生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌及其腸毒素檢測

王文博+張敏+張傳津+章安源+苑學霞+李瑞菊

摘 要：為了解生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染狀況及產(chǎn)腸毒素特性，進而為金黃色葡萄球菌引起的食物中毒監(jiān)測以及污染源追蹤提供依據(jù)，本試驗從山東省兩個地市采集生鮮牛乳共152份，對其進行金黃色葡萄球菌檢測，并對地市1樣品進行產(chǎn)腸毒素檢測。結果顯示，152 份樣品共檢出金黃色葡萄球菌陽性樣品84份，檢出率為55.26%，其中，地市1的114份樣品中共檢出被金黃色葡萄球菌污染的樣品63份，檢出率為55.26%；地市2的38份樣品中共檢出被金黃色葡萄球菌污染的樣品21份，檢出率為55.26%，且不同地區(qū)來源的樣品受污染程度存在明顯差異。對地市1的樣品進行腸毒素檢測，均未檢出腸毒素。本研究結果表明，兩個地市生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染范圍較廣，應進一步加強奶源管理，避免由其污染引起的食物中毒。

關鍵詞：生鮮牛乳；金黃色葡萄球菌；腸毒素

中圖分類號：TS252.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0142-04

Abstract In order to study the contamination status of Staphylococcus aureus and its enterotoxin-producing property in raw milk， and to provide references for monitoring the bromatoxism resulted from Staphylococcus aureus and pollution source tracking， 152 raw fresh milk samples collected from dairies of two cities in Shandong Province were conducted Staphylococcus aureus detection according to the national standard method （GB 4789.10—2010）. Subsequently， the enterotoxin in samples from No.1 city was tested. The results showed that there were 84 positive samples and the detection rate was 55.26%. Among which， 63 and 21 positive samples were detected from 114 and 38 samples coming from No.1 and No.2 city respectively， and the detection rate were both 55.26%. The contamination levels were significantly different in samples derived from different regions. Additionally， the enterotoxin were all not detected in 114 samples of No.1 city. The results demonstrated that the levels of Staphylococcus aureus contamination in raw fresh milk were high in two cities of Shandong Province， and it advised that the milk management should be strengthened to avoid food poisoning.

Keywords Raw fresh milk； Staphylococcus aureus； Enterotoxin

牛乳是人類最理想的營養(yǎng)食品之一，但其易遭受污染而腐敗變質(zhì)。牛乳中污染了金黃色葡萄球菌后易引起食物中毒等食源性疾病[1]。據(jù)美國疾病預防控制中心（CDC）報道，引起人類食物中毒排第一位的是大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌位居第二[2，3]。金黃色葡萄球菌在環(huán)境中普遍存在[4]，來源廣泛，極易傳播，因此污染率較高，且與奶牛乳房炎高患病率密切相關。

金黃色葡萄球菌導致胃腸炎的主要致病力由腸毒素產(chǎn)生，腸毒素耐熱而不受胰蛋白酶的影響，須在100℃持續(xù)加熱2 h以上方能破壞其毒性[5]，嚴重威脅人類身體健康。近年來，我國各省由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件被屢屢報道[6-10]。因此，對生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的檢測及研究有重要意義。

本研究以從位于山東省東部（地市1）和西北部（地市2）兩個地市不同地區(qū)采集的152份生鮮牛乳為試驗材料，進行金黃色葡萄球菌的分離和鑒定，并對地市1的樣品進行腸毒素檢測，以期了解山東省兩地市生鮮牛乳金黃色葡萄球菌的污染情況，為進一步采取有效措施防止牛乳污染和提高奶產(chǎn)品安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 2015年9月份共采集生鮮牛乳樣品152份，其中來自地市1八個地區(qū)的樣品114份，地市2七個地區(qū)的樣品38份。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 生理鹽水、S. aureus測試片、MicroFast

金葡腸毒素快速檢測卡均購自北京良潤生物科技有限公司；API staph試劑盒購自法國生物梅里埃公司；7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板、葡萄球菌乳膠凝集試劑盒、營養(yǎng)瓊脂、無菌拭子、腦浸液均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備 拍擊式均質(zhì)器（購自西班牙IUL公司）、漩渦振蕩器、電子天平、生化培養(yǎng)箱（購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、高壓滅菌鍋（購自山東省新華醫(yī)療器械股份有限公司）、APILAB Plus系統(tǒng)（法國生物梅里埃）。

1.2 試驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢測 于無菌環(huán)境下取25 mL生牛乳于225 mL滅菌生理鹽水中，用拍擊式均質(zhì)器混勻； 取1 mL均勻置于S. aureus測試片上；另吸取樣品勻液1 mL于盛有9 mL生理鹽水的試管中，用漩渦振蕩器混勻，取1 mL均勻置于S. aureus測試片上；37℃培養(yǎng)24 h，有藍色菌落生長為可疑陽性，沒有藍色菌落生長為陰性，同時設空白對照。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的分離及鑒定 檢驗操作參照《GB 4789.10—2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》[11]中金黃色葡萄球菌定性及定量檢驗的操作方法進行，采用金黃色葡萄球菌ATCC 6538 （ 北京良潤生物科技有限公司） 作為陽性對照。

1.2.3 腸毒素檢測 對地市1全部生鮮牛乳樣品采用MicroFast金葡腸毒素快速檢測卡進行SEA/SEB/SEC/SED/SEE的檢測，均在有效期內(nèi)進行試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Excel表格進行處理，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌檢測結果

地市1總計114份生鮮牛乳樣品中，檢出金黃色葡萄球菌樣品63份，檢出率為55.26%；地市2總計38份生鮮牛乳樣品中，檢出金黃色葡萄球菌樣品21份，檢出率為55.26%。

2.2 金黃色葡萄球菌污染程度

在地市1檢測呈陽性的63份生鮮牛乳中，金黃色葡萄球菌污染范圍為1～99 cfu/mL的樣品有48份，占76.19%，污染范圍為100～199 cfu/mL的樣品有15份，占23.81%；在地市2檢測呈陽性的21份生鮮牛乳中，金黃色葡萄球菌污染范圍為1～99 cfu/mL的樣品有15份，占71.43%，污染范圍為100～199 cfu/mL的樣品有6份，占28.57%（圖1）。

2.3 兩地市不同地區(qū)金黃色葡萄球菌污染情況

地市1的8個地區(qū)樣品的金葡菌污染情況差異較大，檢出率大小依次為W2>W6>W4>W3>W5>W1>W8>W7；其中，W2、W4和W8地區(qū)樣品污染較嚴重，污染范圍為100～199 cfu/mL的樣品檢出率相對較高（表2）。

地市2的7個地區(qū)的樣品金葡菌污染情況存在差異，由表3可以看出，檢出率依次為D2>D7>D6>D3>D4>D5>D1；其中D2地區(qū)污染最為嚴重，且污染范圍為100～199 cfu/mL的樣品檢出率相對較高；而D1地區(qū)未檢測到金葡菌污染樣品。

2.4 腸毒素檢測結果

對地市1的生鮮牛乳樣品進行腸毒素檢測，結果顯示，114個樣品均未檢出腸毒素。

3 討論與結論

金黃色葡萄球菌由于分布廣泛、污染率高、極易傳播等特性，且其產(chǎn)生的主要致病力腸毒素在高溫下也很難滅活，引起了較多食物中毒事件[8-10]。因此，檢測和掌握生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染情況對于預防和控制食品安全具有重要意義。

近年來，許多研究人員調(diào)查監(jiān)測了生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染情況，徐勤等[12]對江蘇省171份生牛奶樣品進行金黃色葡萄球菌檢驗，結果共檢出26株陽性菌株，檢出率為15.20%；高延玲等[13]檢測了河南省4個地區(qū)的400份生牛奶樣品中的金黃色葡萄球菌，檢出率為20.5%；王娟等[14]研究表明山東和湖南等5個省的300份生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌分離率為26.17%；從蕪湖市四個奶廠185份樣品中檢出金黃色葡萄球菌49株，總檢出率為26.5%[15]；對南寧市三大奶場145份生牛奶按進行檢測，結果檢出金黃色葡萄球菌45株，檢出率為31.03%[16]。

本研究對山東省兩個地市的152份生鮮牛乳進行金黃色葡萄球菌的檢測，最終檢測出84份陽性樣品，檢出率為55.26%，與以上研究結果存在差異，且地市1的8個地區(qū)和地市2的7個地區(qū)之間均存在差異，表明不同地區(qū)生鮮牛乳金金黃色葡萄球菌的污染程度不同。同時也說明此次調(diào)查地區(qū)金黃色葡萄球菌污染生鮮牛乳的廣泛性，兩個地市生鮮牛乳該菌的污染程度較高，應采取有效措施以保證生鮮牛乳的質(zhì)量及安全。

此外，地市1的114個樣品均未檢測到腸毒素，表明地市1生鮮牛乳受傳統(tǒng)金黃色葡萄球菌腸毒素污染較輕，尚未有引起食物中毒的潛在危險性，但也值得注意。

參 考 文 獻：

[1] 黃丹.乳源性金黃色葡萄球菌耐藥及產(chǎn)腸毒素特性研究[D].呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學， 2008.

[2] Abe J， Ito Y， Onimaru M， et al. Characterization and distribution of a new enterotoxin-related superantigen produced by Staphylococcus aureus[J]. Microbiol. Immunol.， 2000， 44（2）：79-88.

[3] Alarcon B， Vicedo B， Aznar R. PCR-based procedures for detection and quantification of Staphylococcus aureus and their application in food[J]. Journal of Applied Microbiology， 2006， 100（2）：352-364.

[4] 胡曉寧， 蘇誠玉， 權玉玲， 等.甘肅省生鮮乳中金黃色葡萄球菌及腸毒素污染狀況調(diào)查[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2013， 23（4）： 984-985.

[5] 索玉娟， 于宏偉， 凌巍，等. 食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究[J].中國食品學報， 2008， 8（3）：88-93.

[6] 彭國華，胡主花，薛琳，等. 食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌及腸毒素檢測[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學， 2008， 35（20）：3943-3945.

[7] 章樂怡，李毅，馬雪蓮. 食物中毒及食品中金黃色葡萄球菌的腸毒素及基因的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2009， 19（12）：2851-2853.

[8] 劉偉，王菊光，孫曉華，等. 日常食品及食物中毒樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素的分型檢測分析[J]. 中國預防醫(yī)學雜志， 2013， 14（8）：608-611.

[9] 崔瑩，張丁，張秀麗. 一起由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食物中毒實驗室分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014， 24（8）：1162-1164.

[10]杜志榮，高海寧，羅靜. 一起金黃色葡萄球菌引起的學校食物中毒事件調(diào)查分析[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2015（12）：20-22.

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 4789.10—2010. 食品衛(wèi)生微生物學檢驗：金黃色葡萄球菌檢驗[S].

[12]徐勤，巢國祥. 生牛奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2005， 15（8）：972-973.

[13]高延玲，董鵬，李金磊， 等. 奶牛場金黃色葡萄球菌的分離及耐藥性研究[J]. 畜牧與飼料科學， 2014， 35（9）：1-4.

[14]王娟， 黃秀梅， 曲志娜，等. 生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離及耐藥性分析[J]. 中國人獸共患病學報， 2014（12）：1214-1217.

[15]范亞楠，相翊卿，劉子琦，等. 蕪湖地區(qū)生牛奶中金黃色葡萄球菌的污染狀況及其耐藥性和毒力基因檢測[J]. 中國微生態(tài)學雜志， 2015， 27（11）：1266-1271， 1275.

[16]呂素玲，唐振柱，李秀桂，等. 南寧市生牛奶金黃色葡萄球菌污染狀況及其耐藥性和腸毒素基因檢測[J]. 應用預防醫(yī)學， 2010， 16（5）：271-274.