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    虎源金黃色葡萄球菌耐藥性的檢測(cè)及耐β—內(nèi)酰胺類藥機(jī)制的研究

    2015-08-14 10:41:55萬蝶吳長德
    新農(nóng)業(yè) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌耐藥性

    萬蝶 吳長德

    摘 要:金黃色葡萄球菌在自然界中的分布極其廣泛,存在于空氣、水和土壤中,寄居在人和動(dòng)物的皮膚黏膜、鼻腔、咽喉以及胃腸道等處,是臨床上常見的致病菌之一。由于其可以產(chǎn)生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等,在臨床可引起各種家畜的呼吸道感染、子宮內(nèi)膜炎、外傷化膿、乳房炎,若治療不及時(shí)會(huì)引起敗血癥而導(dǎo)致死亡。近些年,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,目前臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重,而且出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象,這給臨床治療帶來極大的困難,金黃色葡萄球菌的耐藥問題已經(jīng)引起人們的極大關(guān)注。

    東北虎作為世界一級(jí)保護(hù)動(dòng)物,近年來時(shí)有病原微生物感染死亡的報(bào)道。本研究旨在研究虎源金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性,并通過對(duì)相關(guān)耐藥基因的檢測(cè),分析其耐藥機(jī)制,為今后指導(dǎo)臨床合理使用抗生素防控野生動(dòng)物金黃色葡萄球菌感染提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:虎;金黃色葡萄球菌;耐藥性;耐藥機(jī)制

    本實(shí)驗(yàn)采集病死東北虎的化膿性腎臟,通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純化,染色、鏡檢以及PCR方法進(jìn)行鑒定;以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)為靶基因,選擇特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用來鑒定金黃色葡萄球菌;采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性,分析其耐藥性;液體培養(yǎng)分離菌株,提取細(xì)菌DNA,根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,針對(duì)相應(yīng)的耐藥基因設(shè)計(jì)引物,通過PCR方法對(duì)相關(guān)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序,分析其耐藥機(jī)制。

    1 虎源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

    1.1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1.1 金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng) 將沈陽森林野生動(dòng)物園的病死東北虎腎臟及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。切取平整病料,在瓊脂平板上劃板,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),將可疑菌落涂片染色鏡檢,并繼續(xù)劃板,進(jìn)行純化培養(yǎng)。若確定為金黃色葡萄球菌,則需挑取菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,震蕩混勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)8小時(shí)后,置于30%甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 金黃色葡萄球菌的鑒定 形態(tài)鑒定和革蘭氏染色鏡檢;并提取細(xì)菌基因組DNA,設(shè)計(jì)、合成金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc引物,利用PCR鑒定金黃色葡萄球菌,并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小。

    反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30S,58℃退火30s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng),產(chǎn)物于4℃保存。

    1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    1.2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 在普通營養(yǎng)瓊脂上形成灰白色、濕潤、隆起、表面光滑的菌落(圖1)。

    1.2.2 染色結(jié)果 對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察,可見葡萄串狀排列的革蘭氏陽性球菌,無鞭毛、無莢膜、無芽孢,可初步判定為葡萄球菌(圖2)。

    1.2.3 耐熱核酸酶基因檢測(cè)結(jié)果 提取菌株基因組DNA為模板,對(duì)nuc基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在250bp附近出現(xiàn)單一清晰的目的條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期目的片段相符,為279bp(圖3)。

    1.2.4 nuc基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果 將PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的基因進(jìn)行比對(duì),同源性為99%,確定擴(kuò)增產(chǎn)物為nuc基因。

    2 金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

    2.1 實(shí)驗(yàn)材料

    營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

    2.2 抗菌藥物

    藥敏紙片;β-內(nèi)酰胺類:阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟;氨基糖苷類:阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素;大環(huán)內(nèi)脂類:紅霉素、克林霉素、阿奇霉素;喹諾酮類:恩諾沙星、環(huán)丙氟哌酸;四環(huán)素類:四環(huán)素、強(qiáng)力霉素;氯霉素類:氯霉素、氟苯尼考;糖肽類:萬古霉素;共計(jì)7大類16種。

    2.3 實(shí)驗(yàn)方法

    2.3.1 將菌株活化 -80℃?zhèn)溆玫慕瘘S色葡萄球菌菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48小時(shí)。

    2.3.2 增殖培養(yǎng) 從增殖菌液中取15微升放入20毫升營養(yǎng)肉湯后,放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    2.3.3 對(duì)菌濃度的測(cè)定 以營養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照,不同生長階段的菌液為樣品,用分光光度計(jì)測(cè)定其OD值,OD600的數(shù)值范圍在0.6左右時(shí)為對(duì)數(shù)生長期(約培養(yǎng)8小時(shí)),此時(shí)適合做藥敏實(shí)驗(yàn)。

    2.3.4 藥敏實(shí)驗(yàn) 將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基平板上,用鑷子夾取藥敏片貼在培養(yǎng)基平板上。每種藥物貼3次藥敏片,將培養(yǎng)基平板放入37℃恒溫箱,16~18小時(shí)后觀察結(jié)果。參照CLSI(2012)公布的三種形式:敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant),對(duì)抑菌圈大小的標(biāo)準(zhǔn)作出判定。個(gè)別使用藥物CLSI(2012)沒有列出,按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。

    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    觀察體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的抑菌環(huán),并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑的大小,記錄結(jié)果(圖4)。

    從表3可以看出,金黃色葡萄球菌分離菌株對(duì)阿米卡星、紅霉素、克林霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、環(huán)丙氟哌酸、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考和慶大霉素表現(xiàn)出敏感的狀態(tài);對(duì)氯霉素和萬古霉素表現(xiàn)出中介的狀態(tài);對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥的阿莫西林、氨芐西林和頭孢噻肟表現(xiàn)出耐藥的狀態(tài)。

    3 虎源金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥耐基因的檢測(cè)

    3.1 實(shí)驗(yàn)方法

    3.1.1 引物設(shè)計(jì) 提取金黃色葡萄球菌基因組DNA,并設(shè)計(jì)合成β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因PCR擴(kuò)增引物(表4)。

    3.1.2 β-內(nèi)酰胺類藥物4種耐藥基因的檢測(cè) 以金黃色葡萄球菌基因組為模板,對(duì)mecA、femA、TEM、SHV等4種基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),反應(yīng)體系為30微升(表5)。

    反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3分鐘,95℃變性30秒,退火30秒,擴(kuò)增mecA退火溫度為57℃,擴(kuò)增femA的退火溫度為55℃,擴(kuò)增TEM的退火溫度為55℃,擴(kuò)增SHV的退火溫度為60℃,72℃延伸1分鐘,從第二步起共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng),產(chǎn)物于4℃保存。

    3.1.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5微升PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中,120V電泳30分鐘,選用DL-2000 DNA Marker分子量標(biāo)準(zhǔn),用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

    3.1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將膠回收的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析,并與GenBank上收錄的序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 TEM基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外光觀察,顯示擴(kuò)增獲得約309 bp的特異性條帶,與預(yù)期片段長度相符(圖5)。

    SHV基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外光觀察,顯示擴(kuò)增得到約176bp的特異性條帶,與預(yù)期片段長度相符(圖6)。

    3.2.2 測(cè)序結(jié)果 將SHV基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的SHV基因序列(blaSHV-154,gb|JX121121.1|)進(jìn)行比對(duì),同源性為97%,可以確定擴(kuò)增基因?yàn)镾HV基因。

    將TEM基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的TEM基因序列(TEM,gb|KF963580.1|)進(jìn)行比對(duì),同源性為99%。可以確定擴(kuò)增的基因?yàn)門EM基因。

    4 結(jié)論

    從死亡東北虎的腎臟成功分離出金黃色葡萄球菌;該分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物:頭孢噻肟、阿莫西林和氨芐西林等耐藥;對(duì)四環(huán)素、克林霉素、強(qiáng)力霉素、阿米卡星、紅霉素、恩諾沙星、慶大霉素、阿奇霉素、鏈霉素、環(huán)丙氟哌酸等高度敏感,對(duì)氯霉素和萬古霉素中度敏感;從分離菌株中PCR擴(kuò)增出TEM、SHV耐藥基因,說明產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致虎源金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。

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