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    金黃色葡萄球菌生物被膜形成與生物被膜相關(guān)基因的調(diào)查研究

    2015-06-15 18:28:13賀建忠陳宏偉王貴強(qiáng)王永白萬勝
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌

    賀建忠+陳宏偉+王貴強(qiáng)+王永+白萬勝+郭新懷+王勇

    摘要:以分離自全國9個(gè)?。ㄊ?、區(qū))的102株奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌為研究對象,應(yīng)用剛果紅法(congo red agar,CRA)和半定量黏附試驗(yàn)(semi quantitative adherence assay,SQAA)檢測了生物被膜形成情況,應(yīng)用PCR法檢測了8種生物被膜相關(guān)基因分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),攜帶7種基因的菌株占有絕對優(yōu)勢,其次是攜帶6種基因的菌株;最流行的基因組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG,比例高達(dá)66.7%;北京、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、廣西、上海等地生物被膜形成與生物被膜相關(guān)基因的分布高度一致。以上研究結(jié)果表明,多種生物被膜相關(guān)基因組合是奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌流行的主要特點(diǎn),生物被膜形成和生物被膜相關(guān)基因的分布在大多數(shù)地區(qū)表現(xiàn)高度一致性,rbf和SigB基因可能在金黃色葡萄球菌生物被膜形成和乳房感染過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果將為金黃色葡萄球菌性乳房炎的防治提供一定的科學(xué)參考。

    關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌;生物被膜;奶牛乳房炎;生物被膜相關(guān)基因

    中圖分類號: S852.61+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2015)04-0055-04

    收稿日期:2014-04-15

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(編號:31260628);塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(編號:HS201204)。

    作者簡介:賀建忠(1977—),男,內(nèi)蒙古五原人,碩士,副教授,研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail:talimuhe_he@126.com。

    通信作者:白萬勝,副教授,研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail:bwsdky@126.com。

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是奶牛乳房炎(bovine mastitis)的主要病原之一,防治困難,常給乳業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SA易形成生物被膜(biofilm,BF),BF對抗生素治療以及宿主免疫均可產(chǎn)生較強(qiáng)的抵抗力,因此被認(rèn)為是乳房炎發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要毒力因子[1-2]。生物被膜形成受多種基因調(diào)控,這些調(diào)控基因統(tǒng)稱為生物被膜相關(guān)基因(biofilm-associated genes,BAGs)。例如icaA和icaD的表達(dá)可促進(jìn)BF的形成[3],icaR通過抑制ica的轉(zhuǎn)錄而抑制BF的形成。此外,rbf、bap、sarA、SigB和SasG等均可直接或間接調(diào)節(jié)BF的形成。

    對于BF形成及BAGs分布多有報(bào)道,但對于BF形成和BAGs關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。為此,本研究以全國9個(gè)?。▍^(qū))102株SA為研究對象,進(jìn)行了BF及BAGs分布情況調(diào)查,旨在分析地域性差異,為SA性發(fā)乳房炎的進(jìn)一步防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株背景 102株SA均分離自亞臨床性乳房炎乳樣。菌株為本實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存。鑒定程序包括溶血性觀察、革蘭氏染色、觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、生化鑒定及SA特異性基因nuc的PCR檢測等。鑒定后的菌株在含20%甘油的 Luria-Bertani(LB)肉湯中于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

    菌株分離自全國9個(gè)?。ㄊ小^(qū)),共102株,其中河北省37株、北京市14株、內(nèi)蒙古自治區(qū)7株、甘肅省7株、寧夏自治區(qū)11株、新疆維吾爾自治區(qū)7株、河南省6株、上海市5株、廣西壯族自治區(qū)7株。

    1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白胨大豆胨肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、腦心侵液(BHI)瓊脂/肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,剛果紅購自天津科密歐試劑有限公司,蔗糖購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)分別購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京化學(xué)試劑有限公司,瓊脂糖、Taq mix和Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司,引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

    臺(tái)式微量高速離心機(jī)(TG-16S):四川蜀科儀器有限公司;氣浴恒溫振蕩器(THZ-82A):金壇市醫(yī)療儀器廠;數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(HPX-9052MBE):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電泳儀(DYY-6D):北京市六一儀器廠;凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon-4100):上海天能科技有限公司;DNM-9602酶標(biāo)分析儀:北京普朗新技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 BF檢測 剛果紅法(congo red agar,CRA):將36 g蔗糖和0.8 g剛果紅溶于1 L腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)中,121 ℃高壓滅菌15 min,傾倒平板(CRA平板),備用。挑取復(fù)蘇后的單菌落接種于CRA平板,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。凡粗糙、干燥、水晶樣的黑色菌落均為生物被膜陽性株(biofilm-positive strains);而紅色的光滑型菌落為生物被膜陰性株(biofim-negative strains)。

    半定量黏附試驗(yàn)(semi-quantitative assay,SQAA):挑取復(fù)蘇后的單菌落接種于BHI肉湯,37 ℃恒溫振蕩器中過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的BHI肉湯,用含20 g/L葡萄糖的BHI肉湯按1 ∶ 100的比例稀釋。用微量移液器吸取200 μL稀釋后的菌液轉(zhuǎn)移到96孔板。每組設(shè)3個(gè)重復(fù),以BHI肉湯作陰性對照。將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將96孔板中的液體移除,用PBS液清洗2遍,以除去剩余的浮游菌。倒置自然干燥后,加入100 μL 95%乙醇固定 5 min,再用100 μL 1%結(jié)晶紫染色5 min。染色后,用滅菌蒸餾水清洗3遍,以除去剩余的染液。自然干燥后,用酶標(biāo)儀測定570 nm下的D值。凡D570 nm≥0.1的為生物被膜陽性株,D570 nm<0.1的為生物被膜陰性株。D值取3組的平均值。

    1.2.2 BAGs檢測 按照索萊寶細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提供的步驟進(jìn)行。提取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中備用。8個(gè)生物被膜形成相關(guān)基因(icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、bap、rbf、sasG)采用PCR法進(jìn)行檢測,引物序列、退火溫度、產(chǎn)物大小及參考文獻(xiàn)見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)分別含有1 μL上下游引物、7 μL ddH2O、10 μL Taq Mix和1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃ 預(yù)變性8 min;95 ℃ 變性30 s,相應(yīng)的退火溫度(表1)退火30 s,72 ℃ 延伸10 min,30個(gè)循環(huán)。含0.5 μg/mL溴乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,PCR產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

    表1 引物設(shè)計(jì)

    基因 引物序列(5′→3′) Tm

    (℃) 目的片段長度

    (bp) 參考文獻(xiàn)

    icaA CCTAACTAACGAAAGGTAG;AAGATATAGCGATAAGTGC 56 1 315 [4]

    icaD ATGGTCAAGCCCAGACAGG;CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA 56 198 [5]

    bap CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTG;GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC 60 971 [6]

    icaR CAATAATCTAATACGCCTGAG;AGTAGCGAATACACTTCATCT 54 246 [5]

    sarA TTTTTTTACGTTGTTGTGCATTAACA;CATTTAAACTACAAACAACCACAAGTTG 56 135 [7]

    rbf ACGCGTTGCCAAGATGGCATAGTCTT;AGCCTAATTCCGCAAACCAATCGCTA 62 164 [8]

    SasG CGGATCCGGTGTGACAATCAGTATGAC;CGGAATTCGCGACATTTATGTGGATACAC 55 937 [9]

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BAGs的分布情況

    BF相關(guān)基因廣泛分布于乳房炎性SA分離株中,所有的102株SA至少攜帶1種BAG。相比較而言,同時(shí)存在7種基因的菌株最多,所有菌種陽性菌株Total(t)、CRA檢測BF陽性菌株CRA(+)、SQAA檢測BF陽性菌株SQAA(+)、CRA和SQAA檢測均為陽性的菌株CRA(+)& SQAA(+)比例分別為66.7%、725%、65.3%、63.6%。其次,同時(shí)攜帶6種基因的菌株較多,且SQAA(+)和CRA(+)& SQAA(+)比例最高。所有被測菌株均未擴(kuò)增出bap基因,因此沒有同時(shí)存在8種被測基因的菌株。

    本研究共檢測了8種BF相關(guān)基因,出現(xiàn)的組合形式共20種,其中比例最高的是7種基因的組合,最少的僅有1種基因存在。最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG,比例高達(dá)66.7%;SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-rbf-SasG的比例分別是6.9%、3.9%、2.9%、29%、2.0%、2.0%;其余組合均為1.0%,即組合形式僅出現(xiàn)1次(表2)。

    表2 BF相關(guān)基因組合的流行情況

    相關(guān)基因組合

    SigB icaR icaA icaD sarA rbf SasG

    比例

    (%)

    + + + + + + + 66.7

    + + + - + + + 6.9

    + - + + + + + 3.9

    + + - + + + + 2.9

    + - - - - - - 2.9

    - + + + + + + 2.0

    + - + - - + + 2.0

    - + - - - - - 1.0

    - - - - - + + 1.0

    + - - - - + - 1.0

    + - - + - + - 1.0

    + - - + - + + 1.0

    + + + - - + - 1.0

    + - - + + + - 1.0

    - - + + - + + 1.0

    + - + - + + + 1.0

    + + + - + + - 1.0

    - + + + - + - 1.0

    + + + + + - + 1.0

    + + + + + + - 1.0

    2.2 BF的檢測結(jié)果

    由圖2可以看出,河北省BF陽性株BAGs的比例均低于菌株總數(shù)。寧夏和甘肅BF陽性株BAGs的比例均高于或等于菌株總數(shù),而且SQAA(+)和CRA(+)& SQAA(+)全部為100%,說明BAGs和SQAA+存在完全的一致性。除了北京市的icaD基因和內(nèi)蒙古的icaR基因,這2個(gè)地區(qū)BAGs在SQAA(+) 和 CRA(+)& SQAA(+)中均高于或等于菌種總

    數(shù)中的比例。新疆除SigB和rbf2個(gè)基因外,其他的變化趨勢與河北相似。

    由圖3可以看出,河南BAGs在CRA(+)和菌株總數(shù)中的比例全部相同,BAGs在SQAA(+)和CRA(+)& SQAA(+)中的比例也全部相同。廣西和上海BAGs在SQAA(+)和CRA(+)& SQAA(+)中均為100%,BAGs分布與BF形成表現(xiàn)出很好的一致性。就全國范圍總體而言,CRA(+)中BAGs的比例均高于菌種總數(shù)和其他BF陽性株,說明CRA(+)在全國范圍內(nèi)與BAGs的符合度較高。

    3 討論

    SA是引發(fā)臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎最主要的病原之一[10],可降低牛奶質(zhì)量,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,是影響奶業(yè)發(fā)展的主要問題[11]。SA具有多種毒力因子,其中BF形成被認(rèn)為是引發(fā)慢性感染的主要原因[12]。BF的形成與BAGs的分布密不可分,本研究結(jié)果顯示,BF陽性株均存在較高比例的BAGs,其中同時(shí)存在7種和6種被測基因的占有絕對優(yōu)勢。在20種流行組合中,最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG,比例高達(dá)66.7%,其次是SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG(6.9%)、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG(3.9%)、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG(29%)、SigB(2.9%)、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG(2.0%)和SigB-icaA-rbf-SasG(2.0%)。以上結(jié)果表明,多種BAGs組合是我國乳房炎性SA流行的重要特征之一,同時(shí)這些基因可能在BF形成過程發(fā)揮重要作用。icaA和icaD共同表達(dá)增加N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性,促進(jìn)BF的形成[13],而icaR可通過限制ica表達(dá)抑制BF的形成。SigB、rbf與SasG的表達(dá)能夠促進(jìn)BF的形成[14-16],而SarA的表達(dá)能夠限制BF的形成[17],迄今,盡管bap基因表達(dá)能夠促進(jìn)SA在乳房內(nèi)的黏附和BF的形成[18],但是在本研究所有被測菌株中均未擴(kuò)增出該基因,說明該基因在我國乳房炎性金黃色葡萄球菌BF形成和發(fā)病機(jī)制中居于次要地位。

    不同地區(qū)BF形成與BAGs分布的一致性存在一定差別。廣西、上海、北京、內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅7個(gè)?。ㄊ?、區(qū)) BAGs分

    布BF形成保持高度一致性,而河北、河南和新疆BAGs分布和BF形成的一致性相對降低,提示在BF形成和乳房炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的可能是本研究未檢測的某些基因。具體到基因種類,rbf和SigB分布最廣,在大多數(shù)省份均為100%,提示這2個(gè)基因在SA性乳房炎發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。Rbf可抑制icaR的表達(dá),能夠間接激活icaADBC的表達(dá),促進(jìn)BF的形成,但是并不依賴于ica通路[16]。sigB能夠促進(jìn)不同毒力因子表達(dá)的調(diào)控,促進(jìn)BF形成的同時(shí)能夠調(diào)節(jié)抗生素耐藥性[19]。因此,通過rbf和SigB基因功能調(diào)節(jié)入手,研究我國乳房炎性SA的致病機(jī)制,可能是一種新的思路。

    綜上所述,多種BAGs組合流行是我國乳房炎性SA流行的主要趨勢,各地區(qū)金黃色葡萄球菌BF形成和BAGs分布存在一定的差異。

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