金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法的建立

李丹丹，徐義剛，邱索平，王昱，高會(huì)江，高慎陽

1(海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？冢?70311)　2(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150001)　3(從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，從化，510900)　4(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶，404100)　5(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京，100193)　6(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州，121001)

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金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法的建立

李丹丹1，徐義剛2*，邱索平3，王昱4，高會(huì)江5，高慎陽6

1(海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?，570311)2(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150001)3(從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，從化，510900)4(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶，404100)5(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京，100193)6(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州，121001)

摘要為建立檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的快速檢測方法，以SA Sa442基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)合成引物及TaqMan探針，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測SA的方法。結(jié)果顯示，對(duì)16株試驗(yàn)菌株進(jìn)行熒光PCR檢測，只有SA檢測為陽性，表明該檢測方法特異性強(qiáng)；該方法的靈敏度為7.5 CFU/mL，利用該檢測方法對(duì)采集的175份樣品進(jìn)行檢測，共計(jì)檢出5份SA陽性樣品，與國標(biāo)法(GB 4789.10—2010)檢測結(jié)果一致，顯示了良好的實(shí)用性。該檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有良好的實(shí)用性。

關(guān)鍵詞金黃色葡萄球菌;Sa442基因;實(shí)時(shí)熒光PCR

食源性致病菌是危害食品安全和人類健康的主要因素，由食源性致病菌感染引發(fā)的食品安全問題是全球性的重大公共衛(wèi)生問題。我國流行的食源性疾病中，細(xì)菌性食物中毒居首位，因此，食源性致病菌檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個(gè)重要的部分[1-2]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)是一種危害程度比較高的食源性致病菌，在水、空氣及人和動(dòng)物的排泄物中分布廣泛[3-5]。人類進(jìn)食被SA污染的食品主要會(huì)引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等疾病[6-7]。近年來我國由SA感染引發(fā)的食源性中毒事件常有發(fā)生，是我國食品安全檢測的必檢項(xiàng)目之一[8]。因此，建立快速并且準(zhǔn)確的檢測方法對(duì)防止SA的感染和提高SA的檢測效率具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線檢測，精準(zhǔn)度、靈敏度和特異性均高于常規(guī)PCR檢測方法，同時(shí)適用范圍廣泛，目前已經(jīng)成為一種常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)[9]。本研究利用該技術(shù)，建立了SA實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法，為快速準(zhǔn)確檢測SA提供有力的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌 、志賀菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌 、溶藻弧菌、副溶血弧菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株，購于美國典型菌種保藏中心。

1.1.2臨床樣本

肉類、果蔬類、鮮牛奶和雞蛋等臨床樣本共計(jì)175份來自于農(nóng)產(chǎn)品、畜產(chǎn)品流通市場，包括凍豬舌、鮮牛肉、鮮雞肉、鮮豬肉、生牛奶、水果、蔬菜、雞蛋和熟食等樣品。

1.1.3主要試劑及儀器

細(xì)菌培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基BPW，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2，寶生物工程大連有限公司；ABI 7500 Real-time PCR儀。

1.2方法

1.2.1引物、探針設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 公布的SA Sa442基因序列(GE322238.1)中的保守序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測引物和TaqMan探針各一對(duì)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

引物序列：F: TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA

R: GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT

探針序列：Fam- CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT -TAMRA

1.2.2DNA模板的制備

試劑盒法提取細(xì)菌DNA，主要用于靈敏度試驗(yàn)，具體操作詳見說明書。

煮沸法提取細(xì)菌DNA，主要用于特異性試驗(yàn)和實(shí)踐檢測。方法：樣品經(jīng)過處理勻漿后，均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，取1 mL培養(yǎng)菌液，100 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入150 μL無菌水，混勻，沸水浴10 min，100 000 r/min 離心5 min，取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系25 μL：rTaq酶(5U/μL) 用量范圍0.25～1 μL，以0.25 μL遞增；Mg2+(25 mmol/μL) 用量范圍2～5 μL，以每0.5 μL遞增；dNTP (2.5 mmol/μL )用量范圍1.0～3.0 μL，以0.50 μL遞增；探針(20 μmol/μL)用量范圍0.1～0.5 μL，以每0.1 μL遞增；引物(10 pmol/μL)的用量范圍0.5～1.0 μL，以0.1 μL遞增。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序

95 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s(此步驟收集熒光信號(hào))，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號(hào)，每次試驗(yàn)均包括陰性對(duì)照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測試驗(yàn)

將已提取的DNA，利用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性檢測試驗(yàn)

將菌體濃度約為7.5×106CFU/mL的SA進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用試劑盒提取每個(gè)稀釋度SA的基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定檢測方法的靈敏度。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的初步應(yīng)用

將采集來的175份樣品(10份凍豬舌、10份鮮牛肉、20份鮮雞肉、10份鮮豬肉、25份生牛奶、20份水果、20份蔬菜、35份雞蛋和25份熟食)經(jīng)過處理勻漿后，均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，增菌液煮沸法提取DNA 并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測，所得檢測結(jié)果用國標(biāo)法(GB 4789.10—2010)進(jìn)行復(fù)檢，以驗(yàn)證所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的可靠性。

2結(jié) 果

2.1SA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立

通過對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中各項(xiàng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了SA最佳實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)模式。在25 μL反應(yīng)體系中含有：rTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，Mg2+(25 mmol/μL)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)2.0 μL，探針(20 μmol/μL)0.3 μL，上、下游引物濃度(10 pmol/μL)1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，DEPC水補(bǔ)充至25 μL。利用建立的方法對(duì)SA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，獲得了最低的CT值和較高的熒光強(qiáng)度增加值，表明所建立的檢測方法能夠應(yīng)用于對(duì)SA的檢測。

圖1　SA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立Fig.1　Development of a dual real- time PCR reaction system

2.2特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果

利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法對(duì)1.1.1節(jié)中的菌株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：SA標(biāo)準(zhǔn)菌株及其分離株擴(kuò)增后出現(xiàn)了典型的擴(kuò)增曲線，判定為陽性；而其他菌株和空白對(duì)照則出現(xiàn)平直的線或者是不規(guī)則曲線，判定為陰性(如圖2)。

圖2　SA實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性結(jié)果Fig.2　Specificity of a dual real-time PCR reaction system

2.3熒光定量PCR 的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將濃度約為7.5×106CFU/mL的SA進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用試劑盒提取每個(gè)稀釋度SA的基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定檢測方法的靈敏度，檢測結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知，原始菌液稀釋至10-6時(shí)仍能檢出，表明本檢測方法對(duì)SA的檢測靈敏度約為7.5 CFU/mL。

1～7: 菌體濃度分別為7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×101、7.5×100 CFU/mL圖3　SA熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　The standard curve of the real-time PCR from SA

2.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測臨床樣品的試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的SA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對(duì)175份樣本進(jìn)行了檢測，檢出5份SA陽性樣本，將175份樣本經(jīng)國標(biāo)法(GB 4789.10—2010)進(jìn)行復(fù)檢，兩種方法檢測結(jié)果的一致率為100%，顯示該方法具有很好的應(yīng)用性。

3討論

目前，包括我國在內(nèi)的絕大多數(shù)國家針對(duì)食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)檢測方法存在檢測效率低、靈敏度低且耗時(shí)長、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細(xì)菌需要一周的時(shí)間，而針對(duì)一些生化特性復(fù)雜的細(xì)菌，檢測周期比較長[10]，嚴(yán)重影響了檢測效率，很難滿足現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要。

LAMP法，是近年來剛剛興起的一種檢測方法，在某種程度上提高了檢測效率，降低了檢測成本；PCR技術(shù)在病原體核酸檢測方面應(yīng)用廣泛，靈敏度和特異性都比較高，但是LAMP和PCR這兩種檢測方法都存在著假陽性率比較高的問題[11]。相對(duì)而言，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅具有靈敏、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)PCR方法相比，特異性、靈敏度都更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，無需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，有效地解決了PCR產(chǎn)物易污染造成的假陽性和不能準(zhǔn)確定量的問題。該項(xiàng)技術(shù)已發(fā)展成為一種較成熟的分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)，目前國內(nèi)的科研和檢測機(jī)構(gòu)都配備了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測儀，并為廣大用戶所接受，應(yīng)用于實(shí)際檢測工作中。

目前，對(duì)食品病原細(xì)菌致病機(jī)理的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多與致病相關(guān)的基因，這些基因大多是該菌所特有的，此外一些編碼獨(dú)特的酶或其他代謝產(chǎn)物的基因也具有高度保守性[12-13]，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測病原細(xì)菌的關(guān)鍵是選擇這些特異的保守基因作為靶基因，設(shè)計(jì)合適的引物。靶基因的選擇原則包括各菌種(或?qū)?的擴(kuò)增靶基因應(yīng)具有種屬特異性，即種(或?qū)?共有，而種(或?qū)?間特異。MARTINEAU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，用核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A I 對(duì)SA不同菌株的基因組DNA 進(jìn)行消化，均可得到1個(gè)命名為Sa442的片段，盡管對(duì)該片段的研究得不是很詳盡，但已經(jīng)有研究[15-16]證實(shí)了Sa442片段是SA高度保守的特異序列。因此本研究選擇SA高度保守的Sa442基因?yàn)榘谢?，建立了SA實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法，確立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的最佳反應(yīng)條件。利用建立的檢測方法對(duì)15種不同菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果只有SA及其分離株出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，為陽性；而其他菌株未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，為陰性；說明本研究所建立的檢測方法具有很好的特異性。本研究SA檢測的靈敏度與牟曉峰等[17]和魏秀萍等[18]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測的靈敏度進(jìn)行比較，這3種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏度相當(dāng)，都具有比較高的靈敏度。對(duì)175份臨床樣本進(jìn)行了檢測，檢出5份SA陽性樣本，將175份臨床樣本經(jīng)國標(biāo)法(GB 4789.10—2010)進(jìn)行復(fù)檢，兩種方法檢測結(jié)果的一致率為100%。本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法為SA快速精準(zhǔn)的檢測提供了可靠的技術(shù)手段，適合在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)、食品安全監(jiān)管部門及食品加工部門推廣應(yīng)用。

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Development of a dual real-time PCR method for rapid detection ofStaphylococcusaureus

LI Dan-dan1,XU Yi-gang2*,QIU Suo-ping3,WANG Yu4,GAO Hui-jiang5,GAO Shen-yang6

1(Technical Center of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570311,China)2(College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150001,China)3(Conghua Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Conghua 510900,China)4(Technical Center of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bure, Chongqing 404100,China)5(Laboratory of Bovine Tenetics and Breeding, Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)6(Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

ABSTRACTTo establish a rapid assay for Staphylococcus aureus (SA) detection, a dual real-time PCR method targeting Sa442 gene of SA was developed. The results from dual real-time PCR of 16 bacteria strains showed that only SA is positive, indicating that the method had high specificity. In addition, the sensitivity of dual real- time PCR was 7.5 cfu/mL. Furthermore, a total 5 positive samples for SA were detected from 175 clinical samples by the real-time method, which was in accordance with the testing result obtained by GB 4789.10—2010 standard detection protocol. Therefore, the real-time method should be a novel rapid and sensitive detection method for SA infection.

Key wordsstaphylococcus aureus (SA);Sa442gene;real-time PCR

收稿日期：2015-06-30，改回日期：2015-11-10

基金項(xiàng)目：海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)(2015SF29)；國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2013IK031,2013IK051, 2015IK089)；重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014yykfA80017)；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(ZDXM20130025)；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013GDK04，2015GDK53)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603035

第一作者：博士，高級(jí)獸醫(yī)師(徐義剛教授為通訊作者，E-mail:108074182@qq.com)。