三個(gè)小麥防御素基因的克隆及序列分析

史靈敏+張斌+丁漢鳳

摘要：本試驗(yàn)從濟(jì)麥22幼葉中克隆得到三個(gè)小麥防御素基因TaPDF（Triticum aestivum defensin），分別命名為T(mén)aPDF32、TaPDF33和TaPDF34（GenBank登錄號(hào)分別為BT009185、BT009167和BT009022）。序列分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)防御素基因各自含有一個(gè)長(zhǎng)度為243、249 bp和225 bp的開(kāi)放閱讀框 （open reading frame， ORF），依次編碼長(zhǎng)度為80、82個(gè)和74個(gè)氨基酸的蛋白。成熟蛋白的分子量均約為5.5 kD，等電點(diǎn)均大于7，含有8個(gè)保守的Cys殘基。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，TaPDF32含有一個(gè)γ-硫堇功能結(jié)構(gòu)域，TaPDF33和TaPDF34均含有一個(gè)Knot1功能結(jié)構(gòu)域，兩者均是植物防御素的典型結(jié)構(gòu)域，因此這三個(gè)TaPDF屬于典型的植物防御素蛋白。SWISS-MODEL在線軟件分析表明，三個(gè)TaPDF的三級(jí)結(jié)構(gòu)均由三股反平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋組成。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaPDF32、TaPDF33的氨基酸序列與玉米、粟米的防御素相似性較高，而TaPDF34與大豆的防御素相似性較高，但均與已經(jīng)報(bào)道的小麥防御素相似性較低，表明TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34是小麥三個(gè)新的防御素蛋白。熒光定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，TaPDF32、TaPDF33基因在小麥葉片中表達(dá)量最高，種子次之，根中最低；TaPDF34基因在葉、種子和根中的表達(dá)量基本相同。

關(guān)鍵詞：小麥；植物防御素；基因克??；序列分析；組織特異性表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.101 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0001-08

Abstract Three Triticum aestivum defensin （TaPDF） genes， TaPDF32， TaPDF33 and TaPDF34 （GenBank accession No. BT009185， BT009167 and BT009022）， were cloned from the young leaves of Jimai 22 cultivar. Sequence analysis showed that each had an open reading frame of 243， 249 bp and 225 bp， which encoded the proteins with 80， 82 and 74 amino acids respectively. The mature proteins， with the estimated molecular masses of all about 5.5 kD and the isoelectric points all higher than 7， each contained eight conservative cysteine residues. Conserved domain analysis found that TaPDF32 contained a strictly conserved gamma-thionin domain， while TaPDF33 and TaPDF34 each had a Knot1 function domain. Both of the domains are the typical characteristics of plant defensin. Thus， the three TaPDFs all belong to typical plant defensin proteins. Study of the three dimensional structure using SWISS-MODEL showed that all of them contained a triple-stranded anti-parallel β-sheet and an α-helix stabilized by four disulfide bridges. Phylogenetic analysis showed that TaPDF32 and TaPDF33 were close to defensins of Zea mays and Setaria italica， while TaPDF34 was close to Clycine max defensin. But they all owned low similarities with the other reported wheat defensins， which indicated that TaPDF32， TaPDF33 and TaPDF34 were three new wheat defensins. Real-time PCR analysis revealed that TaPDF32 and TaPDF33 genes had the highest expression level in leaves， followed by seeds， and the lowest level in roots. Whereas TaPDF34 expressed basically consistent in all tissues.

Keywords Triticum aestivum； Plant defensin； Gene cloning； Sequence analysis； Tissue-specific expression

植物防御素是植物天然防御系統(tǒng)的重要成員[1，2]。與昆蟲(chóng)和動(dòng)物的抗細(xì)菌特性不同，植物防御素具有抵御真菌（如尖孢鐮刀菌、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌和白色念珠菌等）感染的特性[1，3，4]。此外，植物防御素還受環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)，如干旱[5，6]、寒冷[7，8]和信號(hào)分子（茉莉酸甲酯、乙烯和水楊酸）[9，10]等均可誘導(dǎo)防御素基因表達(dá)。植物防御素分子量約為5 kD，由45～50個(gè)氨基酸組成[11]，其典型的三級(jí)結(jié)構(gòu)是由一個(gè)α-螺旋和三股反平行的β-折疊構(gòu)成的CSαβ模體結(jié)構(gòu)，以8個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵來(lái)穩(wěn)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)[12，13]。大部分植物防御素含有4個(gè)二硫鍵，但是矮牽牛的防御素PhD1和PhD2含有10個(gè)半胱氨酸殘基，形成5對(duì)二硫鍵[14，15]。盡管不同植物防御素的氨基酸序列差異很大，但其三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守[16]。通過(guò)對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾或替換某個(gè)氨基酸可以改善其生物功能或賦予新的生物活性[17]。

植物防御素以前體蛋白的形式表達(dá)，根據(jù)其前體蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為兩類(lèi)，第一類(lèi)含N端信號(hào)肽序列和C端成熟防御素結(jié)構(gòu)域，通過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)折疊后進(jìn)入分泌途徑；第二類(lèi)比第一類(lèi)多了一個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與了防御素蛋白的液泡定位并在分泌途徑中起保護(hù)細(xì)胞的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，第二類(lèi)植物防御素存在于茄科植物和禾本科植物中[14，18，19]。Peter等對(duì)來(lái)自花煙草的兩類(lèi)防御素進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，第二類(lèi)防御素比第一類(lèi)防御素抗禾谷銹病真菌的效果更好[20]。

植物防御素在植物的各個(gè)器官中都有表達(dá)，但其表達(dá)模式各不相同。大部分?jǐn)M南芥防御素類(lèi)似基因DEFL在花序中表達(dá)，只有少數(shù)在根中表達(dá)；而蒺藜苜蓿DEFL主要在固氮根瘤中表達(dá)[21，22]。在觀賞植物花煙草和矮牽牛花中，花朵發(fā)育的早期階段防御素含量很高，花煙草NaD1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要積累在花瓣、萼片、花藥和花柱的最外層細(xì)胞，這與抵抗病原體、保護(hù)生殖器官的作用是一致的[14]。綠豆防御素基因VrCRP定位在種皮的薄壁細(xì)胞中[23]；甘藍(lán)防御素基因tags118在花中特異表達(dá)[24]；而甜椒防御素基因主要在果實(shí)中特異表達(dá)[25]。蘿卜防御素基因Rs-AFP1和Rs-AFP2主要在種子萌發(fā)時(shí)特異表達(dá)，而Rs-AFP3和Rs-AFP4在葉片受到病原菌感染時(shí)特異表達(dá)[26]。 綜上所述，植物防御素主要在種子、花朵、果實(shí)、葉片等器官中表達(dá)，在豆科植物中主要在其根瘤處表達(dá)，這些都是易受病原菌感染而又非常重要的器官。

植物防御素具有廣譜抗菌性[1，3，4]，在植物抗病蟲(chóng)害基因工程中有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。冬小麥中冷誘導(dǎo)防御素基因TAD1在小麥中過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)小麥對(duì)雪霉病和赤霉病的抗性[7，8]。將油菜中的防御素基因和幾丁質(zhì)酶基因在加拿大油菜中過(guò)表達(dá)提高了其對(duì)菌核病的抗性[27]。在水稻中持續(xù)表達(dá)蘿卜防御素基因Rs-AFP2能夠抑制稻瘟病菌和立枯絲核菌的生長(zhǎng)[28]。除了天然的防御素，化學(xué)合成的防御素類(lèi)似物也能表現(xiàn)出同樣的作用。BTD-S是基于狒狒θ-防御素（BTD）設(shè)計(jì)合成的非環(huán)狀θ-防御素類(lèi)似物，將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中，可使轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出對(duì)大麗輪枝菌的抗性[29]。此外，植物防御素還具有抑制離子通道、抑制蛋白合成、抑制胰蛋白酶和α-淀粉酶活性以及耐重金屬的作用[30，31]，還能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[32]和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[33]，表明植物防御素具有廣闊的應(yīng)用前景。

防御素有一個(gè)很大的基因家族。在蒺藜苜蓿和擬南芥中分別發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)DEFL基因[34，35]，而在水稻中僅發(fā)現(xiàn)了90多個(gè)DEFL基因[36]，目前在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中分別能夠檢索到17條和43條玉米及小麥的防御素序列，其中31條小麥防御素序列為本實(shí)驗(yàn)室提交。本研究基于GenBank中登錄的小麥防御素序列，從濟(jì)麥22幼葉中克隆了3個(gè)小麥防御素基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和Real-Time PCR 組織特異性表達(dá)分析，為進(jìn)一步的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為濟(jì)麥22，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研示范區(qū)。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas產(chǎn)品，DNA聚合酶和T4 DNA 連接酶為T(mén)aKaRa產(chǎn)品，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體及菌株 pEASY-T3克隆載體、大腸桿菌（Escherichia coil） Trans1-T1 Phage Resistant 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)于全式金。

1.1.4 引物的合成 基于GenBank登錄號(hào)為BT009185（TaPDF32）、BT009167（TaPDF33）和BT009022（TaPDF34）的序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因和小麥內(nèi)參基因 β-Actin的特異性引物（表 1）。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥總RNA的提取、純化及反轉(zhuǎn)錄 取適量濟(jì)麥22的根、幼嫩葉片及種子，用TIANGEN植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。按照 Fermentas 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到完整的cDNA。所有 cDNA 樣品均存于 -20℃ 冰箱中備用。

1.2.2 TaPDF基因克隆 以小麥幼葉cDNA為模板，利用表1中的上下游引物分別克隆TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34基因。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將與目的基因大小一致的 PCR 產(chǎn)物回收，回收的目的片段連入pEASY-T3克隆載體并測(cè)序。

1.2.3 TaPDF蛋白生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi） 在線分析獲得TaPDF基因的開(kāi)放閱讀框。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線程序計(jì)算TaPDF蛋白的理化參數(shù)。通過(guò)網(wǎng)站http：//www.cbs.dtu.dk/services/上的在線軟件SignalP 4.1、TMHMM 2.0和TargetP 1.1對(duì)目的蛋白進(jìn)行信號(hào)肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位分析。利用在線網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi對(duì)目的蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）完成對(duì)目的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的在線工具BLASTP對(duì)目的蛋白的同源性進(jìn)行比對(duì)分析。用在線軟件ESPript3.0 （http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php） 進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，并通過(guò)MEGA5.0軟件中鄰近相連法 （neighbor-joining， NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（bootstrap重復(fù)1 000次）。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析 取等量小麥各組織cDNA模板，依次稀釋6個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋5倍，利用小麥內(nèi)參基因β-Actin 及TaPDF基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上得到的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率K和線性相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)公式E=5-1/K-1，計(jì)算得出擴(kuò)增效率。熒光定量的步驟按照SYBR Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系含cDNA 50 ng，2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，42個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束應(yīng)用Bio-Rad iQ5 軟件分析擴(kuò)增曲線及熔解曲線。2-ΔΔCt法[37]計(jì)算TaPDF基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaPDF基因克隆

以濟(jì)麥22幼葉cDNA為模板，用TaPDF基因特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到三條擴(kuò)增片段（圖1）。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為313、335 bp和271 bp，與預(yù)期的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一致，分別命名為T(mén)aPDF32、TaPDF33和TaPDF34。三個(gè)基因各自含有一個(gè)長(zhǎng)度為243、249 bp和225 bp的開(kāi)放閱讀框，其編碼蛋白分別含有80、82和74個(gè)氨基酸。

2.2 TaPDF蛋白的信號(hào)肽與保守結(jié)構(gòu)域分析

信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34蛋白N端均含有信號(hào)肽，長(zhǎng)度分別為31、33個(gè)和27個(gè)氨基酸。通過(guò)預(yù)測(cè)三者的跨膜區(qū)發(fā)現(xiàn)，三者均不含跨膜區(qū)。TargetP 1.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，TaPDF32、TaPDF33、TaPDF34被定位到分泌途徑，推測(cè)這三個(gè)TaPDF均為分泌型蛋白。

根據(jù)Smart軟件預(yù)測(cè)TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)TaPDF32含有植物防御素特有的γ-硫堇蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于γ-硫堇超蛋白家族；TaPDF33和TaPDF34具有Knot1結(jié)構(gòu)域，屬于Knot1超蛋白家族（圖2），兩者均是植物防御素的典型結(jié)構(gòu)域，因此這三個(gè)TaPDF屬于典型的植物防御素蛋白。

2.3 成熟TaPDF蛋白的基本特性分析

利用ProtParam軟件對(duì)3個(gè)去除信號(hào)肽的成熟TaPDF蛋白序列進(jìn)行基本特性分析，結(jié)果顯示三者均是含有8個(gè)半胱氨酸的陽(yáng)離子肽，分別由49、49個(gè)和47個(gè)氨基酸組成，分子量均約為5.5 kD，等電點(diǎn)分別為8.92、8.95和9.37，都是堿性、親水的不穩(wěn)定蛋白。

2.4 TaPDF蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用軟件SWISS-MODEL對(duì)3個(gè)小麥防御素進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，三者均含有植物防御素所特有的1個(gè)α-螺旋和3股反向平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，與其它物種防御素蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似。

2.5 TaPDF蛋白序列比對(duì)

利用ESPript軟件對(duì)本研究獲得的3個(gè)小麥防御素蛋白序列與GenBank中本實(shí)驗(yàn)室提交的31條小麥防御素序列（登錄號(hào)：AIA66986.1～AIA67016.1）和另外2條小麥防御素序列（登錄號(hào)：BAC10287.1和AGX26528.1）進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果如圖3所示，小麥防御素家族的蛋白序列差異很大，僅信號(hào)肽序列的亮氨酸、γ-硫堇蛋白結(jié)構(gòu)域的8個(gè)半胱氨酸和1個(gè)甘氨酸是完全保守的，其他氨基酸均存在一定的差異。8個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵以Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7的方式連接，穩(wěn)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將3個(gè)TaPDF分別在NCBI上進(jìn)行BLASTP，檢索到序列相似性較高的植物防御素進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。利用MEGA5.0軟件鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。本研究獲得的三個(gè)TaPDF分別位于進(jìn)化樹(shù)的不同分支上，且與大部分的小麥防御素不在同一支上，僅TaPDF33與另一個(gè)小麥防御素及粟米等的防御素聚為一支；而TaPDF32和玉米、粟米等的防御素聚為一支；TaPDF34則與豆科和茄科等的防御素聚成一支。說(shuō)明TaPDF32～34與已經(jīng)提交的小麥防御素序列具有較低的相似性，為小麥防御素家族的新成員。

2.7 TaPDF基因的組織特異性表達(dá)分析

為研究三個(gè)TaPDF基因在小麥不同器官中的表達(dá)差異，以濟(jì)麥22幼嫩葉片、種子和根的cDNA為模板，以小麥β-Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。結(jié)果表明，內(nèi)參基因β-Actin和TaPDF 基因引物的擴(kuò)增效率在95.0%～105.0%之間，符合qRT-PCR對(duì)擴(kuò)增效率要求；熒光定量的熔解曲線峰單一，判斷無(wú)雜帶。由圖5可知，TaPDF32和TaPDF33在葉中的表達(dá)量最高，種子次之，根最少，但種子和根中差異不明顯；TaPDF34在葉、種子和根中的表達(dá)量基本相同。

3 討論與結(jié)論

第一個(gè)植物防御素基因是1990年從小麥[38]和大麥[39]的胚乳中分離出來(lái)的，最初被歸類(lèi)為γ-硫堇家族，后來(lái)隨著新的植物γ-硫堇類(lèi)似蛋白的鑒定，發(fā)現(xiàn)了γ-硫堇與傳統(tǒng)硫堇蛋白之間在結(jié)構(gòu)上存在差異[26，40]，又因?yàn)槠渑c哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)的防御素蛋白結(jié)構(gòu)與功能類(lèi)似，所以將其重新命名為“植物防御素”[26]。2005年，Egorov等利用三步高效液相層析法在六倍體小麥 （T. kiharae） 種子中發(fā)現(xiàn)了24個(gè)新的小麥抗菌肽，其中11個(gè)屬于植物防御素，并根據(jù)N端序列的同源性分成三個(gè)亞組，6個(gè)Tk-AMP-D肽屬于第一組（D組），Tk-AMP-γ1、Tk-AMP-γ2和Tk-AMP-γ3屬于第二組，Tk-AMP-ω2和Tk-AMP-ω3屬于第三組[41]。2007年，Odintsova等[42]通過(guò)組合色譜的方法又在T. kiharae種子中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)屬于D組的防御素，因與D1和D6共洗脫下來(lái)，將其分別命名為D1.1和D1.6，兩次試驗(yàn)共鑒定出8個(gè)D組防御素基因。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)普通小麥也含有全部的D組防御素基因。氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，D組防御素具有很高的序列同源性（尤其是N端），但是C端保守結(jié)構(gòu)域的Cys6和Cys7之間的部分氨基酸的突變和插入缺失引起了氨基酸序列及長(zhǎng)度的多態(tài)性。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)獲得的3個(gè)TaPDF蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的33條TaPDF序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在保守結(jié)構(gòu)域的Cys6和Cys7之間也存在氨基酸的插入缺失現(xiàn)象，其中3條TaPDF在保守結(jié)構(gòu)域的Cys1與Cys2以及Cys4與Cys5之間也出現(xiàn)個(gè)別氨基酸的插入。

基因的多樣性可以由古老基因的點(diǎn)突變和插入缺失引起[43]，Wu等對(duì)幾種禾本科植物的防御素類(lèi)似基因的進(jìn)化進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米、水稻、高粱和二穗短柄草中片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)推動(dòng)了防御素類(lèi)似基因進(jìn)化過(guò)程，然而，4個(gè)物種的7個(gè)防御素類(lèi)似基因在進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的[44]。TaPDF在進(jìn)化過(guò)程中可能也會(huì)發(fā)生基因重排、串聯(lián)重復(fù)、插入和缺失等情況從而導(dǎo)致TaPDF多樣性[41，42]。本試驗(yàn)得到的三個(gè)TaPDF蛋白與已知的TaPDF序列差異較大，僅信號(hào)肽序列的亮氨酸、γ-硫堇蛋白結(jié)構(gòu)域的8個(gè)半胱氨酸和1個(gè)甘氨酸是完全保守的。對(duì)小麥及其他物種的防御素蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)部分TaPDF聚為一支，而TaPDF32～34則位于另外的三個(gè)不同分支上，表明其與其它TaPDF具有不同之處。

植物防御素主要在種子、花朵、果實(shí)、葉片等器官中表達(dá)，而這些都是易受病原菌感染而又非常重要的器官。綠豆VrCRP、甜椒PDF和蘿卜Rs-AFP1和Rs-AFP2主要在果實(shí)和種子中表達(dá)[23， 25， 26]，花煙草NaD1、矮牽?；≒hD1和甘藍(lán)tags118則主要在花中表達(dá)[14，24]。通過(guò)熒光定量RT-PCR對(duì)TaPDF32～34進(jìn)行組織特異性分析，發(fā)現(xiàn)TaPDF32和TaPDF33均在葉片中表達(dá)量高，在種子和根中表達(dá)量比較低；而TaPDF34在葉片、種子和根中的表達(dá)量基本一致。

參 考 文 獻(xiàn)：

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