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    犬源金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥性

    2015-09-10 09:44:13葛愛民
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌內(nèi)酰胺酶耐藥性

    葛愛民

    摘要: 對(duì)寵物門診分離得到的25株金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性分析與β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定,以了解近3年來(lái)濰坊地區(qū)犬源金黃色葡萄球菌的耐藥性及其是否產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,以期為臨床上致病性金黃色葡萄球菌感染的有效控制提供依據(jù)。使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn);使用碘量法、酚紅法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。25株金黃色葡萄球菌對(duì)替考拉寧、利福平、萬(wàn)古霉素十分敏感,對(duì)其他25種藥物呈現(xiàn)一定耐藥性,并對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素呈現(xiàn)很高的耐藥性。碘量法、酚紅法測(cè)得產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株分別為18、17株。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧不具有耐藥性,對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素基本具有耐藥性;不產(chǎn)酶的菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性低于產(chǎn)酶菌株??梢?,β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性的主要原因。

    關(guān)鍵詞: 犬;金黃色葡萄球菌;耐藥性;β-內(nèi)酰胺酶

    中圖分類號(hào): S858 292 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0219-02

    犬源金黃色葡萄球菌感染可導(dǎo)致膿皮病、外耳炎、角膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等 [1],是較為常見的寵物犬臨床細(xì)菌感染。由于近年來(lái)抗生素的過度使用,金黃色葡萄球菌耐藥性的問題始終困擾著臨床用藥。為了解犬源致病性金黃色葡萄球菌在濰坊地區(qū)的耐藥特性,對(duì)近3年寵物門診分離得到的25株致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性研究,為臨床醫(yī)師合理選用抗生素提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1 1 材料

    1 1 1 菌種 25株致病性金黃色葡萄球菌分離自山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院及周邊寵物門診的犬臨床病例。

    1 1 2 試劑 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、淀粉購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;常用藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購(gòu)自西隴化工股份有限公司;酚紅購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;注射用青霉素鈉購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。按常規(guī)方法自制培養(yǎng)基、碘液、酚紅溶液(5 g/L)指示劑、PBS緩沖液。

    1 1 3 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司;電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自江蘇省醫(yī)療器械廠;電子萬(wàn)用爐購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;磁力攪拌器購(gòu)自常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠。

    1 2 方法

    1 2 1 金黃色葡萄球菌菌種的制備 配制普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基,制作斜面25個(gè),用接種環(huán)取已保藏的25株金黃色葡萄球菌分別接種在斜面上,“之”字形劃線,37 ℃培養(yǎng)24~48 h。

    1 2 2 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 配制普通肉湯培養(yǎng)基,經(jīng)高溫滅菌后倒在25支試管中(每支試管約2 mL),待液體冷卻后,用滅菌的接種環(huán)在斜面上取少量金黃色葡萄球菌接種至試管內(nèi),于搖床中37 ℃培養(yǎng)24 h。

    1 2 3 藥敏試驗(yàn) 吸取100 μL菌液至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,將菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面,每株金黃色葡萄球菌對(duì)應(yīng)4塊平板,用鑷子將藥敏紙片放置于涂抹好菌液的平板上,每塊平板均勻放置7種藥敏紙片,于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)完成后用卡尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑,記錄試驗(yàn)結(jié)果。藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑≥23 mm為高敏,抑菌圈直徑在18~22 mm為敏感,抑菌圈直徑在15~17 mm為中敏,抑菌圈直徑在13~14 mm為低敏,抑菌圈直徑≤12 mm為耐藥。

    1 2 4 碘量法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生 采用點(diǎn)種法將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基(固體)平板(每塊平板點(diǎn)種4株不同的金黃色葡萄球菌),于37 ℃恒溫過夜。將淀粉瓊脂上層培養(yǎng)基分裝于試管中,每支9 mL,置于55 ℃恒溫水浴鍋。將1瓶注射用青霉素鈉(800 000 U)溶于40 mL無(wú)菌水中,配成青霉素含量為 20 000 U/mL 的溶液。向每支裝有淀粉瓊脂上層培養(yǎng)基的試管中加入1 mL配好的青霉素溶液,混勻后立即傾注于培養(yǎng)好的平板上,鋪平待凝。吸取碘液鋪滿平板表面,用滴管吸去多余碘液,于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置10~15 min后,觀察菌的周圍是否出現(xiàn)無(wú)色透明圈,記錄試驗(yàn)結(jié)果。

    1 2 5 酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生 配制普通肉湯培養(yǎng)基(液體)并分裝于25支試管中,每支試管4 mL。將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種在25支試管中,于搖床中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。向1瓶注射用青霉素鈉(800 000 U)中加入1 mL配好的酚紅溶液并混勻。用移液槍分別吸取02 mL青霉素酚紅溶液加入每支待測(cè)菌液試管中,混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)10~15 min,觀察溶液是否由紅色變?yōu)辄S色,記錄試驗(yàn)結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2 1 藥敏試驗(yàn)

    25株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,大多數(shù)菌株對(duì)壯觀霉素、青霉素G、羧芐青霉素耐藥,對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧敏感,對(duì)呋喃妥因、克林霉素、紅霉素相對(duì)較為敏感,對(duì)其他各種藥物均有很大程度的耐藥性(表1)。

    2 3 酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生

    采用酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生,溶液由紅色變?yōu)辄S色則表明有β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。結(jié)果顯示,25株金黃色葡萄球菌中有17株可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)酶率為68%(表3)。

    2 4 β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株與陰性菌株的耐藥性

    結(jié)果顯示,β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性均非常高,陰性菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性則低一些;對(duì)利福平、萬(wàn)古霉素、替考拉寧耐藥的菌株均產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶(表4)。

    3 結(jié)論與討論

    本試驗(yàn)的25株金黃色葡萄球菌中,對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧敏感的菌株較多,耐藥率分別為12%、20%、16%,與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論 [2-3]基本一致。除上述3種抗生素外,試驗(yàn)菌株對(duì)呋喃妥因、克林霉素、紅霉素也較為敏感,耐藥率分別為48%、56%、60%,與卞聰?shù)鹊难芯拷Y(jié)果 [4]一致。試驗(yàn)菌株對(duì)青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類抗生素的耐藥性均很高,這與分離自不同動(dòng)物和人體的金黃色葡萄球菌的耐藥性研究結(jié)果相符。

    細(xì)菌通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶來(lái)水解抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán),使抗生素對(duì)細(xì)菌失去治療效果,這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的方式之一。碘量法利用β-內(nèi)酰胺酶作用于青霉素,產(chǎn)生裂解酸與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘,使藍(lán)色的碘-淀粉復(fù)合物褪色,碘量法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn) [5]。酚紅法也是利用青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶的作用產(chǎn)生裂解酸,從而改變pH值,使指示劑的顏色發(fā)生變化 [6]。這2種方法均可定性鑒定β-內(nèi)酰胺酶的存在 [4],本試驗(yàn)碘量法中有72%的菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,酚紅法中則有68%的菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,2種方法測(cè)得的結(jié)果基本相符。由于觀察結(jié)果的時(shí)間、 加入試劑的時(shí)

    間、青霉素溶液配制的時(shí)間不同,導(dǎo)致指示劑濃度、待測(cè)菌液濃度有一定差別,使個(gè)別菌株出現(xiàn)不同檢測(cè)方法的差異。

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,采用碘量法和酚紅法測(cè)得的產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶的菌株,對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素均有高度的耐藥性;而藥敏試驗(yàn)中對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性的菌株中,也有部分菌株并未產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶??梢姡a(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因,但造成細(xì)菌耐藥性的原因有很多,不單局限于β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生,且試驗(yàn)中的操作失誤也可能影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果還表明,產(chǎn)酶菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧的敏感程度很高,不產(chǎn)酶菌株對(duì)這3種抗生素完全敏感,且不產(chǎn)酶菌株對(duì)利奈唑胺均無(wú)耐藥性,這與劉小朵的研究結(jié)果 [7]一致。

    近年來(lái)寵物市場(chǎng)發(fā)展迅猛,人們對(duì)寵物健康的重視程度非常高,要求門診醫(yī)師能夠憑借經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及時(shí)解決致病性金黃色葡萄球菌等細(xì)菌感染問題;因此,研究細(xì)菌的耐藥性對(duì)于臨床合理使用抗生素具有重要指導(dǎo)意義。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 王彤光 寵物疫病與防治技術(shù)[M] 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:78

    [2]邵士慧,李槿年,王評(píng)評(píng),等 豬源致病性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J] 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(4):308-311

    [3]趙永達(dá),黃顯會(huì) 一例犬金黃色葡萄球菌病的診斷及藥敏試驗(yàn)[J] 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(9):225-226

    [4]卞 聰,李 松 215株金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析[J] 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2011,27(20):3135-3136

    [5]陳 號(hào),馬文靜,田晉紅,等 牛奶中非法添加β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀[J] 畜牧與飼料科學(xué),2010,31(1):67-69

    [6]張?chǎng)螢t,謝巖黎,王金水,等 牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J] 中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(2):45-47

    [7]劉小朵 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的金黃色葡萄球菌的耐藥情況分析[J] 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2013,32(21):138

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