fā)病率不斷增加，已成為老年人尤其是絕經(jīng)后女性常見的疾病之一，嚴(yán)重影響了其活動(dòng)能力和生活質(zhì)量[19]。女性絕經(jīng)后，雌激素水平急劇下降，骨重建失衡，加速骨量流失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。而PMOP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療方法眾多，目前應(yīng)用的西藥雖能取得良好的效果，但副作用較多，如胃腸道不良反應(yīng)、肝腎毒性等，甚至可產(chǎn)生耐藥性，費(fèi)用也較昂貴[20]，因此尋求更為安全、有效、經(jīng)濟(jì)適用的防治方法是臨床亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)“腎主藏精”理念為引導(dǎo)，依據(jù)“藥食同源”觀點(diǎn)，用經(jīng)過專家認(rèn)定的補(bǔ)腎藥膳方干預(yù)PMOP模型大鼠，觀察其對(duì)大鼠血清CTX-I濃度及骨形態(tài)的影響，為以后臨床上選擇科學(xué)有效的防治方案提供參考依據(jù)，而補(bǔ)腎藥膳方的食、藥材具有物美價(jià)廉、方便易取、易烹調(diào)、口感好的優(yōu)點(diǎn)，值得提倡。

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