• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因StMR1回復載體的構建

    2015-09-10 21:00賈慧等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2015年8期
    關鍵詞:黑色素突變體病菌

    賈慧等

    摘要: 為研究玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]的功能,采用PCR方法克隆得到[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因3 021 bp的OFR序列,將其插入到含有色氨酸強啟動子、GFP和bar基因抗性的質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上構建回復載體pBARKS1-MR-eGFP,通過測序、雙酶切驗證載體構建情況。結果顯示,pBARKS1-MR-eGFP載體構建成功,可以進行基因回復轉化試驗。該結果為進一步確定黑色素合成調(diào)控途徑,進而明確黑色素合成調(diào)控機制奠定基礎。

    關鍵詞: 玉米大斑病菌;黑色素;調(diào)控基因;[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]

    中圖分類號: S435.131.4+9 文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2015)08-0024-03

    玉米大斑病在世界范圍內(nèi)廣泛存在,是我國冷涼地區(qū)如東北、華北和西南玉米區(qū)重要葉部病害 [1-2],種植感病品種如遇到流行年份可減產(chǎn)50%以上。例如,2012年受布拉萬臺風的影響,東北地區(qū)潮濕多雨,玉米大斑病大暴發(fā),平均危害程度3~5級,嚴重地塊達9級。引起該病害的病原菌屬半知菌突臍蠕孢屬,1876年在意大利首次報道,其無性態(tài)為玉米大斑凸臍蠕孢菌(Exserohilum turcicum),有性態(tài)為玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)。有研究發(fā)現(xiàn),玉米大斑病菌代謝產(chǎn)生的DHN黑色素是該病菌致病的重要毒力因子,沉積在真菌特化結構、附著在胞細胞壁和細胞膜之間,產(chǎn)生機械壓力突破寄主表皮細胞,使植物染病 [3]。

    DHN黑色素合成途徑至少有聚酮體合成酶、還原酶、脫水酶、氧化酶4類蛋白酶參與。起始于1個聚酮體合成酶(polyketide synthase),催化醋酸鹽合成1,3,6,8-4THN,經(jīng)還原酶(1,3,6,8-tetra-HN reductase)催化合成小柱孢酮(scytalone),脫水酶(scytalone dehydratase)催化合成1,3,8-THN,還原酶(1,3,8-tetra-HN reductase)催化合成柱孢醌(vermelone),再經(jīng)脫水酶催化合成1,8-DHN,最后經(jīng)氧化酶(laccase)氧化聚合形成1,8-DHN黑色素。另外,該途徑中還存在一種調(diào)控黑色素生物合成的轉錄因子MR [4]。研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控黑色素合成的轉錄因子能夠調(diào)節(jié)黑色素合成途徑中的多個關鍵酶基因的表達,進而影響黑色素的生成,改變病原菌致病力。水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)中黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]BMR1突變后,菌落顏色變白,過表達菌株的BMR1[WTBZ][STBZ]表達量高于野生型的10倍 [5]。葫蘆刺盤孢(Colletotrichum lagenarium)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)中Cmr1p和Pig1p是黑色素合成轉錄因子,編碼基因[WTBX][STBX]Cmr1和Pig1[WTBZ][STBZ]突變后病原菌的黑色素合成受到影響,回復突變后,病原菌生長表型與野生型相似,說明功能回復到正常水平 [4]。甘藍鏈格孢(Alternaria brassicicola)黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]Amr1[WTBZ][STBZ]突變后,病原菌菌落顏色變淺,接種白菜葉片發(fā)現(xiàn)致病力較野生型增強 [6]。同時,文獻報道,絲狀真菌中黑色素合成酶基因缺失或沉默,黑色素合成則會受到影響,病原菌的致病力也有不同程度的變化 [7]。玉米大斑病菌中聚酮體合成酶基因(StPKS)RNAi的幾株轉化子黑色素合成受到不同程度的干擾 [8];玉米大斑病菌中HN還原酶基因([WTBX][STBX]3HNR[WTBZ][STBZ])突變則形成淺褐色突變菌株 [9];玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)脫水酶基因([WTBX][STBX]scl1[WTBZ][STBZ])缺失后形成橙紅色菌落 [10];條件致病真菌新型隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)氧化酶基因[WTBX][STBX]LAC1缺失后,菌落顏色發(fā)生了變化,而同工酶基因LAC2的轉錄水平遠遠低于LAC1[WTBZ][STBZ]基因,該基因缺失后,病原菌黑色素合成速度延遲,合成量并未受到影響 [11]。目前,以抑制黑色素合成過程中從1,3,6,8-四羥基萘到小柱孢酮、1,3,8-三羥基萘到柱孢醌的2步脫氫反應的2個還原酶為靶點開發(fā)的特異性抑制劑——三環(huán)唑(tricyclazole)作為新型殺菌劑防治稻瘟病菌,有良好效果 [12]。本研究室前期克隆到黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ],利用基因敲除技術獲得了該基因的2株基因缺失突變體,初步分析了突變體的生長發(fā)育、黑色素合成及致病性等與野生型的差別,初步明確了該基因的功能,發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因缺失后,病原菌生長速度沒有明顯變化,黑色素含量顯著降低,致病力明顯減弱。本試驗在前期研究的基礎上構建[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因回復載體,從而對[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因功能及黑色合成調(diào)控機制進行深入研究,以闡明玉米大斑病菌的致病機制,也可以為研發(fā)新型殺菌劑、探索新的防治途徑提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    玉米大斑病菌菌株01-23、pBARKS1-eGFP載體、大腸桿菌(Eschrichia coli)DH5α感受態(tài)細胞、SDS堿裂解溶液(溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),由河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存或配制;UNIQ-10柱式Trizol RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DEPC、DNaseⅠ(RNase free)、RNasin、dNTP Mixture、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶,購自寶生物(大連)有限公司;引物的合成和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

    1.2 總RNA的提取

    參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書,取經(jīng)PD液體培養(yǎng)基21 ℃、黑暗培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌絲,濾紙吸干,取0.1 g用液氮研磨成粉末,轉移至1.5 mL離心管中,加入Trizol試劑 1 mL,并用槍頭反復吹打,室溫放置5~10 min,使核蛋白與核酸完全分離;加入200 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇(24 ∶ 1)劇烈振蕩30 s,室溫放置3 min,12 000 r/min 4 ℃離心10 min;吸取上層水相轉移至干凈離心管中,加入 1/2 體積無水乙醇,混勻;將吸附柱放入收集管中,用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中,靜置 2 min,12 000 r/min 離心3 min,倒掉收集管中廢液;將吸附柱放入收集管中,加入500 μL RPE Solution,靜置 2 min,10 000 r/min 離心30 s,倒掉收集管中廢液(檢查RPE Solution是否已經(jīng)按比例加入無水乙醇),此步驟重復1次;將吸附柱放回收集管中,10 000 r/min離心2 min,將殘余的乙醇去除;將吸附柱加入干凈的1.5 mL離心管中,在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated ddH2O,靜置5 min,12 000 r/min離心2 min,提取得到RNA樣品溶液,-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩E渲?0%瓊脂糖凝膠,電泳檢測得到的總RNA的純度及完整性;紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

    1.3 反轉錄合成第一鏈cDNA

    反轉錄反應:1 μg模板RNA,1 μL Oligo (dT)12~18 Primer(50 μmol/L),RNase free ddH2O補充至6 μL,70 ℃保溫 10 min 后迅速在冰上急冷2 min以上,離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于微管底部;在該微管中加入5×M-MLV buffer 2 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L) 0.5 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL,RTase M-MLV(RNase H-,200 U/μL)0.25~1 μL,RNase free ddH2O補充至 10 μL;42 ℃保溫1 h,70 ℃滅活反轉錄酶活性15 min,插冰上冷卻;反應合成第一鏈cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 基因ORF序列的獲得

    分析 基因序列的酶切位點,根據(jù)載體pBARKS1-eGFP上的多克隆位點,設計帶有酶切位點NotⅠ和SmaⅠ的特異引物MGF、MGR,擴增 基因的ORF序列。

    擴增體系:2 μL模板cDNA,MGF(10 μmol/L)1.0 μL,MGR(10 μmol/L)1.0 μL,2.5 μL 10×Taq buffer(Mg 2+Plus),2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L),0.3 μL Taq DNA聚合酶(5 U),ddH2O 16.2 μL。

    擴增程序:95 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性 30 s,61 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸4 min,35個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,紫外凝膠成像儀(Bio-Rad)觀察結果顯示,DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴增產(chǎn)物。

    1.5 基因回復載體的構建

    將回收PCR擴增產(chǎn)物和pBARKS1-eGFP載體用 SmaⅠ、NotⅠ雙酶切,酶切體系為pBARKS1-eGFP質(zhì)粒DNA 2 μL(PCR回收產(chǎn)物5 μL),SmaⅠ、NotⅠ各1 μL,緩沖液 2 μL,ddH2O補充至10 μL,37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收線性[JP2]質(zhì)粒片段和PCR產(chǎn)物。然后進行連接反應,反應體系為PCR擴增產(chǎn)物5 μL、pBARKS1- eGFP線性質(zhì)粒 1 μL、T4連接酶(350 U/μL)1 μL、10×ligation buffer 1 μL(終濃度為1×),用dd H2O補至10 μL,最適連接溫度為 16 ℃,時間為1~3 h或過夜;將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α,37 ℃培養(yǎng)過夜,隨機挑取白色單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp+)[JP2]中,37 ℃、220 r/min 下振蕩培養(yǎng)5~6 h;取2 μL菌液作模板,利用pBARKS1-eGFP載體上的通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進行PCR檢測;選取PCR檢測陽性的單克隆測序;將測序正確的陽性克隆命名為pBARKS1-MR-eGFP。

    2 結果與分析

    2.1 玉米大斑病菌總RNA的提取

    利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取PD培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌體的總RNA,紫外分光光度計測定D260 nm/D280 nm=1.98,濃度為35.7 μg/μL,表明所提取的總RNA質(zhì)量較好、無蛋白質(zhì)、DNA及小分子的污染。瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示28S、18S、5S特征條帶清晰(圖1),說明總RNA質(zhì)量較好,無降解,可以用于cDNA第一鏈的合成。

    2.2 基因ORF序列的擴增

    利用 基因序列的酶切位點,結合載體質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上的多克隆位點,最終選用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SmaⅠ,設計1對帶有酶切位點的特異引物,以反轉錄的cDNA為模板,擴增 基因ORF序列,得到3 021 bp的條帶,與預期大小相符(圖2)。

    2.3 pBARKS1和pBARKS1-eGFP載體的酶切驗證

    提取pBARKS1載體質(zhì)粒,用NotⅠ和SmaⅠ進行雙酶切,得到線性質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示有單一的 4 500 bp 條帶(圖3-A);提取pBARKS1-eGFP載體質(zhì)粒,用EcoRⅠ和SacⅠ進行雙酶切,得到線性載體pBARKS1和GFP片段,瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示有4 500、720 bp 等2條條帶(圖3-B)。說明pBARKS1-eGFP質(zhì)粒載體正確。

    2.4 回復載體的構建

    將PCR產(chǎn)物分別和pBARKS1-eGFP用NotⅠ和SmaⅠ進行雙酶切,回收目的片段后將帶有相同黏性末端的PCR產(chǎn)物和線性的pBARKS1-eGFP連接,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,轉化后選擇白色單克隆進行菌液檢測,引物用載體通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進行PCR擴增驗證,挑取陽性克隆進行測序,結果正確,得到pBARKS1-MR-eGFP重組載體(圖4)。載體pBARKS1-MR-eGFP全長約8 241 bp,NotⅠ與SmaⅠ雙酶切得到大小為5 220、3 021 bp的條帶,結果均與預期大小相符(圖5),玉米大斑病菌黑色素調(diào)控基因 的基因回復表達載體構建成功。

    3 結論與討論

    目前,隨著DNA測序技術的飛速進步,很多絲狀真菌已經(jīng)完成了基因組測序工作,對其研究已步入后基因組時代,分析和確定基因的功能及關聯(lián)性正成為分子生物學及遺傳學研究[CM(25]的熱點 [13]。研究真菌基因功能的方法有很多種,如基因敲[CM)]

    除/置換(gene knockout )、RNA干擾(RNA interference,RNAi)、基因標記(gene tagging)、基因超表達(over expression)、體外轉座子標記(in vitro transposon tagging)、異源表達(heterologous expression)和酵母雙雜交(yeast two-hybrid system)等?;蚯贸夹g是一種遺傳工程修飾技術,某個基因一旦被確定有研究價值,往往最為直接的方式之一就是將其從基因組中敲除或置換,而后測定相關指標,明確其功能 [14]。該技術是通過同源重組的方法將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位置,經(jīng)過外源DNA序列與靶細胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組或置換,達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的,從而改變細胞的遺傳特性 [15]。回復突變(reverse mutation)指基因缺失突變體經(jīng)過第2次突變又完全或部分恢復為原來的基因型和表現(xiàn)型,基因超表達指目的基因的全長序列與高活性組成型啟動子或組織特異性啟動子融合,通過轉化,獲得該基因編碼產(chǎn)物大量積累,這2種技術的應用更豐富了基因功能研究的證據(jù)。研究方案中通常會設計創(chuàng)制基因敲除突變體、回復突變體和超表達突變體。筆者所在實驗室前期克隆到玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因 序列,并創(chuàng)制了基因敲除突變體(結果待發(fā)表),在此基礎上,本試驗構建了含有色氨酸強啟動子、綠色熒光蛋白編碼基因GFP和草胺磷抗性基因bar的回復載體pBARKS1-MR-eGFP,可將重組的載體通過PEG介導轉化玉米大斑病菌黑色素合成基因 缺失突變體的原生質(zhì)體,或玉米大斑病菌野生型菌株的原生質(zhì)體,利用草胺磷抗性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)獲得草胺磷抗性轉化子,通過分析bar基因、GFP基因及2個同源臂DNA序列設計特異引物,對轉化子進行PCR初步篩選,將篩選的轉化子用bar基因和GFP基因為探針進行Southern blot驗證是否為該基因的回復突變體或超表達突變體,并對該突變菌株進行各項研究分析,如表型分析,附著胞形成能力及穿透能力、毒素產(chǎn)生能力、分生孢子萌發(fā)及突變菌株的侵染能力等,從而對 基因功能進行深入研究。另外,該載體含有綠色熒光蛋白基因GFP,在生物體內(nèi)可以表達綠色熒光蛋白,通過熒光顯微鏡(熒光共聚焦顯微鏡)定位目的蛋白的位置。

    參考文獻:

    [1] [JP3]王會偉,李洪杰,朱振東,等. Ht2背景下玉米對大斑病菌1號小種抗[JP2]性基因的表達差異研究[J]. 植物病理學報,2010,2(2):135-143.

    [2][JP3]郭麗媛,賈 慧,曹志艷,等. 玉米大斑病菌有性雜交后代的交配型與 寄生適合度分化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(19):4058-4065.

    [3] 范永山,谷守芹,董金皋,等. MAPK途徑對玉米大斑病菌HT-毒素產(chǎn)生和生物學活性的調(diào)控作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2008,1(9):86-92.

    [4]Tsuji G,Kenmochi Y,Takano Y,et al. Novel fungal transcriptional activators,[WTBX][STBX]Cmr1p[WTBZ][STBZ] of Colletotrichum lagenarium and [WTBX][STBX]Pig1p[WTBZ][STBZ] of Magnaporthe grisea,contain [WTBX][STBX]Cys2His2[WTBZ][STBZ] zinc finger and Zn(Ⅱ)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding motifs and regulate transcription of melanin biosynthesis genes in a developmentally specific manner[J]. Molecular Microbiology,2000,38(5): 940-954.[HJ1.65mm]

    [5]Kihara J,Moriwaki A,Tanaka N,et al. Characterization of the [WTBX][STBX]BMR1[WTBZ][STBZ] gene encoding a transcription factor for melanin biosynthesis genes in the phytopathogenic fungus Bipolaris oryzae[J]. FEMS Microbiology Letters,2008,281(2):221-227.

    [6]Cho Y,Srivastava A,Ohm R A,et al. Transcription factor [WTBX][STBX]Amr1[WTBZ][STBZ] induces melanin biosynthesis and suppresses virulence in Alternaria brassicicola[J]. PLoS Pathogens,2012,8(10): e1002974.

    [7]曹志艷,于 清,范永山,等. 玉米大斑病菌黑色素缺失突變體的獲得及其生物學特性[J]. 植物保護學報,2007,34(3):268-272.

    [8]張 鑫,曹志艷,劉士偉,等. 玉米大斑病菌聚酮體合成酶基因StPKS功能分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(8):1603-1609.

    [9][JP2]Xue C S,Wu D L,Condon B J,et al. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-[JP3]mediated transformation[J]. Phytopathology,2013,103(6): 641-647.

    [10] Saitoh Y,Izumitsu K,Morita A,et al. Cloning of [WTBX][STBX]Sal1[WTBZ][STBZ],a scytalone dehydratase gene involved in melanin biosynthesis in Cochliobolus heterostrophus[J]. Mycoscience,2012,53(4):330-334.

    [11]Pukkila-Worley R,Gerrald Q D,Kraus P R,et al. Transcriptional network of multiple capsule and melanin genes governed by the Cryptococcus neoformans cyclic AMP cascade[J]. Eukaryotic Cell,2005,4(1):190-201.

    [12]郭欣欣,賈 慧,曹志艷,等. 特異性抑制劑三環(huán)唑對玉米大斑病菌致病力的影響[J]. 植物保護學報,2012,39(4):364-368.

    [13]許 楊,涂 追. 絲狀真菌基因敲除技術研究進展[J]. 食品與生物技術學報,2007,26(1):120-126.

    [14]Weld R J,Plummer K M,Carpenter M A,et al. Approaches to functional genomics in filamentous fungi[J]. Cell Research,2006,16(1):31-44.

    [15]Capecchi M R. Altering the genome by homologous recombination[J]. Science,1989,244:1288-1292.

    猜你喜歡
    黑色素突變體病菌
    啊,頭發(fā)變白了!
    Q7.為什么人老了頭發(fā)會變白?
    為什么人有不同的膚色?
    小病菌影響鴉片戰(zhàn)爭
    CLIC1及其點突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應機制探究
    頭狀莖點霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定(內(nèi)文第98~101頁)圖版
    油茶炭疽病菌拮抗木霉菌的分離與篩選
    產(chǎn)胞外黑色素菌株的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化
    病菌來了 快穿好防菌衣
    亚洲黑人精品在线| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲黑人精品在线| 在线免费观看的www视频| 免费在线观看影片大全网站| 欧美乱色亚洲激情| 久久久久久久久免费视频了| 久久久久九九精品影院| 欧美午夜高清在线| 男人舔奶头视频| 激情在线观看视频在线高清| 脱女人内裤的视频| 欧美黄色淫秽网站| а√天堂www在线а√下载| av天堂在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 精品久久久久久成人av| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费搜索国产男女视频| 久久久久久国产a免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| www日本在线高清视频| 免费看日本二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久精品国产综合久久久| 首页视频小说图片口味搜索| 51午夜福利影视在线观看| 日韩欧美三级三区| 久久人人精品亚洲av| 国产午夜精品论理片| 国产高清videossex| 一级作爱视频免费观看| 一夜夜www| 亚洲精品色激情综合| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲人成电影免费在线| 欧美zozozo另类| 舔av片在线| 五月玫瑰六月丁香| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| av福利片在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 精品第一国产精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 天堂√8在线中文| 欧美在线黄色| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美日韩精品网址| 免费一级毛片在线播放高清视频| 91大片在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 久9热在线精品视频| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲国产欧美人成| 一进一出好大好爽视频| 嫩草影视91久久| 黄色成人免费大全| 亚洲一区二区三区不卡视频| 成人一区二区视频在线观看| 日本在线视频免费播放| 午夜福利成人在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 久久久久九九精品影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 中文字幕熟女人妻在线| 日韩三级视频一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产免费av片在线观看野外av| 婷婷六月久久综合丁香| 久久精品人妻少妇| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产熟女xx| 日日夜夜操网爽| 91大片在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美日韩一级在线毛片| 又大又爽又粗| 欧美成人性av电影在线观看| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久国产a免费观看| 黄色视频不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产男靠女视频免费网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 无限看片的www在线观看| 亚洲国产欧美网| www.www免费av| 国产成人精品无人区| 成人午夜高清在线视频| or卡值多少钱| 国产一区二区在线av高清观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲自拍偷在线| 成人国产一区最新在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91九色精品人成在线观看| 一级毛片高清免费大全| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 成人18禁在线播放| 欧美中文综合在线视频| 亚洲成a人片在线一区二区| bbb黄色大片| 国产真实乱freesex| 91国产中文字幕| 久久精品成人免费网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人精品久久二区二区91| а√天堂www在线а√下载| 亚洲七黄色美女视频| 十八禁网站免费在线| 丰满的人妻完整版| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产男靠女视频免费网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av美国av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品 国内视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美又色又爽又黄视频| 少妇粗大呻吟视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线观看免费视频日本深夜| 中文字幕av在线有码专区| 成人一区二区视频在线观看| 午夜久久久久精精品| 免费在线观看亚洲国产| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美黄色淫秽网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美中文日本在线观看视频| 久久草成人影院| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品一区二区免费欧美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久精品国产综合久久久| 成人精品一区二区免费| 一区二区三区国产精品乱码| 国产1区2区3区精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 麻豆av在线久日| 天堂√8在线中文| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲九九香蕉| 中亚洲国语对白在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美乱妇无乱码| 日本一区二区免费在线视频| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久久久久久中文| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 小说图片视频综合网站| 久久精品91蜜桃| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线视频色国产色| 国产精品,欧美在线| 91成年电影在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美性长视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲美女黄片视频| 欧美黑人精品巨大| 变态另类丝袜制服| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 舔av片在线| 免费无遮挡裸体视频| 在线观看66精品国产| 日本成人三级电影网站| 亚洲 国产 在线| 美女免费视频网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品一及| 亚洲av成人av| 一个人免费在线观看的高清视频| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲精华国产精华精| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产区一区二久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久久精品大字幕| 成人精品一区二区免费| 日韩欧美在线乱码| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 少妇粗大呻吟视频| 午夜影院日韩av| avwww免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av有码第一页| 亚洲av第一区精品v没综合| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美日韩精品网址| 国产亚洲av高清不卡| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久久av美女十八| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 欧美zozozo另类| 两性夫妻黄色片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 毛片女人毛片| 夜夜夜夜夜久久久久| 美女扒开内裤让男人捅视频| 男女那种视频在线观看| 精品高清国产在线一区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品98久久久久久宅男小说| 12—13女人毛片做爰片一| 国产不卡一卡二| 国产三级黄色录像| 亚洲一码二码三码区别大吗| 制服诱惑二区| aaaaa片日本免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 搞女人的毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 美女大奶头视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 九九热线精品视视频播放| 国产精品久久视频播放| 三级毛片av免费| 在线播放国产精品三级| 国产1区2区3区精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄频高清免费视频| 亚洲五月天丁香| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 91九色精品人成在线观看| 妹子高潮喷水视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 怎么达到女性高潮| 日本成人三级电影网站| 搡老岳熟女国产| 男女床上黄色一级片免费看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品久久蜜臀av无| 在线观看舔阴道视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩有码中文字幕| 欧美大码av| 特级一级黄色大片| 18禁观看日本| 一进一出好大好爽视频| 香蕉丝袜av| 午夜精品在线福利| 狂野欧美激情性xxxx| 99热这里只有是精品50| 超碰成人久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久这里只有精品中国| 舔av片在线| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩欧美 国产精品| 亚洲美女视频黄频| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两个人免费观看高清视频| 成人手机av| 亚洲avbb在线观看| 特级一级黄色大片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色女人牲交| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲人与动物交配视频| 久久热在线av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜福利18| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 观看免费一级毛片| 国产精品免费视频内射| 国产一区在线观看成人免费| av有码第一页| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产高清videossex| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日日夜夜操网爽| 成年版毛片免费区| 美女午夜性视频免费| 69av精品久久久久久| 人妻久久中文字幕网| 特级一级黄色大片| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品av久久久久免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 观看免费一级毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av欧美777| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av电影不卡..在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 色在线成人网| 日本a在线网址| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品九九99| 成人av在线播放网站| 丁香六月欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲成av人片免费观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲电影在线观看av| 国产私拍福利视频在线观看| 日本一二三区视频观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级黄色大片毛片| 久久这里只有精品中国| 一边摸一边抽搐一进一小说| 制服人妻中文乱码| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲黑人精品在线| 黄色丝袜av网址大全| 小说图片视频综合网站| 宅男免费午夜| 高清毛片免费观看视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 999精品在线视频| 天堂√8在线中文| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利在线在线| 露出奶头的视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 窝窝影院91人妻| 日韩欧美 国产精品| 免费高清视频大片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 脱女人内裤的视频| 全区人妻精品视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品久久久久久成人av| 久久香蕉精品热| 长腿黑丝高跟| 午夜激情福利司机影院| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久人人精品亚洲av| 成在线人永久免费视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产免费男女视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 精品久久久久久久久久久久久| www日本在线高清视频| 国产野战对白在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 国产探花在线观看一区二区| 国产精品久久久久久久电影 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费无遮挡裸体视频| 久久中文看片网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成人久久爱视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av熟女| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久精品成人免费网站| 日本三级黄在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜免费观看网址| 日韩有码中文字幕| 久久 成人 亚洲| 亚洲真实伦在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 哪里可以看免费的av片| 三级毛片av免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费高清视频大片| 精品欧美一区二区三区在线| 久久国产精品影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色av中文字幕| 我的老师免费观看完整版| 俄罗斯特黄特色一大片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一区二区三区高清视频在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av熟女| 可以在线观看毛片的网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 俺也久久电影网| 男男h啪啪无遮挡| 国产高清激情床上av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av有码第一页| aaaaa片日本免费| 精品福利观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 桃色一区二区三区在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 日本三级黄在线观看| 亚洲 国产 在线| 日韩大码丰满熟妇| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费在线观看完整版高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 级片在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一边摸一边抽搐一进一小说| 人人妻人人看人人澡| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美激情久久久久久爽电影| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线播放国产精品三级| 神马国产精品三级电影在线观看 | 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美三级三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 69av精品久久久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 一进一出好大好爽视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产高清视频在线播放一区| 成人午夜高清在线视频| 国产精品野战在线观看| 99久久精品热视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 悠悠久久av| 久久精品91无色码中文字幕| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲成人国产一区在线观看| aaaaa片日本免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 51午夜福利影视在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品1区2区在线观看.| 天天添夜夜摸| 国内精品久久久久精免费| 久久99热这里只有精品18| 性欧美人与动物交配| 国产三级中文精品| 在线观看午夜福利视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99在线人妻在线中文字幕| 日本在线视频免费播放| 无遮挡黄片免费观看| 久99久视频精品免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 国产私拍福利视频在线观看| www国产在线视频色| 欧美+亚洲+日韩+国产| 91国产中文字幕| 岛国在线观看网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 窝窝影院91人妻| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲免费av在线视频| 日韩欧美 国产精品| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲一区中文字幕在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成+人综合+亚洲专区| 成在线人永久免费视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91麻豆av在线| 午夜免费成人在线视频| 麻豆国产av国片精品| 日本黄色视频三级网站网址| av超薄肉色丝袜交足视频| 日本熟妇午夜| 亚洲九九香蕉| netflix在线观看网站| 国产黄a三级三级三级人| 日韩欧美国产在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产区一区二久久| 又粗又爽又猛毛片免费看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产黄色小视频在线观看| 久久久久久久久中文| 变态另类丝袜制服| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜免费观看网址| www.熟女人妻精品国产| avwww免费| 午夜福利成人在线免费观看| 国产男靠女视频免费网站| 国产日本99.免费观看| 97碰自拍视频| 女警被强在线播放| 国产爱豆传媒在线观看 | 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美性长视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日本一本二区三区精品| 久9热在线精品视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产av不卡久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线观看一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 免费看a级黄色片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 一本一本综合久久| 日本黄大片高清| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 黄片大片在线免费观看| 熟女电影av网| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 91国产中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 丝袜人妻中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲五月天丁香| 757午夜福利合集在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本免费a在线| 超碰成人久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久久久人人人人人| 真人一进一出gif抽搐免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩免费av在线播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜福利在线在线| 欧美黄色淫秽网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| www日本黄色视频网| √禁漫天堂资源中文www| 丰满的人妻完整版| 亚洲天堂国产精品一区在线| 深夜精品福利| 国产精品野战在线观看| 天天添夜夜摸| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美免费精品| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人影院久久av| 12—13女人毛片做爰片一|