牛白藤葉中繡球酚的分離及含量測定

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摘要：目的 對牛白藤葉中的繡球酚進行分離鑒定并建立其含量測定方法，為牛白藤藥材的進一步開發(fā)研究提供參考，同時對不同產地、不同批次牛白藤葉中繡球酚的含量進行比較。方法 采用HPLC，使用Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氫銨（用磷酸調節(jié)pH值至3.0）=33∶67，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長350 nm。結果 繡球酚在0.412～10.300 μg范圍內線性關系良好（r=1.000 0）；平均回收率為99.09%（RSD=0.53%）；精密度及重復性均良好，RSD均小于1%。不同產地及批次牛白藤葉中繡球酚含量為0.03%～0.38%，其中廣西產含量最高。結論 本研究建立的方法操作簡便、準確，專屬性強，重復性好，可用于牛白藤葉中繡球酚的含量測定；不同產地、不同批次牛白藤葉中繡球酚含量差異較大，其中廣西、廣東產牛白藤中繡球酚含量較高。

關鍵詞：牛白藤；繡球酚；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0094-04

Abstract： Objective To conduct isolation identification of hydrangenol and establish a method for content determination of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea （DC） Merr； To provide references for further development and research of Hedyotis hedyotidea； To compare the contents of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches. Methods Hydrangenol showed a good linear relationship within the range of 0.412–10.300 μg （r=1.000 0）， with the average recovery of 99.09% （RSD=0.53%）. Good precision and repeatability were achieved with the RSDs smaller than 1.0%. The content range was 0.03%–0.38% for hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches， and the highest contents appeared in those from Guangxi. Conclusion The method is simple， accurate， specific， reproducible and can be used for the content determination of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea； the contents of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches are different， and contents in samples from Guangxi and Guangdong are higher.

Keywords： Hedyotis hedyotidea （DC） Merr； hydrangenol； content determination

牛白藤為茜草科耳草屬植物牛白藤Hedyotis hedyotidea（DC）Merr的干燥藤莖，又名牛奶藤、土加藤、甜茶，為兩廣地區(qū)民間習用中草藥。其味微甘，性涼，歸脾、肝經，功效清熱解毒、祛風活絡、消腫止痛，用于感冒發(fā)熱、肢體筋骨酸痛、風濕痹痛、跌打損傷。葉可清熱解暑，用于感冒風熱咳嗽、濕熱泄瀉[1]。

近年文獻報道，從牛白藤的干燥藤莖中分離得到吐葉醇、樺木酮酸、白樺脂酸、白樺醇、表白樺脂酸、烏蘇酸等[2]多種化合物，從干燥莖葉中分離得到莨菪亭、羽扇豆醇、表白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸和咖啡酸[3]等化合物，并分別對其抗炎活性及免疫抑制活性進行了研究[4-5]，但關于牛白藤葉中化學成分的含量測定方法目前鮮有報道，且亦未發(fā)現有從牛白藤葉中分離出繡球酚的相關報道。筆者從牛白藤干燥葉中分離得到繡球酚，由于該化合物具有降糖、抑菌和抗過敏活性[6]，進一步建立了測定牛白藤葉中繡球酚含量的HPLC方法，旨在為牛白藤葉的進一步開發(fā)研究提供參考。

1 儀器與試藥

Bruker Avance 600M超導核磁共振儀，瑞士Bruker Corporation；Applied Biosystems API 4000 EI/ESI質譜儀，美國Life Technologies；Buchi C-605中壓泵系統(tǒng)，瑞士Buchi公司；Waters高效液相色譜儀（Waters 600E泵，Waters 2996PDA檢測器，Waters四元在線脫氣機，Waters717plus自動進樣器，Empower色譜工作站），美國Waters公司；AT261電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ2200D型數控超聲波清洗器，鄭州南北儀器設備有限公司。

牛白藤葉購自亳州中藥材市場，經山東省中醫(yī)藥研究院林惠彬研究員鑒定為牛白藤Hedyotis hedyotidea （DC）Merr的干燥葉。繡球酚對照品（純度99.2%），上海寶曼生物科技有限公司；乙腈（色譜純），超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 繡球酚的分離與鑒定

2.1.1 提取與分離

取牛白藤干燥葉500 g粉碎成粗粉，加水提取2次，合并提取液，減壓濃縮至密度為1.14（60 ℃），加乙醇使醇濃度達到60%，0～2 ℃冷藏24 h，過濾，濾液減壓濃縮得浸膏；將浸膏用甲醇溶解，加入硅膠拌樣，干燥后進行柱層析分離。經石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)進行梯度洗脫，在薄層色譜參考下合并洗脫液，其中石油醚-乙酸乙酯（89∶11～87∶13）段經乙醇反復重結晶得化合物Ⅰ（白色晶體，1.0 g）。

2.1.2 結構鑒定

化合物Ⅰ：白色晶體，mp.179～181 ℃；1HNMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：3.14（1H，dd，J=2.4，16.8 Hz，H-4a），3.51（1H，brd，J=16.8Hz，H-4b），5.67（1H，brd，J=2.4 Hz，H-3），6.81（2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5'），6.88（1H，d，J=7.2 Hz，H-5），6.90（1H，d，J=7.2 Hz，H-7），7.34（2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6'），7.53（1H，dd，J=7.2，7.2Hz，H-6），9.65（1H，s，OH），10.93（1H，s，OH）；13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：33.9（C-4），80.9（C-3），108.9（C-8a），115.6（C-3'，5'），115.9（C-7），118.8（C-5），128.7（C-2'，6'），128.9（C-1'），136.8（C-6），141.1（C-4a），158.2（C-4'），161.4（C-8），169.8（C-1）；ESI-MSm/z 257[M+1]+，274[M+NH4]+。綜合上述信息與文獻報道[6-7]，確定化合物Ⅰ為繡球酚。

2.2 繡球酚的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氫銨（用磷酸調節(jié)pH值至3.0）=33∶67；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：350 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 樣品預處理

取1001批藥材粉末（過2號篩）約1.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加入25 mL甲醇、乙醇、70%乙醇、水，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用相應溶劑補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果甲醇、乙醇作為溶劑提取的繡球酚含量較高，測定結果差異不大，綜合考慮其他因素，選擇乙醇作為提取溶劑。

取1001批藥材粉末（過2號篩）4份，每份約1.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加入乙醇25 mL，稱定質量，2份加熱回流1 h，2份超聲處理（100 W，50 Hz）30 min，分別放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果回流提取所得繡球酚含量較高，因此選擇回流提取。

取1001批藥材粉末（過2號篩）約1.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入乙醇25 mL，分別加熱回流0.5、1、2 h，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果回流1 h測得的繡球酚含量明顯高于0.5 h，2 h與1 h無明顯差異，因此選擇回流時間為1 h。

提取溶劑、提取方法、回流時間考察結果見表1。

2.2.3 溶液的制備

2.2.3.1 對照品溶液的制備

取繡球酚對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3.2 供試品溶液的制備

取藥材粉末（過2號篩）約1.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上有相同保留時間的色譜峰。

2.2.5 線性關系考察

取繡球酚對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液，作為對照品貯備液，分別精密吸取對照品貯備液適量，加乙醇配制成不同濃度的對照品溶液。精密吸取上述不同濃度對照品溶液各10 ?L（分別含繡球酚0.412、0.824、1.648、2.060、3.090、4.120、10.300 ?g）注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標、對照品含量（?g）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1 034 893.9X-34 011.6，r=1.000 0。結果表明繡球酚在0.412～10.300 μg范圍內與峰面積呈現良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗

取“2.2.5”項下濃度為0.206 0 mg/mL的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 ?L，測得峰面積RSD=0.21%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

取按“2.2.3”項下方法制備的對照品和供試品溶液，分別于配制后室溫放置0、1、2、4、8、12、24 h時精密吸取10 ?L，注入液相色譜儀進行測定，測得繡球酚對照品及供試品溶液峰面積的RSD分別為0.34%、0.53%。結果表明，對照品及供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗

取樣品（批號1101）粉末6份，精密稱定，按“2.2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 ?L注入液相色譜儀測定，測得繡球酚平均含量為0.36%，RSD=1.01%。表明本法具有良好的重復性。

2.2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號1101）細粉9份，各約0.75 g，精密稱定，分為3組，每組3份，按已知含量的80%、100%、120%分別加入2.70 mg/mL繡球酚對照品溶液0.8、1、1.2 mL，再按“2.2.3.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果繡球酚平均回收率為99.09%，RSD=0.53%，見表2。

2.3 樣品含量測定

取不同產地、不同批次樣品，分別粉碎，過2號篩，按“2.2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，計算繡球酚含量，結果見表3。

3 討論

研究表明，繡球酚在四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型試驗中表現出良好的抗糖尿病活性，且KK-Ay小鼠服用繡球酚200 mg/（kg·d）后，2周內血糖和游離脂肪酸水平明顯降低[8]；此外，還有良好的抗菌和抗過敏作用[9]。但目前尚未見采用HPLC測定藥材中繡球酚含量的相關研究報道，因此，本研究建立了牛白藤葉中繡球酚的HPLC含量測定方法。

本試驗分別比較了4種不同提取溶劑、超聲和加熱回流2種提取方法，并在此基礎上對回流提取時間進行了考察，最終確定采用乙醇加熱回流提取1 h的方法可將牛白藤葉中繡球酚提取完全，且該方法簡便、合理、可操作性強。

本研究結果顯示，廣西產牛白藤葉中繡球酚平均含量約為0.3%，廣東產者含量約為0.27%，而云南、貴州產者含量較低，說明不同產地、不同批次牛白藤葉中繡球酚的含量差異較大，該結果可為牛白藤藥材質量標準的制定以及制劑研究提供依據。此外，廣東省中藥材標準中收錄牛白藤全年可采，本研究未對不同采摘季節(jié)牛白藤葉的繡球酚含量進行研究，因此，尚不能確定其葉中的繡球酚含量差異是否與采摘季節(jié)具有相關性，有必要對其進一步研究，以便更好地確定其采摘季節(jié)及原料產地，為牛白藤葉的開發(fā)研究提供依據。

本研究建立的牛白藤中繡球酚的HPLC含量測定方法操作簡便、靈敏、準確、專屬性強、重復性好，可為繡球酚的含量測定研究提供參考。

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（收稿日期：2017-09-26）

（修回日期：2017-10-18；編輯：陳靜）