柴達(dá)木盆地梭梭耐鹽相關(guān)基因PrxQ的克隆及其蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

馬玉花+冶貴生+馮志鵬

摘要： 對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭的PrxQ基因進(jìn)行擴(kuò)增，并利用生物軟件對(duì)PrxQ基因序列進(jìn)行分析，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ基因長(zhǎng)度為657 bp，編碼218個(gè)氨基酸；PrxQ蛋白親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜螺旋區(qū)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲；PrxQ具有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，此外PrxQ蛋白的親水性較強(qiáng)，無跨膜螺旋區(qū)。柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PrXQ蛋白三維結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成。

關(guān)鍵詞： 梭梭；PrxQ基因；序列分析；蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0027-04

梭梭（Haloxylon ammodendron）為藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（Haloxylon Bunge）多年生小喬木，別稱瑣瑣、梭梭柴，屬?gòu)?qiáng)旱生植物 [1]，主要分布在我國(guó)新疆的準(zhǔn)噶爾盆地、塔里木盆地，內(nèi)蒙古阿拉善盟、巴彥淖爾盟，甘肅的河西走廊西端，青海柴達(dá)木地區(qū)荒漠地區(qū)，生長(zhǎng)于海拔2 700～3 000 m的半荒漠、荒漠地區(qū)的沙地，為國(guó)家瀕危三級(jí)保護(hù)植物 [2]。

柴達(dá)木盆地是我國(guó)土地鹽堿化的主要發(fā)生地區(qū)之一，由于該地區(qū)氣候高寒干燥，蒸發(fā)量大而降水量小，加上風(fēng)蝕、沙化嚴(yán)重，使盆地存在著沙漠化、鹽漬化的雙重危害，嚴(yán)重制約著該區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。作為柴達(dá)木盆地旱生、鹽生荒漠植被組成的主體，梭梭是當(dāng)?shù)亓鲃?dòng)沙地治理的先鋒樹種，它不僅具有顯著的生態(tài)價(jià)值，而且具有很重要的藥用價(jià)值，因而對(duì)其研究和開發(fā)利用具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)價(jià)值。

鹽脅迫導(dǎo)致的滲透脅迫和離子毒害使植物產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS濃度的提高會(huì)積累丙二醛（MDA）等有害過氧化物，造成膜脂過氧化，使ROS產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，如果不能及時(shí)清除ROS就會(huì)造成氧化脅迫 [3]。為了防止活性氧對(duì)細(xì)胞造成傷害，植物細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)針對(duì)活性氧的清除機(jī)制。鹽脅迫下鹽生植物抗氧化酶活性高于非鹽生植物 [4]，鹽脅迫下植物體內(nèi)抗氧化酶的活性上升可清除過多的活性氧，從而保護(hù)膜系統(tǒng)不受破壞并提高植物的耐鹽性 [5-6]。

過氧化物還原酶是植物抗氧化過程中的一種酶，其分布廣泛，幾乎存在于所有植物、酵母、細(xì)菌、寄生蟲、哺乳動(dòng)物等多種生物體內(nèi)，基于氨基酸序列中半胱氨酸殘基的保守性及催化機(jī)制可將植物的過氧化物還原酶分為4種：1-Cys Prx、2-Cys Prx、Ⅱ型Prx、Ⅱ型PRxQ [7-8]。過氧化物還原酶在原核生物、真核生物中都高度保守 [9]，它可以催化H2O2還原為水，或在供體氫的存在下，催化各種烷基過氧化物還原為水和相應(yīng)的醇，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度參與信號(hào)傳導(dǎo) [10]。Kong等首先從佛甲草中克隆到PrxQ [11]，目前已在四翅濱藜、擬南芥、梭梭（內(nèi)蒙古阿左旗巴丹吉林沙漠）、小麥等植物中獲得了PrxQ基因 [12-15]。甘曉燕等對(duì)內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭的PrxQ基因進(jìn)行了克隆和分析 [14]。由于不同生境下的植物基因具有變異性，本研究在對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭進(jìn)行PrxQ基因克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)PrxQ基因的核苷酸序列、氨基酸序列進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上對(duì)PrxQ基因蛋白的亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)及跨膜區(qū)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，以期為下一步PrxQ基因的表達(dá)特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試梭梭的種子采自青海省柴達(dá)木盆地；供試土壤為園土，按1 ∶ 2的比例加入泥炭。2013年9月中旬采集梭梭的種子，經(jīng)消毒后播種到30 cm（高）×25 cm（內(nèi)徑）的花盆中，待梭梭苗木長(zhǎng)到10 cm左右時(shí)采集位于中上部的綠色同化枝進(jìn)行總RNA的提取。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000 DNA marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；植物RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的PrXQ基因序列設(shè)計(jì)引物，由大連寶生物工程有限公司合成，預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為657 bp。引物序列為：PrXQ-F：5′-ATGGCTACCCTCTCACTT-3′；PrXQ-R：5′-TCAAAGGCTTTGTAGAAATT-3′。

1.2.2 梭梭總RNA的提取 參照試劑盒說明提取梭梭總RNA。

1.2.3 RT-PCR 取5 μL提取的梭梭總RNA、4 μL下游引物、3 μL dNTP Mixture、3 μL RNase-Free ddH2O，70 ℃預(yù)熱 5 min，立即冰浴2 min；再分別加入4 μL 5倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，置于42 ℃水浴50 min，95 ℃ 5 min；補(bǔ)加RNase-Free ddH2O至總體積為50 μL。將得到的cDNA于-20 ℃保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 取2 μL上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、5 μL 10倍的PCR緩沖液、3 μL MgCl2、4 μL dNTP、各2 μL上下游引物、05 μL Taq DNA聚合酶，加RNase-Free ddH2O至50 μL后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5 序列測(cè)定與分析 將擴(kuò)增正確的PCR產(chǎn)物送交生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，應(yīng)用DNAStar對(duì)PrxQ基因序列進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)PrxQ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性。用SignalP4.1進(jìn)行蛋白信號(hào)肽分析，TMHMM進(jìn)行蛋白跨膜螺旋區(qū)分析，PredictProtein 進(jìn)行蛋白細(xì)胞定位及蛋白修飾位點(diǎn)分析，應(yīng)用 I-TASSER 在線服務(wù)器預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭梭總RNA提取

由圖1提取的梭梭總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果看出，RNA所在泳道目的條帶清晰，28S亮度為18S的2倍，提取的總RNA可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2 梭梭PrxQ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將PrxQ基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，圖2結(jié)果表明，PrxQ基因所在泳道出現(xiàn)目的條帶，大小與預(yù)期的657 bp長(zhǎng)度相符。

2.3 PrxQ基因核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3.1 核苷酸序列分析 測(cè)定的PrxQ基因核苷酸序列經(jīng)DNASTAR軟件分析，表1結(jié)果表明：PrxQ基因核苷酸序列長(zhǎng)度為657 bp，T的含量較高，達(dá)到30.59%；整個(gè)基因序列中 A+T 的含量高于G+C的含量。

2.3.2 氨基酸序列分析 推導(dǎo)的PrxQ基因氨基酸序列經(jīng)DNASTAR軟件進(jìn)行分析表明，氨基酸序列長(zhǎng)度為218個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為23 977.06 u，等電點(diǎn)為9.317。根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算各類氨基酸中堿性、酸性氨基酸的數(shù)量比例分別為151%、8.3%，疏水性、親水性氨基酸的數(shù)量比例分別為353%、41.3%。

2.3.3 柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ基因與參考基因核苷酸序列、氨基酸序列的比較結(jié)果 將獲得的柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ基因與GenBank中登錄的內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭（JN657416.1）、膠楊（Populus balsamifera，AY530803.1）、鹽角草 （Salicornia herbacea，F(xiàn)J443123.1）、佛甲草（Sedum lineare，AB037598.1）、鹽地堿蓬（Suaeda salsa，AY373447.1）、冬小麥（Triticum aestivum，JQ739147.1）、團(tuán)藻（Volvox carteri，XM_002954776.1）等植物的PrxQ基因核苷酸序列、氨基酸序列進(jìn)行比較。表3結(jié)果表明，所得梭梭PrxQ基因序列與非梭梭屬植物PrxQ基因序列間存在著豐富的變異，其核苷酸序列的同源性在40.5%～86.8%間，氨基酸序列同源性在 33.6%～89.3% [JP+1]間，與已登錄的梭梭PrxQ基因核苷酸序列同源性為98.8%，氨基酸序列同源性為97.7%，有一定的突變發(fā)生，可見不同來源梭梭的PrxQ基因存在著豐富的變異。

2.4.2 PrxQ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) PredictProtein預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，梭梭PrxQ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成為：α螺旋，占20.18%；β折疊，占23.39%；無規(guī)則卷曲，占56.42%。可見無規(guī)則卷曲是梭梭PrxQ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件。

利用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)PrxQ蛋白進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，PrxQ蛋白為非分泌蛋白，該蛋白不含信號(hào)肽。用TMHMM預(yù)測(cè)梭梭PrxQ基因跨膜區(qū)，結(jié)果顯示PrxQ蛋白不含跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)。

利用PredictProtein對(duì)PrxQ進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，PrXQ具有2個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，分別為8～11位的NHTL、31～34位的NISI，其糖基化的連接點(diǎn)均為天冬酰胺；7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別為19～21位的TPK、59～61位的SPR、62～64位的SYK、81～83位的TLK、144～146位的SHK、147～149位的SFK、211～213位的TLK；2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，分別為81～84位的TLKD、138～141位的SGDD。

圖4的親水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PrxQ蛋白的親水性較強(qiáng)，分布區(qū)域較多，主要的分布區(qū)為17～30、37～41、49～64、81～ 90、94～97、106～115、117～130、139～154、159～172、181～189、198～210位?？梢娫摰鞍子H水性較強(qiáng)，具有多個(gè)連續(xù)親水區(qū)。

在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用I-TASSER在線軟件對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。由圖5的預(yù)測(cè)結(jié)果可知：5個(gè)得分最高的PrxQ蛋白三維結(jié)構(gòu)均主要由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成，其中模型1的C-score（表示預(yù)測(cè)模型的置信度）達(dá)到了-2.51，說明所建模型可信度較高。

3 結(jié)論與討論

對(duì)于同一個(gè)物種而言，不同的生境使其具有不同的生物學(xué)特性，長(zhǎng)期生長(zhǎng)于高鹽環(huán)境的植物往往具有比生長(zhǎng)于低鹽環(huán)境的植物更強(qiáng)的耐鹽性 [16-17]，柴達(dá)木盆地梭梭長(zhǎng)期生長(zhǎng)于鹽堿地中，具有很強(qiáng)的耐鹽性。前人對(duì)干旱區(qū)鹽生植物的生理生化研究顯示，相對(duì)于白梭梭、檉柳、胡楊、枸杞、檸條、揚(yáng)柴、沙棘、沙棗等旱生植物，梭梭具有更強(qiáng)的耐鹽性。除了在高鹽環(huán)境中Na+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、區(qū)室化作用對(duì)梭梭的生存起著關(guān)鍵作用外 [18]，抗氧化酶系統(tǒng)及時(shí)清除自由基也起著至關(guān)重要的作用。本研究通過對(duì)柴達(dá)木旱生、鹽生植物梭梭的PrxQ基因的克隆、序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以期為闡明柴達(dá)木盆地梭

梭耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究獲得的柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ基因總長(zhǎng)657 bp，編碼218個(gè)氨基酸，序列比對(duì)分析表明：柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ基因核苷酸序列與不同科屬植物PrxQ基因的同源性在405%～86.8%間，氨基酸序列同源性在33.6%～89.3%間；而與已發(fā)表的內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭PrxQ基因的核苷酸序列存在一定的差異性，其同源性為98.8%，氨基酸序列同源性為97.7%。不同地域和自然環(huán)境的梭梭不僅存在著核苷酸序列上豐富的變異，其氨基酸序列也存在著豐富的變異，從而保證了梭梭在極端環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育。

此外通過在線分析軟件預(yù)測(cè)可知，梭梭PrxQ蛋白定位于葉綠體中，且該蛋白不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白，不含跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)，為非跨膜蛋白，且屬親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，無規(guī)則卷曲為梭梭PrxQ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件。功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，PrxQ具有2個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，說明柴達(dá)木盆地梭梭可能通過PrxQ蛋白的糖基化實(shí)現(xiàn)蛋白的翻譯后調(diào)控，并參與細(xì)胞信號(hào)識(shí)別等生命過程 [19]；另外含有7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，說明梭梭PrxQ蛋白可能通過磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)依次控制基因表達(dá)并進(jìn)行細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭PrxQ蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)并獲得了其三維結(jié)構(gòu)，主要由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成。

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