鋅—α2—糖蛋白在高尿酸血癥模型小鼠腎臟中表達的變化

劉李玟韜 楊潔 陳秉樸

〔摘要〕 目的 以高尿酸血癥模型小鼠為研究對象，探討血清尿酸水平與腎臟組織中鋅-α2-糖蛋白（ZAG）的相關性，以尋求防治高尿酸血癥的新靶點。方法 將20只SPF級昆明小鼠隨機分為模型組和空白對照組，97%氧嗪酸鉀鹽按0.5 g/（kg·d）腹腔注射，建立高尿酸血癥小鼠模型，造模7 d后，尾靜脈采血檢測血清尿酸（SUA）水平確定模型建立成功，利用Western Blotting及實時熒光定量PCR技術檢測腎臟中ZAG mRNA及蛋白水平。結果 與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織ZAG mRNA及蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 血清尿酸可能影響腎臟ZAG的水平，但是ZAG與尿酸互相影響的具體機制仍需進一步研究。

〔關鍵詞〕 鋅-α2-糖蛋白；高尿酸血癥；腎臟；小鼠

〔中圖分類號〕R259；R589.7 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.005

〔Abstract〕 Objective To explore the correlation between serum uric acid and kidney zinc-α2-glycoprotein（ZAG） in hyperuricemia mice model， in order to seek a new potential target for prevention and treatment of hyperuricemia. Methods 20 SPF Kunming mice were randomly divided into hyperuricemia model group and control group， 97 % sylvite acid potassium salt of 0.5 g/（kg·d） was injected into the abdominal cavity. The hyperuricemia mice model was confirmed by the serum uric acid （SUA） level 7 days later. The levels of ZAG mRNA and protein were detected by Western blotting and real-time fluorescence quantitative. Results Compared with the blank group， the levels of ZAG mRNA and protein in the kidney tissue in the model group increased， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Serum uric acid may affect the level of ZAG， and the correlation mechanism between ZAG and uric acid needs to be further explored.

〔Keywords〕 zinc-α2-glycoprotein； hyperuricemia； kidney； mice

血液中尿酸（uricemia，UA）濃度超出正常范圍的病態(tài)改變稱高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）。正常情況下，血尿酸鹽飽和度為6.7 mg/dL，國際上HUA診斷標準為血清尿酸（Serum uric acid，SUA）水平男>420 μmol/L（7 mg/dL），女>357 μmol/L（6 mg/dL））。目前，美國HUA患病率21%[1]，中國患病率13%至25%[2]。HUA在許多人類疾病如痛風、心血管疾病、糖尿病和腎臟疾病的病理生理過程中起著重要的作用，HUA的防治能控制多種代謝性疾病的發(fā)生。本課題組前期研究結果表明鋅-α2-糖蛋白（zinc alpha-2 glycoprotein，ZAG）的表達變化與SUA水平密切相關[3-4]。本研究在前期研究基礎上，進一步探討ZAG在HUA模型小鼠腎臟中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級昆明種雄性小鼠30只，由右江民族醫(yī)學院動物實驗中心提供，體質(zhì)量（25±2） g。實驗動物生產(chǎn)證號：SCXK桂2017-0003，使用證SYXK桂-0004。

1.1.2 試劑與儀器 實時熒光定量PCR相關試劑購自天根生化科技（北京）有限公司：FastKing RT kit（With gDNASE， Lot#Q5607）、 Buffer RZ（Lot#Q5208）、 Super Real Premix Plus（STBR GREEN， Lot#P5219）、RNAsimple Total RNA Kit（Lot#Q5414）；購置Santa Cruz ZAG蛋白一抗（Lot#G1006）：購自Santa Cruz小鼠抗β-Actin（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號16AV0212）、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：127655）；多管架自動平衡離心機L530（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），臺式高速冷凍離心機1-15PK（SIGMR公司），超微量紫外分光光度計P360，熒光定量PCR儀LightCycler 96，全自動酶標儀Multiskam MK3（美國Thermo公司），PRC儀（美國伯樂PTC-200），全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司JS-680B）。

1.1.3 動物模型復制方法 20只SPF級昆明種雄性小鼠隨機分為空白對照組（normal uric acid，NUA）、HUA模型組，每組10只。用97%氧嗪酸鉀鹽（尿酸酶抑制劑）按0.5 g/（kg·d）腹腔注射建立HUA小鼠模型[4]，每日1次，連續(xù)7 d。第7天通過尾靜脈采血檢測SUA及血脂水平評判造模是否成功，空白對照組用等體積生理鹽水腹腔注射。

1.1.4 標本采集 造模成功后，采用斷頸法處死各組小鼠，腹部正中切口取腎臟組織，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計合成 在NCBI 上搜索相關基因，上海生工生物工程技術有限公司合成ZAG及GAPDH內(nèi)參引物。ZAG上游引物序列：5'-GTG ACA ACT ACC AGC CGT GT-3'，下游引物序列： 5'-TTG TTG GCC TTG TTC CAG TG-3'，大小107 bp；內(nèi)參基因上游引物序列： 5'-GGT TGT CTC CTG CGA CTT CA-3'，下游引物序列： 5'-TGG TCC AGG GTT TCT TAC TCC-3'，大小138 bp。

1.2.2 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應 取室溫平衡-80 ℃保存的100 mg小鼠腎臟組織樣本置于研缽中，加入液氮充分研磨至粉末，加1 mL Buffer RZ在15～30 ℃放置5 min分離核蛋白與核酸，低溫離心取上清轉(zhuǎn)入一個新的無RNase的離心管中，加氯仿震蕩混勻，室溫靜置5 min，4 ℃離心，取上水相液轉(zhuǎn)移到新管中，然后緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，將得到溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，4 ℃離心，棄廢液，加入500 μL去蛋白液RD低溫離心，棄廢液，加入500 μL漂洗液RW離心，棄廢液（重復1次），吸附柱放入2 mL收集管中去除殘余液體，充分晾干。于冰上加入適量的RNase-free水溶解4 ℃離心。立刻用紫外分光光度計進行檢測其mRNA濃度及OD260/OD280比值。取RNA濃度<1 μg/mL進行逆轉(zhuǎn)錄反應。方法參照天根試劑公司說明書。合成的cDNA置于-20 ℃低溫保存。

1.2.3 實時熒光定量PCR 提取小鼠腎臟組織總RNA，測定濃度后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR反應試劑盒于熒光定量PCR儀上檢測目的基因mRNA表達量。PCR擴增后選擇基線，以正常組小鼠為校正對象，根據(jù)Ct值依次計算基因的相對表達量，采用2-△△Ct法計算結果。反應體系20 μL，內(nèi)含2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，10 μM 的上下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，其余加無酶水補足。設置3個復孔。反應條件：預變性95 ℃ 15 min，變性95 ℃10 s，退火/延伸60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)（熒光定量PCR儀擴增）。

1.2.4 Western Blotting技術檢測ZAG表達 碾磨組織，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度調(diào)整上樣濃度，之后將蛋白變性保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笾苽銼DS-PAGE膠，蛋白上樣，在110V恒壓下進行電泳，條帶均勻出現(xiàn)后在300 mA恒流下進行濕轉(zhuǎn)，約1 h。封閉液封閉后4 ℃搖床孵育一抗（濃度1∶500）過夜，洗膜，加二抗（濃度1∶5 000）室溫孵育1.5 h，再次洗膜后暗室曝光，凝膠圖像系統(tǒng)分析目標蛋白灰度值，樣本蛋白含量以目的條帶與內(nèi)參條帶的積分吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“x±s”表示。方差齊時組間比較采用t檢驗 ，方差不齊用多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法，即H值檢驗），以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生化指標檢測結果

HUA模型組甘油三酯（TG）及SUA水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），HUA模型組總膽固醇（TC）、肌酐（CREA）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）無明顯升高（P>0.05）。見表1。

2.2 HUA模型小鼠腎臟ZAG蛋白水平檢測結果

結果顯示，模型組小鼠腎臟組織ZAG蛋白水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2和圖1。

2.3 HUA模型小鼠腎臟ZAG mRNA表達水平檢測結果

結果顯示，模型組小鼠腎臟組織ZAG mRNA水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

3.1 高尿酸腎損傷機制

尿酸是嘌呤衍生物，低級動物體內(nèi)的尿酸氧化酶將尿酸分解為溶于水的尿囊素以排出體外，但人類在進化過程中，因尿酸氧化酶基因發(fā)生突變而失活，不能生成尿囊素，只能以尿酸排出體外。人體內(nèi)尿酸2/3經(jīng)腎臟排出，1/3通過糞便和汗液排出。SUA水平取決于腎小管功能的完整性和腎小管上皮細胞中尿酸轉(zhuǎn)運體的表達。尿酸通過直接和間接的方式造成體內(nèi)的各種損傷，同時有抗氧化和促氧化作用，在肥胖狀態(tài)下則為促氧化作用，可促進成熟脂肪細胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶的活性及ROS的產(chǎn)生，且尿酸可激活脂肪細胞的局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin-System，RAS）產(chǎn)生活性氧簇（ROS），ROS的產(chǎn)生及尿酸直接或間接使得機體產(chǎn)生炎癥反應。而細胞線粒體ROS合成增多，膜電位下降，線粒體相關蛋白prohibitin表達下調(diào)，激活線粒體途徑導致細胞凋亡[5]，同時也可引起炎癥因子釋放進一步增加，血管內(nèi)皮細胞損傷進一步加重。尿酸過多會導致一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）降低，抑制一氧化氮釋放[6]，影響血管內(nèi)皮功能。尿酸可導致細胞線粒體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失衡從而介導炎癥反應[7]。在尿酸產(chǎn)生過程中，因黃嘌呤氧化酶作用，產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基（O2-），啟動自由基生成連鎖反應，進一步造成組織損傷。這些炎癥因子和炎癥反應都可損害腎臟。大量的研究表明，在高尿酸環(huán)境下，尿酸結晶可通過阻塞腎小管引發(fā)炎癥反應、影響血糖代謝、升高血壓及誘導細胞凋亡等造成腎臟血管、腎小球、腎小管結構及功能異常[8]。

3.2 模型選擇

靈長類動物與人有相似的尿酸代謝途徑，但因價格昂貴而失去實驗優(yōu)勢，故現(xiàn)階段常用造模動物是嚙齒類大鼠、小鼠?！馐髠€體之間血UA值波動較大，考慮與♀鼠激素分泌波動有關。HUA模型復制主要是干擾嘌呤和尿酸代謝，但直接補充尿酸造模與人原發(fā)性HUA發(fā)病原因及發(fā)病機制大相徑庭。增加UA前體物質(zhì)雖可使SUA升高，但人類因內(nèi)源性嘌呤產(chǎn)生過多所致的HUA僅占10%～15%，人HUA以腎臟排泄尿酸減少型為主。在造模過程中，長時間SUA升高可反饋性地引起尿酸酶表達增多與活性升高，連續(xù)給藥一段時間后SUA不升反降。且長時間和大劑量使用抑制UA排泄劑和模型SUA水平顯著升高時腎損害更加明顯，腎損害既有屬于造模藥物的副反應者，也有屬于高尿酸血癥導致的并發(fā)癥，這對考察造模效果和判斷肯定因素或否定因素存在一定困難[9]。故本實驗以♂小鼠為模型動物，采用抑制尿酸排泄法連續(xù)造模7天，造模成功后小鼠腎臟沒有明顯損害。

3.3 ZAG與高尿酸血癥

脂肪組織可分泌瘦素（Leptin）、脂聯(lián)素（Adiponectin）、血管緊張素原（Angiotensinogen）、抵抗素（Resistin）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（Plasminogen activator inhibitor-1）、白介素-6（Interleukin-6）等，這些統(tǒng)稱為脂肪因子，通過多種途徑參與復雜的代謝過程，在HUA發(fā)病機制中發(fā)揮作用[10]。

1961年，Burgi等[11]最先從人血清中分離得到的一種 43 u的可溶性的能被鋅鹽沉淀并與血漿α2球蛋白的電泳遷移率相似的糖蛋白，故名ZAG。人與小鼠的ZAG在氨基酸序列方面，具有59%的同源性，在與脂代謝密切相關的特殊區(qū)域有100%的同源性[12]。ZAG大量分布于人和小鼠具有分泌功能的正常上皮細胞胞漿的白色及棕色脂肪組織中[13]。HUA與代謝綜合征（metabolicsyndrome）的許多因素如肥胖、脂代謝異常、高血壓及胰島素抵抗等密切相關，常與肥胖、高脂血癥及高血壓病等合并存在[14]。ZAG既然已經(jīng)被確認為脂肪細胞分泌的一種新型脂質(zhì)動員因子，必然與脂代謝相關，研究表明，ZAG mRNA水平與肥胖度和胰島素抵抗參數(shù)呈負相關，與脂聯(lián)素含量呈正相關，與瘦素mRNA水平呈負相關，重組ZAG能促進脂聯(lián)素從人脂肪細胞釋放[15]。外源性TNF-A和IL-6均能抑制分化成熟的脂肪細胞中ZAG基因的表達[16-17]。據(jù)此推測，ZAG通過協(xié)調(diào)多種信號轉(zhuǎn)導途徑和其他脂肪細胞因子，參與代謝的調(diào)控，影響HUA發(fā)生，也就是說HUA狀態(tài)下ZAG的表達發(fā)生改變。于是，我們開展了ZAG和HUA相關性研究，結果證實了HUA小鼠血清ZAG濃度升高， SUA值與ZAG呈正相關，同時脂代謝紊亂[3-4]。

3.4 ZAG在腎臟中的表達

ZAG既然大量存在于具有分泌功能的上皮細胞組織中，那么腎小管的上皮細胞組織中同樣會存在ZAG，當腎發(fā)生損害時，腎臟中的ZAG表達也會發(fā)生改變。Gohda等[18]的研究證實，肥胖糖尿病小鼠模型KK/Ta小鼠肝臟和腎臟組織中ZAG mRNA的表達比正常BALB/c小鼠增高，比較第8周和第20周時KK/Ta小鼠腎臟組織中ZAGm RNA水平發(fā)現(xiàn)，隨著喂養(yǎng)時間延長，ZAG水平進一步增高?；贖UA和ZAG都與肥胖糖尿病、脂代謝紊亂相關，并且高尿酸損害腎臟。因此，有理由推測在HUA與ZAG相關及HUA模型腎臟中的ZAG表達發(fā)生改變。于是，我們前期開展了ZAG和HUA相關性研究，在證實HUA小鼠血清ZAG濃度升高，SUA值與ZAG呈正相關[3-4]的基礎上，進一步開展HUA模型小鼠腎臟中表達變化的研究。

本實驗通過HUA模型組小鼠與空白對照組小鼠ZAG條帶灰度值對比，發(fā)現(xiàn)高尿酸小鼠模型腎臟的ZAG是上升的，RT-PCR結果也表明HUA模型組小鼠腎臟ZAG mRNA水平高于空白對照組小鼠，表明腎臟細胞分泌ZAG?？梢酝茰y，腎臟分泌ZAG，同時在7 d模型小鼠中ZAG表達上高，且脂代謝代謝紊亂，尤以甘油三酯明顯，表明尿酸可能通過影響甘油三酯的代謝引起ZAG蛋白的變化，但是ZAG與尿酸互相影響的具體機制仍需進一步研究。

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