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    酵母穿梭質(zhì)粒pXZ200的構(gòu)建

    2015-09-10 21:06:00王珊珊徐海洋王世明
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期

    王珊珊+徐海洋+王世明

    摘要: 利用釀酒酵母高效的同源重組能力,通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù),將復(fù)制子pBBR1片段、KanR(卡納霉素抗性)片段、酵母復(fù)制子2 μ片段這3個(gè)兩端含有30 bp同源臂的片段電轉(zhuǎn)入釀酒酵母,通過(guò)同源重組獲得宿主更具廣譜性的革蘭氏陰性細(xì)菌-啤酒酵母穿梭質(zhì)粒pXZ200。經(jīng)檢測(cè),pXZ200能夠在惡臭假單胞桿菌KT2440和大腸桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。

    關(guān)鍵詞: 釀酒酵母;同源重組;穿梭質(zhì)粒;PCR技術(shù);pXZ200

    中圖分類(lèi)號(hào): Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0031-03

    分子生物學(xué)中,利用DNA重組技術(shù)使宿主細(xì)胞獲得某種特殊能力是非常重要而且被廣泛利用的方法。然而,這種方法在體外需要經(jīng)多步的酶切和酶連,很大程度上依賴(lài)于載體上限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),步驟繁瑣,所連接片段一般限于幾個(gè)kbp大小,很少超過(guò)10 kbp,但同源重組的新方法克服了這種限制。

    釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)有著較其他生物更高效的同源重組修復(fù)雙鏈DNA斷裂機(jī)制,是研究同源重組機(jī)制和應(yīng)用同源重組技術(shù)的主要模式生物 [1-2]。在釀酒酵母系統(tǒng)中,15 bp的同源序列就可以介導(dǎo)同源重組的發(fā)生,獲得重組克隆 [3];當(dāng)兩端的同源序列為30 bp時(shí),有效同源重組的頻率可接近80% [4-5]。PCR介導(dǎo)重組技術(shù)是指通過(guò)人工合成寡核苷酸單鏈作為PCR引物,用PCR擴(kuò)增方法得到重組片段的兩端帶有重組所需同源臂外源的DNA片段 [6-7],是目前應(yīng)用最為廣泛的一種重組技術(shù) [4,8-10],這種方法與傳統(tǒng)酶切酶連的基因克隆方法相比,具有很多優(yōu)點(diǎn):省去了多步的酶切酶連,操作更為簡(jiǎn)單快捷;不依賴(lài)于限制性酶切位點(diǎn)的存在,不會(huì)引入多余的堿基;通過(guò)合成特定的同源序列,目的基因可以精確地定位在靶位點(diǎn)上;解決了大片段的基因克隆問(wèn)題 [11-12]。體外將合成的DNA片段利用釀酒酵母的重組機(jī)制,在體內(nèi)完成多個(gè)DNA片段的一步整合已被廣泛運(yùn)用。1970—2008年,DNA合成片段已經(jīng)從75 bp增加到583 kbp [13]。1970年,Khorana等成功合成丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的完整基因,這是第一次實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成可遺傳序列 [14];2008年,Venter研究組合成了由101個(gè)DNA片段構(gòu)建、長(zhǎng)度為583 kbp的DNA [15],該DNA通過(guò)體外合成25個(gè)具有同源臂的DNA片段,然后利用酵母重組機(jī)制合成基因組 [16];2009年,Shao等在酵母中一步裝配完成含有8個(gè)基因的生化途徑,含有這個(gè)生化途徑的重組菌能夠利用木糖產(chǎn)生玉米黃質(zhì) [17]。

    帶有完整2μ質(zhì)粒序列的質(zhì)粒pXZ198是一個(gè)既能在酵母中復(fù)制表達(dá)、又能在大腸桿菌中復(fù)制表達(dá)的穿梭質(zhì)粒,在研究中被廣泛應(yīng)用。但是,pXZ198質(zhì)粒只含有大腸桿菌的復(fù)制子Coli E1,而不能在其他原核細(xì)胞中復(fù)制表達(dá),而 pBBR1MCS5 卻是能夠在多種革蘭氏陰性菌中穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)的質(zhì)粒 [18]。本試驗(yàn)利用釀酒酵母的體內(nèi)高效重組系統(tǒng),將廣譜復(fù)制子pBBR1、卡那霉素抗性基因KanR、酵母復(fù)制子2μ序列重組成一新的質(zhì)粒pXZ200,經(jīng)驗(yàn)證,該質(zhì)??梢栽诖竽c桿菌及惡臭假單胞桿菌KT2440中穩(wěn)定復(fù)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、搖床、低溫離心機(jī)、冰箱、制冰機(jī)、無(wú)菌操作臺(tái)、滅菌鍋、電轉(zhuǎn)杯、電轉(zhuǎn)儀、多功能酶標(biāo)儀等。

    1.1.2 主要試劑 DraⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、DNA回收試劑盒、1 mol/L 山梨醇、氨芐抗生素、慶大霉素、卡那霉素、博來(lái)霉素等。

    1.1.3 主要菌種和質(zhì)粒 釀酒酵母S288C、大腸桿菌DH5α、惡臭假單胞桿菌KT2440、含有完整2 μ序列及博來(lái)霉素抗性基因片段pXZ 的pXZ198質(zhì)粒、含有KanR片段的pET29a質(zhì)粒、含有在多種原核細(xì)胞中能復(fù)制的廣譜復(fù)制子pBBR1的pBBR1MCS5質(zhì)粒。

    1.1.4 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基:2%蛋白胨、1%酵母粉、2%葡萄糖,pH值為7.0,115 ℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基:1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化鈉,pH值為7.0,121 ℃滅菌 15 min。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%瓊脂。

    1.2 方法

    1.2.1 打靶片段的準(zhǔn)備 在-80 ℃接種pXZ198 DH5α至含有100 μg/mL氨芐抗生素、接種pET29a DH5α至含有 50 μg/mL Kan、接種pBBR1MCS5 DH5α至含有30 μg/mL慶大霉素的LB試管中,37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng);分別取約 3 mL 菌液,提取質(zhì)粒 [19]pXZ198、pET29a、pBBR1MCS5,用PCR擴(kuò)增方法獲得兩端含有30 bp同源臂的打靶片段,打靶片段PCR對(duì)應(yīng)的引物和模板見(jiàn)表1;每個(gè)片段擴(kuò)增約 120 μL,按照康寧生命科學(xué)的試劑盒回收各個(gè)片段;回收的各個(gè)片段進(jìn)行0.75%瓊脂糖電泳并測(cè)各片段的濃度。

    1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)[17]的方法制作酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)、KT2440電轉(zhuǎn)感受態(tài)以及采用大腸桿菌DH5α一步法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 [20]。

    1.2.3 電轉(zhuǎn)重組及初步篩選 取50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞置于預(yù)冷的0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中,加入打靶片段pXZ、pBBR1、KanR各5 μL,混勻;擦干電轉(zhuǎn)杯上的水,放入電轉(zhuǎn)化儀的樣品槽中,以1.5 kV進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;電轉(zhuǎn)結(jié)束,迅速將1 mL已滅菌的YPD培養(yǎng)基加入到電轉(zhuǎn)杯中;在無(wú)菌操作臺(tái)上,將電轉(zhuǎn)杯中液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL已滅菌的離心管中,30 ℃ 120 r/min復(fù)蘇1 h;取100 μL涂布于含有200 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板上,共涂10個(gè)平板;平板放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36 h。

    1.2.4 酵母重組子的驗(yàn)證及pXZ200在酵母中的穩(wěn)定性 將平板上長(zhǎng)出的單菌落隨機(jī)挑選出3個(gè),并編號(hào)為1、2、3,接種至含200 μg/mL博來(lái)霉素的YPD試管中,30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h,以Kan-R、pBBR1-F為引物對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)PCR鑒定正確的重組子轉(zhuǎn)接至含有200 μg/mL博來(lái)霉素的50 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h以提取質(zhì)粒。由于酵母菌是真核生物,細(xì)胞的破碎難于大腸桿菌。試驗(yàn)采用液氮研磨的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎,用酚氯仿反復(fù)抽提進(jìn)行質(zhì)粒的提取。質(zhì)粒以pXZR-F、pXZR-R為引物,送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序序列與pBBR1、KanR片段的序列進(jìn)行比對(duì);測(cè)序正確的重組子轉(zhuǎn)接至YPD試管中,30 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng),反復(fù)轉(zhuǎn)接1周并提質(zhì)粒;對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行DraⅠ酶切,酶切體系為10 μL:pXZ200 3 μL、DraⅠ和10×M Bf各1 μL、無(wú)菌ddH2O 5 μL;0.75%瓊脂糖電泳檢測(cè)質(zhì)粒的正確性。

    1.2.5 構(gòu)建質(zhì)粒在宿主細(xì)菌中的復(fù)制 將2 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 [21]50 μL DH5α一步法感受態(tài)細(xì)胞中;轉(zhuǎn)化后加入600 μL的LB復(fù)蘇1 h;取100 μL涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng);挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落,接種到含有50 μg/mL卡那霉素的LB試管中,37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒;質(zhì)粒正確的菌轉(zhuǎn)接至LB試管中,37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng),反復(fù)轉(zhuǎn)接1周并提取質(zhì)粒,對(duì)所提的質(zhì)粒進(jìn)行DraⅠ酶切;0.75%瓊脂糖電泳檢測(cè)質(zhì)粒的正確性。以同樣方法在假單胞桿菌KT2440中檢測(cè)pXZ200的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pXZ200質(zhì)粒的構(gòu)建

    質(zhì)粒構(gòu)建的基本流程見(jiàn)圖1。

    2.2 打靶片段的制備

    由圖2可見(jiàn),以PCR方式獲得兩端含有30 bp同源臂的打靶片段是正確的。經(jīng)測(cè)量,該片段濃度為100 ng/μL,適合作為打靶片段做電轉(zhuǎn)化。

    2.3 對(duì)重組子的驗(yàn)證及 在酵母中的穩(wěn)定性。

    結(jié)果表明,10個(gè)含200 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板上都長(zhǎng)出單菌落,每個(gè)平板平均長(zhǎng)出20個(gè)單菌落;對(duì)菌落進(jìn)行驗(yàn)證統(tǒng)計(jì),重組效率約為70%;對(duì)其中3個(gè)重組子進(jìn)行PCR驗(yàn)證,由圖3可見(jiàn),KanR和pBBR1 2個(gè)片段的長(zhǎng)度大小約為2.5 kbp,1號(hào)和2號(hào)單菌落是正確的。將2號(hào)菌提出的質(zhì)粒以pXZR-F、pXZR-R為引物測(cè)序,經(jīng)與pBBR1及KanR片段的序列進(jìn)行比對(duì),符合度達(dá)99%,證明該質(zhì)粒構(gòu)建正確。

    2.4 構(gòu)建質(zhì)粒 在假單胞桿菌和大腸桿菌中的表達(dá)及穩(wěn)定性

    從酵母菌提取的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入大腸桿菌和假單胞桿菌KT2440中,提質(zhì)粒(3 mL菌液)驗(yàn)證都正確(圖4)。將含有質(zhì)粒的大腸桿菌、假單胞桿菌KT2440及驗(yàn)證正確的酵母重組子分別連續(xù)轉(zhuǎn)接1周,所提取的質(zhì)粒經(jīng)DraⅠ酶切。由圖5可見(jiàn),從大腸桿菌及假單胞桿菌KT2440中提取的質(zhì)粒和從酵母中提取的質(zhì)粒相比,大小一致且轉(zhuǎn)接1周后質(zhì)粒的量沒(méi)有變化,酶切后質(zhì)粒大小為5.3 kbp。說(shuō)明 能夠在酵母菌、大腸桿菌DH5α和假單胞桿菌KT2440中穩(wěn)定復(fù)制。

    3 結(jié)論

    傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建需要找到一個(gè)合適的載體,將目的片段和載體片段在相同的酶切后進(jìn)行酶連,再轉(zhuǎn)入到宿主菌中鑒定,如果構(gòu)建的質(zhì)粒需要插入多個(gè)片段,則工作量很大。本試驗(yàn)采用的方法比較簡(jiǎn)單,只需要在PCR獲取目的片段時(shí)加入同源臂,然后將所有目的片段混勻,電轉(zhuǎn)到酵母感受態(tài)細(xì)胞中再進(jìn)行篩選驗(yàn)證。與傳統(tǒng)方法相比,這種方法對(duì)多片段質(zhì)粒的構(gòu)建簡(jiǎn)單且易于操作。試驗(yàn)所構(gòu)建的新質(zhì)粒 能夠在酵母菌及大腸桿菌、假單胞桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Szostak J W,Orr-Weaver T L,Rothstein R J,et al. The double-strand-break repair model for recombination[J]. Cell,1983,33 (1):25-35.[HJ1.7mm]

    [2][JP2]Bhatia P K,Wang Z G,F(xiàn)riedberg E C. DNA repair and transcription[J]. Current Opinion Genetics Development,1996,6(2):146-150.

    [3]Judd S R,Petes T D. Physical lengths of meiotic and mitotic gene conversion tracts in Saccharomyces cerevisiae[J]. Genetics,1988,118(3):401-410.

    [4]Nickoloff J A,Hoekstra M F. Double-strand break and recombinational repair in Saccharomyces cerevisiae[M]//Nickoloff J A,Hoekstra M F. DNA damage and repair,vol. 1:DNA repair in prokaryotes and lower eukaryotes. Totowa,NJ:Humana Press Inc,1998:335-362.

    [5]Willis K K,Klein H L. Intrachromosomal recombination in Saccharomyces cerevisiae:reciprocal exchange in an inverted repeat and associated gene conversion[J]. Genetics,1987,117(4):633-643.

    [6][JP3]Kramer K M,Brock J A,Bloom K,et al. Two different types of double- strand breaks in Saccharomyces cerevisiae are repaired by similar RAD52-independent,nonhomologous recombination events[J]. Molecular and Cellular Biology,1994,14(2):1293-1301.

    [7]Orr-Weaver T L,Szostak J W. Yeast recombination:the association between double-strand gap repair and crossing-over[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1983,80(14):4417-4421.

    [8][JP2]Schwacha A,Kleckner N. Identification of double Holliday junctions as [JP3]intermediates in meiotic recombination[J]. Cell,1995,83(5):783-791.

    [9]Nasmyth K A.Molecular genetics of yeast mating type[J]. Annual Review Genetics 1982,16:439-500.

    [10] Thaler D S,Stahl F W. DNA double-chain breaks in recombination of phage lambda and of yeast[J]. Annual Review of Genetics,1988,22:169-197.

    [11]Nassif N,Penney J,Pal S,et al. Efficient copying of nonhomologous sequences from ectopic sites via P-element-induced gap repair[J]. Molecular and Cellular Biology,1994,14(3):1613-1625.

    [12]Mcgill C,Shafer B,Strathern J. Coconversion of flanking sequences with homothallic switching[J]. Cell,1989,57(3):459-467.

    [13]Mueller S,Coleman J R,Wimmer E. Putting synthesis into biology:a viral view of genetic engineering through de novo gene and genome synthesis[J]. Chemistry & Biology,2009,16(3):337-347.

    [14] Gibson D G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides[J]. Nucleic Acids Research,2009,37(20):6984-6990.

    [15]Gibson D G,Benders G A,Andrews-Pfannkoch C,et al. Complete chemical synthesis,assembly,and cloning of a mycoplasma genitalium genome[J]. Science,2008,319(5867):1215-1220.

    [16]Gibson D G,Benders G A,Axelrod K C,et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic mycoplasma genitalium genome[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,l05(51):20404-20409.

    [17]Shao Z Y,Zhao H,Zhao H M. DNA assembler,an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways[J]. Nucleic Acids Research,2009,37(2):e16.

    [18]Kovach M E,Elzer P H,Steven Hill D,et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes[J]. Gene,1995,166 (1):175-176.

    [19]任大勇,李 昌,秦艷青,等. 小提質(zhì)粒快速排除假陽(yáng)性克隆的新方法[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(2):185-188.

    [20]涂知明,陳明潔,何光源,等. 三種大腸桿菌高效感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化[J].

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