桑樹(shù)白藜蘆醇合酶基因全長(zhǎng)克隆及序列分析

夏海武+曹慧+王效忠

摘要：根據(jù)已知的其他物種白藜蘆醇合酶cDNA保守序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR技術(shù)從桑葚中擴(kuò)增獲得白藜蘆醇合酶基因部分cDNA序列，再用RACE技術(shù)獲得其兩端序列，并拼接得到完整的1 442 bp白藜蘆醇合酶基因。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)白藜蘆醇合酶基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸，氨基酸序列含有芪合酶家族特征信號(hào)區(qū)GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;該基因與花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高達(dá)82.82%，氨基酸序列的同源性高達(dá)87.15%。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù);白藜蘆醇合酶基因;RT-PCR;RACE技術(shù);序列分析

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0017-04

收稿日期：2014-07-09

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2010CL022）;山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濰坊學(xué)院）開(kāi)放課題（編號(hào)：2012SWKF02）。

作者簡(jiǎn)介：夏海武（1958—），男，山東濰坊人，博士，教授，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：xiahaiwu206@163.com。

桑葚為?？坡淙~喬木桑樹(shù)（Morus alba Linn.）的果實(shí)，聚花果，每年4—6月份成熟，不同生長(zhǎng)環(huán)境、不同品種的果實(shí)之間存在差異。中國(guó)地大物博，桑葚資源豐富，全國(guó)各省份均有桑樹(shù)的分布[1-2]。桑葚含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有食用及中藥材之用，早在2 000多年前，它就成為皇帝的御用藥品之一。1993年，國(guó)家衛(wèi)生部把桑葚列為“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品之一[3]。現(xiàn)已證明桑葚具有6種防病保健功能，包括防癌抗誘變、增強(qiáng)免疫力、保腎護(hù)肝、駐顏抗衰老、促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)、降低血糖血脂等[4]，這些保健功能主要依賴(lài)于桑葚中含有的一種叫白黎蘆醇的芪類(lèi)物質(zhì)，它具有抗氧化及消除自由基功效，有防癌、抗炎、預(yù)防心血管疾病、抗衰老等功能[5-6]。白藜蘆醇和其他芪類(lèi)化合物均屬于次生代謝物，其生物合成途徑是苯丙氨酸-丙二酸，在白藜蘆醇合成全過(guò)程中，白藜蘆醇合酶（RS）是代謝途徑中最后一個(gè)起作用的關(guān)鍵酶[7]，也是合成途徑中唯一必需的合成酶，它催化1分子4-香豆酰輔酶A和3分子丙二酰輔酶A反應(yīng)合成白藜蘆醇[8]。白藜蘆醇合成的底物在植物體內(nèi)廣泛存在，白藜蘆醇的合成及含量控制主要依賴(lài)于白藜蘆醇合酶基因的表達(dá)狀況[9]，但大多數(shù)植物不含白藜蘆醇合酶或含量很低。目前，雖然發(fā)現(xiàn)含有白藜蘆醇的植物已有70多種，但要從天然植物中提取到高豐度的白藜蘆醇比較困難，并且提取成本較高。利用基因工程技術(shù)使更多的植物產(chǎn)生白藜蘆醇或提高植物體內(nèi)白藜蘆醇的含量，滿(mǎn)足人們醫(yī)療保健需求具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 目前，已從松樹(shù)、花生、葡萄、爬山虎、大黃等植物中分離到白藜蘆醇合酶基因，但還沒(méi)有從桑葚中克隆白藜蘆醇合酶基因全長(zhǎng)序列的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 桑樹(shù)接近成熟的果實(shí)，采自山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。采后洗凈，每2 g為1份，裝于5 mL離心管中，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.1.2 試劑盒、酶和試劑 DNA片段快速純化/回收試劑盒，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)于Fermenta公司;RACE試劑盒，ClonTech公司產(chǎn)品;pMD 18-T Vector Kit、Marker （DL2000）、T4-DNA連接酶、5.0 U/μL Taq DNA polymerase，購(gòu)于TaKaRa生物工程 （大連）有限公司;其他試劑，分析純，均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口。

1.1.3 試驗(yàn)用具與耗材的預(yù)處理 用于RNA提取的研缽、藥匙、鑷子、50 mL離心管、試劑瓶等器具，用0.1% 焦炭酸二乙酯處理過(guò)夜;無(wú)RNA酶的專(zhuān)用槍頭、PCR管、1.5 mL離心管等耗材，經(jīng)1.1 MPa、121 ℃高壓滅菌30 min或在干燥箱中60 ℃烘干，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚總RNA的提取與檢測(cè)

1.2.1.1 桑葚總RNA的提取 迅速?gòu)?80 ℃冰箱中取出桑葚2 g，置于用液氮預(yù)冷的研缽中，加入PVPP 0.2 g，研磨成細(xì)粉末，在研磨時(shí)不斷加入液氮以不讓組織解凍;在50 mL離心管中，加入經(jīng)65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液20 mL和β-巰基乙醇400 μL，倒入研磨好的桑葚細(xì)粉末，充分振搖混勻，65 ℃水浴30 min;取出，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比49 ∶ 1），混勻，于4 ℃、20 000 g離心20 min;將上層水相移至另1支離心管中，加入1/4體積10 mol/L氯化鋰，混勻，4 ℃冰箱沉淀過(guò)夜;4 ℃、20 000 g離心20 min，棄上清，用2 mol/L氯化鋰洗滌沉淀1次，4 ℃、20 000 g離心 10 min，取沉淀;用2 mL無(wú)RNase的ddH2O溶解沉淀，轉(zhuǎn)入4個(gè)1.5 mL離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇（體積比49 ∶ 1）顛倒混勻，于4 ℃、20 000 g 離心20 min;將上層水相移至新的離心管中，加入1/10體積3 mol/L、pH值為5.2的乙酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，置于-20 ℃冰箱1 h以沉淀RNA;4 ℃、20 000 g離心 15 min，棄上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，真空抽干5 min;加入100 μL無(wú)RNase的ddH2O充分溶解，放-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 電泳檢測(cè) 將電泳槽、制膠板、梳子等用DNA-RNA Away處理，晾干，用1×TAE電泳緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠;待凝固，點(diǎn)入3 μL提取的RNA樣品，在預(yù)冷的1×TAE電泳緩沖液中，100 V電壓條件下電泳20 min左右;觀(guān)察凝膠成像儀上RNA條帶的清晰度和完整性，拍照。

1.2.2 桑葚芪合酶保守區(qū)cDNA的克隆

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中葡萄和花生白藜蘆醇合酶基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)桑葚白藜蘆醇合酶基因保守區(qū)的上、下游引物。上游引物（BP1）為：5′-GGCCAGCCAATGTCTAAGATCAC-3′，下游引物（BP2）為：5′-CTGCGGAGGACAACAGTTTCAAC-3′，由上海生工生物技術(shù)有限服務(wù)公司合成。

1.2.2.2 桑葚白藜蘆醇合酶保守區(qū)cDNA的RT-PCR擴(kuò)增 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，50 μL反應(yīng)體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 5.0 μL，cDNA 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，其余產(chǎn)物用于回收。

1.2.2.3 目的片段的回收 從瓊脂糖凝膠上切下目的片段條帶稱(chēng)重，裝入1.5 mL離心管中，按照北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司的DNA片段快速純化/回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，得到純化的PCR產(chǎn)物。

1.2.2.4 目的片段與載體的連接與轉(zhuǎn)化 按TaKaRa公司的pMD 18-T Vector Kit說(shuō)明書(shū)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及其轉(zhuǎn)化采用CaCl2法。

1.2.2.5 重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)與測(cè)序 挑取白色菌斑置于加抗生素的LB培養(yǎng)基中，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，20 μL反應(yīng)體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，菌液2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.3 μL，加無(wú)菌ddH2O 至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 15 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，在凝膠成像儀上觀(guān)察并拍照，并將擴(kuò)增出目的條帶的樣品菌液送上海生工生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 桑葚芪合酶cDNA全長(zhǎng)的克隆

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)保守區(qū)cDNA的測(cè)序結(jié)果和ClonTech公司BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書(shū)要求，設(shè)計(jì)3′RACE上游引物（SP2）為：5′-CTATCTTAACAAGAGTGTTCCCG-3′和5′RACE下游引物（SP1）為：5′-GCGGTATTCTCAGAGCAAACAATGAG-3′，引物序列委托上海生工生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司合成。

1.2.3.2 第一鏈cDNA的合成 按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，5′RACE CDS 引物序列為：5′-（T）25VN-3′，（N=A、C、G或T;V=A、G或C）;3′RACE CDS 引物序列為：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30VN-3′;BD SmartⅡ A oligo序列：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′。

1.2.3.3 cDNA末端的快速擴(kuò)增 3′RACE PCR擴(kuò)增體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL ，10 μmol/L SP2 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。5′RACE PCR擴(kuò)增體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，5′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP1 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。其中，UPM是通用引物混合物，其長(zhǎng)序列為：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短序列為：5′-CTAATACGACTCACTATAGGG C-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。取10 μL產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，其余產(chǎn)物用于回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物，進(jìn)行電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選。

1.2.3.4 重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè) 將白斑挑起，液體培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。20 μL反應(yīng)體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，菌液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP（5′ RACE加SP1，3′RACE加SP2） 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加無(wú)菌ddH2O 至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。取10 μL產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，將含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌液送上海生工生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚總RNA的提取結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，提取的桑葚總RNA樣品可以看到3條帶，分別為28S、18S和5S，其中28S、18S條帶整齊清楚，且28S條帶比18S條帶更亮，5S條帶非常暗淡，這說(shuō)明桑葚的總RNA完整性較好，沒(méi)有出現(xiàn)降解。RT-PCR擴(kuò)增和RACE試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，提取的桑葚總RNA質(zhì)量較高、完整性好，能滿(mǎn)足多數(shù)分子生物學(xué)試驗(yàn)要求。

2.2 桑葚白藜蘆醇合酶保守區(qū)cDNA的PCR擴(kuò)增與序列分析

將桑葚總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板，以BP1和BP2為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條800 bp左右的特異條帶（圖2）。

將該產(chǎn)物進(jìn)行克隆、菌液PCR檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的相應(yīng)菌液送樣測(cè)序，結(jié)果表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物的大小為806 bp。由此推導(dǎo)出的氨基酸序列編碼268個(gè)氨基酸，其中包含植物芪合酶的活性中心和家族特征信號(hào)區(qū)，該P(yáng)CR產(chǎn)物是桑葚白藜蘆醇合酶保守區(qū)cDNA片段。

2.3 桑葚白藜蘆醇合酶cDNA的RACE與序列分析

在桑葚白藜蘆醇合酶保守區(qū)cDNA內(nèi)，各設(shè)計(jì)1條正向引物SP2和反向引物SP1，采用BD SMARTTM RACE 技術(shù)，分別進(jìn)行3′端和5′端的PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果表明，3′RACE和5′RACE特異條帶的大小均在500～750 bp之間（圖3、圖4）。將這2個(gè)特異片段進(jìn)行克隆、菌液PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，3′RACE和5′RACE樣品電泳都有預(yù)計(jì)大小的特異條帶。測(cè)序結(jié)果表明，3′RACE產(chǎn)物的大小為635 bp，該序列與保守區(qū)有361 bp的重疊區(qū)，在第481～485 bp處存在加尾信號(hào)序列AATAA，在序列的末端含有19個(gè)A的poly（A）尾巴;5′RACE產(chǎn)物的大小為585 bp，該序列與保守區(qū)有232 bp的重疊區(qū)。由此推斷，這2個(gè)片段分別是桑葚白藜蘆醇合酶cDNA的3′端和5′端。

2.4 桑葚白藜蘆醇合酶cDNA全長(zhǎng)的獲得與序列分析

由圖5可見(jiàn)，桑葚白藜蘆醇合酶cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)度為 1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸，該氨基酸序列含有芪合酶的活性中心序列GCFAGGTVLR和家族特征信號(hào)區(qū)GVLFGFGPGLT;在起始密碼子ATG上游有11 bp的5′端非編碼區(qū)，在終止密碼子TAA下游有259 bp的3′端非編碼區(qū)序列，其中，在第1286～1290 bp為加尾信號(hào)AATAA。

將桑葚與其他植物白藜蘆醇合酶基因編碼區(qū)核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果（表1）表明，桑葚白藜蘆醇合酶與花生的同源性較高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高分別達(dá)到82.82%和87.15%，與葡萄的同源性在60%左右。這說(shuō)明桑葚白藜蘆醇合酶基因與以往克隆的白藜蘆醇合酶基因有一定的進(jìn)化距離。

3 結(jié)論

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)至少21科31屬72種植物中存在白藜蘆醇，日常生活中人們喜聞樂(lè)見(jiàn)的食物如葡萄、桑葚、花生、鳳梨等含有白藜蘆醇，許多常見(jiàn)的藥用植物中也含有白藜蘆醇，如決明、藜蘆、何首烏、虎杖等。已有資料表明，不同類(lèi)群植物中白藜蘆醇的含量差異很大，且多數(shù)植物中白藜蘆醇含量都很低。筆者用高效液相色譜法測(cè)得桑葚中白藜蘆醇的鮮質(zhì)量

含量為26.88 μg/g[10]，這說(shuō)明桑葚中具有較高活性的白藜蘆醇合酶基因。本試驗(yàn)采用RACE方法成功克隆出桑葚的白藜蘆醇合酶基因全長(zhǎng)，為白藜蘆醇合酶的基因工程奠定了良好的基礎(chǔ)。

表1 桑葚與花生、葡萄白藜蘆醇合酶基因編碼區(qū)核苷酸

和氨基酸序列同源性比較

植物名稱(chēng) 基因登錄號(hào) 核苷酸序列

同源性（%） 氨基酸序列

同源性（%）

桑葚 100 100

花生 AB027606 80.68 85.60

花生 AF227963 81.37 85.09

花生 AY170347 81.20 84.83

花生 AY826726 80.94 86.38

花生 DQ124938 80.85 85.60

花生 L00952 82.82 87.15

葡萄 AB046373 60.77 66.07

葡萄 AB046374 60.69 66.33

葡萄 AB046375 60.45 65.82

葡萄 AF128861 60.22 66.84

葡萄 AF274281 64.55 65.05

葡萄 DQ366301 63.16 66.58

葡萄 DQ366302 64.29 65.56

參考文獻(xiàn)：

[1]李冬香，陳清西. 桑葚功能成分及其開(kāi)發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（24）：293-297.

[2]潘訓(xùn)海，劉新露，羅惠波，等. 桑葚果酒酵母的分離及篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：249-251.

[3]吳祖芳，翁佩芳. 桑椹的營(yíng)養(yǎng)組分與功能特性分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2005，5（3）：102-107.

[4]黃 勇，張 林，趙衛(wèi)國(guó)，等. 桑椹的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 廣西蠶業(yè)，2006，43（3）：15-19.

[5]Jang M，Cai L，Udeani G O，et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes[J]. Science，1997，275（5297）：218-220.

[6]Chan M M. Antinicrobial effect of resveratrol on dernatophytes and bacterial pathogens of the skin[J]. Biochem Phamacol，2002，63（2）：99-104.

[7]Rolfs C H，F(xiàn)ritzemeier K H，Kindl H. Cultured cells of Arachis hypogaea susceptible to induction of stilbene synthase（resveratrol-forming）[J]. Plant Cell Reports，1981，1（2）：83-85.

[8]Lanz T，Schroder G，Schroder J. Differential regulation of genes for resveratrol synthase in cell-cultures of Arachis hypogaea[J]. Planta，1990，181（2）：169-175.

[9]Schwekendiek A，Pfeffer C，Kindl H. Pine stilbene synthase cDNA，a tool for probing environmental stress[J]. Federation of European Biochemical Societies Letters，1992，301（1）：41-44.

[10]夏海武，呂柳新. 幾種果實(shí)中白黎蘆醇含量的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（12）：99-100，131.