采用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚

馬樂，韓軍岐，白歡歡，張有林

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安，710119)

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采用大孔樹脂分離純化核桃青皮中多酚

馬樂，韓軍岐*，白歡歡，張有林

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安，710119)

摘要通過吸附、解吸試驗(yàn)，篩選適合分離純化核桃青皮多酚的大孔樹脂，并對分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化。以沒食子酸、原兒茶素等9種標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用HPLC對所得核桃青皮多酚物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明：NKA-9樹脂是分離純化核桃青皮多酚的最佳樹脂，吸附條件為上樣液多酚濃度0.574 mg/mL，pH 1.0，上樣速率1.3 mL/min，吸附率可達(dá)90.1%；洗脫條件為體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗脫劑，pH 3.0，洗脫速率0.43 mL/min，解吸率達(dá)87.9%。經(jīng) HPLC鑒定和分析，核桃青皮酚類物質(zhì)主要由原兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁等單體組成，其中含量較高的為表兒茶素、原兒茶素和蘆丁。

關(guān)鍵詞核桃青皮；多酚；大孔樹脂；分離純化

核桃(JuglansregiaL.)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的核桃屬植物，我國核桃資源豐富，截至2010年，核桃栽培面積達(dá)到400萬hm2，產(chǎn)量可達(dá)128萬t[1]。核桃青皮(walnut green husk)又名青龍衣，是核桃外部一層厚厚的綠色果皮，其味辛、苦，性平、澀，早在1 200多年前，唐朝《食療本草》中記載核桃青皮有藥用價(jià)值[2]。植物多酚類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗癌、抑菌等多種活性[3]。目前研究表明，核桃青皮中含有沒食子酸、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、槲皮素等多種多酚類物質(zhì)[4]，因此具有較強(qiáng)的抗氧化作用。大孔吸附樹脂具有吸附量大，操作簡單，安全，能耗較低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)且樹脂可再生節(jié)約成本等特點(diǎn)[5]。蘇曉東等[6]通過優(yōu)化大孔樹脂吸附解吸條件，獲得純化荔枝果肉多酚的最佳工藝; WU等[7]通過試驗(yàn)篩選出D101樹脂對枸杞類黃酮具有很好的分離純化效果等。但很少見此方法應(yīng)用于分離純化核桃青皮多酚的相關(guān)報(bào)道。本研究通過采用不同性能大孔樹脂(見表1)進(jìn)行吸附、解吸試驗(yàn)，篩選適宜樹脂種類，對核桃青皮多酚分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳純化效果。

1材料與方法

1.1材料與試劑

青皮核桃：于8月中旬采摘于陜西省藍(lán)田縣，將青皮核桃取青皮，切碎，經(jīng)冷凍干燥后研磨粉碎，過60目篩，密封盛裝于棕色玻璃瓶內(nèi)，冷藏備用。

表1　4種大孔樹脂的基本性能

大孔吸附樹脂：AB-8、S-8、NKA-9、D-101，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。

單酚標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、原兒茶素、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、槲皮素，均為美國Sigma 公司所產(chǎn)。

Na2WO4、Li2SO4、Na2MO4、濃H3PO4、濃HCl、NaOH、無水乙醇、無水Na2CO3固體(分析純)，天津富宇化工有限公司;溴水(分析純)，成都市科龍?jiān)噭S；乙腈，色譜純，美國Fisher公司；甲酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE型)，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52型)，上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S型)，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)(UV-1100型)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；恒溫振蕩器(SHZ-82型)，金壇市富華儀器有限公司；恒流泵(HL-2S型)，上海滬西分析儀器廠有限公司；精密pH計(jì)(PHS-3C型)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平(JA1203型)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)(LGJ-18C型)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；高相液相色譜儀(Breeze1525型)，美國Waters公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品溶液的制備

稱量一定量的核桃青皮干粉，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，在溫度35 ℃，料液比 1∶17(g∶mL)條件下超聲提取30 min，提取2次。提取液真空抽濾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得核桃青皮多酚粗提液，稀釋至相應(yīng)濃度, 4 ℃冷藏備用。

1.3.2多酚含量的測定

核桃青皮中多酚總含量測定采用Folin-Ciocaileu[8-9]法，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取沒食子酸0.250 0 g，定容至50 mL，分別移取0，0.5，1.0，1.5，2.5，5.0 mL沒食子酸溶液到50 mL容量瓶中，用去離子水定容。從上面不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取0.2 mL，加入到10 mL容量瓶中，加入0.5 mL FC試劑，混合均勻，在1 min內(nèi)加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，混合，用去離子水定容，將上述溶液在40 ℃下暗放置2 h后，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液做為空白對照，在760 nm波長下測定吸光度值。

1.3.3大孔樹脂的預(yù)處理

大孔樹脂用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH 溶液浸泡處理4 h，蒸餾水不斷沖洗至中性；然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% HCl 溶液浸泡4 h，蒸餾水洗樹脂至中性；最后再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡處理4 h，蒸餾水洗至無醇味為止，備用。

1.3.4大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

(1) 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn): 稱取1.0 g 各濕樹脂于50 mL三角瓶中，加入樣品液30 mL，密封置于175 r/min搖床上，25 ℃下振蕩12 h，從上清液中取樣，測定多酚含量。據(jù)以下公式計(jì)算吸附量和吸附率[8,10]。

qe=(c0-c1)×V1/m

(1)

E/% =[(c0-c1)/ C0]×100

(2)

式中：qe，吸附量,mg/g；E，吸附率, %； c0，起始濃度,mg/mL；c1，平衡濃度,mg/mL；V1，吸附溶液體積,mL；m，樹脂的質(zhì)量,g。

(2) 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn): 將已充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗，直至表面無樣品液殘留，再用濾紙吸干水分，置于三角瓶中，加入30mL不同濃度乙醇溶液，密封放置于175r/min振蕩器中，25 ℃下解吸12h，從上清液中取樣，測多酚含量。據(jù)以下公式計(jì)算解吸率和解吸量[8,11-13]：

D/% = (c2×V2×100)/[(c0-c1)×V1]

(3)

qd=c2×V2/m

(4)

式中：D，解吸率, %；qd，解吸量, mg/g；c0，起始濃度, mg/mL；c1，平衡濃度, mg/mL；c2，解吸液中多酚濃度, mg/mL；V1，吸附溶液體積,mL；V2，解吸溶液體積，mL；m，樹脂取量, g。

1.3.5大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸

將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入(16 mm×500 mm)層析柱中，用蒸餾水平衡后，將樣品液以一定的速率上樣并收集流出液，每10 mL為一管，檢測并計(jì)算流出液濃度，確定流速、體積等條件，得到最佳吸附條件，繪制動態(tài)吸附曲線。

將已吸附飽和的樹脂進(jìn)行解吸實(shí)驗(yàn)，用蒸餾水洗至無樣品液殘留，以一定的流速用適當(dāng)濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，計(jì)算流出液濃度，確定洗脫流速、體積等條件，得到最佳洗脫條件，繪制動態(tài)洗脫曲線。

1.4核桃青皮單體酚組成及含量 HPLC 分析

通過大孔樹脂分離純化后的核桃青皮多酚提取物采用HPLC法測定其單體酚的組成及含量。具體方法為：Diamonsil C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測波長 280 nm；流速1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL；流動相A(0.1%甲酸高純水)和流動相B(0.1%甲酸乙腈)；梯度洗脫程序：93%A，7%B，0 min；82%A，18%B，30 min；78%A，22%B，40 min；50%A，50% B，45 min；50%A，50% B，50 min。樣品峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行對比，判斷單體酚種類，按照峰面積計(jì)算單體酚含量，結(jié)果以(μg/g)核桃青皮干粉計(jì)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用Excel和DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X,mg/L)，吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.002 8X-0.000 9，R2=0.999 5，說明該曲線在0～350 mg/L有良好的線性關(guān)系。

2.2樹脂篩選結(jié)果

由于樹脂的結(jié)構(gòu)、孔結(jié)構(gòu)、表面化學(xué)性質(zhì)及被吸附分子的大小、極性等不同是影響樹脂吸附性能的主要因素。

由圖1可知，NKA-9對核桃青皮多酚的吸附量最高，可達(dá)17.39 mg/g；其次是AB-8吸附量為16.15 mg/g；D101、S-8分別為14.19 mg/g和11.7 mg/g。通過4種大孔樹脂解吸性能試驗(yàn)可知，NKA-9對多酚的解吸性能最好，解吸率達(dá)84.56%；其次AB-8為80.5%；S-8的解吸率最差僅有44.96%。這一現(xiàn)象說明，大孔樹脂對核桃青皮多酚類物質(zhì)的吸附和解吸存在一定的選擇性。而NKA-9的吸附量明顯高于其他幾種樹脂，可能是由于樹脂與核桃青皮多酚分子大小相近、極性相似。因此，選NKA-9大孔樹脂作為純化的最佳樹脂。

圖1　4種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能的比較分析Fig.1　The static adsorption and desorption analysis of 4 macroporous resins

2.3靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

2.3.1樹脂對粗提液多酚的吸附性能

在NKA-9大孔樹脂中加入多酚粗提液進(jìn)行靜態(tài)吸附，不同時(shí)間測定多酚濃度，計(jì)算多酚吸附量。再將吸附飽和的樹脂進(jìn)行一段時(shí)間的靜態(tài)解吸，計(jì)算多酚解吸量，以橫坐標(biāo)為時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為吸附量(mg/g)，繪制靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線。

從圖2可知，靜態(tài)吸附起始階段NKA-9樹脂對多酚的吸附量上升速度快，隨著時(shí)間的增加，吸附量逐漸達(dá)到飽和。當(dāng)?shù)竭_(dá)4 h時(shí)樹脂基本到達(dá)吸附平衡，如果再延長吸附時(shí)間，吸附量變化不大。通過解吸曲線可知，解吸初期隨著時(shí)間的增加解吸量不斷增大，當(dāng)處在2h時(shí)樹脂解吸量已達(dá)較大，再延長解吸時(shí)間變化不太明顯，由此表明2 h后就可達(dá)到解吸平衡態(tài)。

圖2　NKA-9樹脂靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線Fig.2　The static adsorption and desorption kinetic curve of NKA-9 resin

2.3.2粗提液pH值對樹脂吸附效果的影響

將粗提液pH值分別調(diào)節(jié)為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，樹脂經(jīng)一段時(shí)間靜態(tài)吸附，測多酚含量，計(jì)算吸附率。

吸附要達(dá)到良好效果就必須使吸附過程中吸附質(zhì)保持容易被吸附的狀態(tài)。核桃青皮多酚在酸性條件下能夠保持此狀態(tài)，有利于NKA-9樹脂吸附。如圖3所示，當(dāng)pH 1.0時(shí)，樹脂吸附多酚效果較佳，隨著pH逐漸升高，多酚吸附量逐漸下降，這是由于多酚類化合物具有酚羥基結(jié)構(gòu)，具備一定的酸性，其中—OH基團(tuán)中的氫離子可以解離出來，以離子的形式存在于水中，此時(shí)不易被樹脂吸附[14]。因此選擇pH 1.0作為粗提液多酚吸附的較佳pH值。

圖3　pH對多酚吸附率的影響Fig.3　The effect of pH on adsorption ratio of polyphenols

2.3.3粗提液多酚濃度對樹脂吸附效果的影響

配制多酚質(zhì)量濃度為0.246～0.708 mg/mL粗提液，對樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，測定吸附后多酚含量，計(jì)算吸附率。

圖4　不同濃度多酚靜態(tài)吸附曲線Fig.4　Static adsorption curve of different polyphenols concentration

由圖4可知，多酚濃度較低條件下，隨著溶液濃度提高，多酚的吸附率逐漸增加，當(dāng)多酚濃度達(dá)到0.574 mg/mL左右時(shí)，吸附率上升逐漸變緩，這是因?yàn)槎喾优c雜質(zhì)同時(shí)競爭對樹脂的吸附從而達(dá)到動態(tài)平衡，且高濃度多酚溶液溶解性降低不利于與樹脂的結(jié)合，以及高濃度下分子擴(kuò)散受抑制導(dǎo)致樹脂吸附能力下降，容易使其他恒定條件的控制難度增加以及容易造成上樣困難[15]。所以試驗(yàn)選用上樣濃度為0.574 mg/mL。

2.3.4乙醇濃度對樹脂解吸效果的影響

將不同濃度的乙醇溶液分別加入到吸附飽和的樹脂中，經(jīng)過一段時(shí)間的靜態(tài)解吸測定解吸多酚濃度，計(jì)算解吸率，結(jié)果如圖5所示。

圖5　乙醇濃度對多酚解吸效果的影響Fig.5　Effect of ethanol concentration on desorption rate of polyphenols

核桃青皮多酚一般用于醫(yī)藥及食品領(lǐng)域，所以從安全、簡便角度考慮，試驗(yàn)選用乙醇作為洗脫劑，考察乙醇濃度對樹脂洗脫效果的影響。由圖5可知，隨乙醇濃度增加，多酚解吸率逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%后，再進(jìn)一步增加乙醇濃度，解吸率增加變緩，這是由于洗脫劑的極性在一定程度上可能會影響吸附質(zhì)的解吸作用?？紤]到成本節(jié)約和減少浪費(fèi)，故選體積分?jǐn)?shù)50%乙醇作為最佳濃度的洗脫劑。

2.3.5解吸液pH值對樹脂解吸效果的影響

將解吸液pH值分別調(diào)節(jié)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，對樹脂進(jìn)行靜態(tài)解吸試驗(yàn)，測定多酚含量，計(jì)算解吸率。

圖6　pH對多酚解吸率的影響Fig.6　Effect of pH on desorption rate of polyphenols

由圖6可知，隨著pH值的逐漸升高，多酚的解吸率逐漸增加，pH 3.0時(shí)已達(dá)到最大值，隨著pH值升高至中性時(shí)，解吸率反而不斷下降。這說明在中性條件下，酚類化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化，使其性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致多酚解吸率減低。而在pH 3.0的條件下，由于樹脂和多酚之間作用強(qiáng)度較弱容易被解吸，所以解吸率可達(dá)最大。

2.4動態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

2.4.1上柱流速對樹脂吸附效果的影響

將大孔樹脂濕法裝柱, 粗提液多酚分別以0.43、1.3、2.17 mL/min的流速上樣, 收集流出液，檢測并計(jì)算流出液濃度，繪制動態(tài)吸附曲線。

由于上樣流速主要影響粗提液多酚向樹脂的擴(kuò)散效果，也因此決定最終吸附的效果。為使擴(kuò)散有效進(jìn)行，離子交換過程中大孔樹脂和粗提液多酚就必須要充分接觸。如果流速過快，樹脂和粗提液不能夠充分接觸，致使部分酚類物質(zhì)流出柱子，降低其吸附量；如果流速過慢，雖有利于樹脂對酚類物質(zhì)的吸附，但卻會降低生產(chǎn)效率，影響生產(chǎn)周期。由圖7可知，在0.43 mL/min和1.3 mL/min 2種上樣流速下樹脂吸附量均優(yōu)于流速為2.17 mL/min的情況。在0.43、1.3 mL/min速率下，樹脂吸附能力相差不大(P>0.05)，試驗(yàn)選用1.3 mL/min為較佳的上樣流速。

圖7　流速對樹脂吸附效果的影響Fig.7　Influence of flowing rates on adsorption effect

2.4.2洗脫劑流速對樹脂解吸效果的影響

將吸附飽和的樹脂，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速分別為0.43、1.3、2.17 mL/min，收集洗脫液，測定乙醇溶液對飽和樹脂的動態(tài)洗脫效果，繪制動態(tài)洗脫曲線。

一般來說，洗脫速度對解吸效果有顯著影響。洗脫流速要求慢，但如果流速過慢，則會引起解吸時(shí)間延長，且在流動過程中被洗脫的多酚可能會被重新吸附，兩相間會重新建立動態(tài)平衡，降低解吸量；如果流速過快，則會導(dǎo)致洗脫劑不能和吸附飽和的樹脂充分接觸而快速流出，使得解吸量降低，生產(chǎn)效率下降[16]。由圖8可知，隨著洗脫流速的加快，解吸量不斷降低，當(dāng)洗脫流速在0.43 mL/min時(shí)解吸效果較好，故采用此流速為洗脫流速。

圖8　洗脫劑流速對樹脂解吸效果的影響Fig.8　Influence of eluting rates on desorption effect

2.5核桃青皮多酚單體組成及含量的比較

以9種單體酚為混標(biāo)，通過采用HPLC法對核桃青皮粗多酚及NKA-9純化后的提取物檢測并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。核桃青皮中共檢測到7種單體酚類物質(zhì)，單體酚種類及純化前后的含量如表2所示。NKA-9樹脂能較好的分離純化核桃青皮中的酚類物質(zhì)，由表2可知，經(jīng)純化后其中含量較高的為表兒茶素、原兒茶素和蘆丁，且三者占總酚含量的70.58%。NKA-9純化前后的核桃青皮多酚提取物 HPLC譜見圖9，核桃青皮多酚純化前保留時(shí)間2～5 min和48～50 min之間的雜峰經(jīng)過純化后被降低，且純化前后剩余峰基本被保留，說明此種樹脂適用于初步純化核桃青皮多酚。此次試驗(yàn)檢測出7種單體酚，尚余留一些未知峰尚有待做進(jìn)一步的分離純化，再經(jīng)核磁或高分辨質(zhì)譜等手段鑒定分析。

表2　NKA-9大孔樹脂純化前后核桃青皮單體

注：含量以 μg/ g核桃青皮粉計(jì)，均值±標(biāo)準(zhǔn)差 保留率：核桃青皮單體酚純化后與純化前含量的比值。

a-純化前;b-純化后;c-多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品1-沒食子酸；2-原兒茶素；3-綠原酸；4-香草酸；5-咖啡酸；6-表兒茶素；7-阿魏酸；8-蘆??；9-槲皮素圖9　NKA-9大孔樹脂純化前、后的核桃青皮提取物HPLC圖及多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.9　Effects of NKA-9 resin on HPLC spectrum of walnut green husk extract and theHPLC chromatogram of polyphenols standards

3結(jié)論

試驗(yàn)對4種不同型號的大孔樹脂進(jìn)行篩選，得到NKA-9樹脂具有良好的吸附和解吸性能，通過考察核桃青皮多酚質(zhì)量濃度、pH值、洗脫劑濃度以及上樣液流速等影響因素，初步確定了分離純化條件。 最佳吸附和解吸條件：提取液多酚濃度為0.574 mg/mL，pH 1.0時(shí)，以1.3 mL/min流速上樣，此條件下樹脂對多酚的吸附率最高，可達(dá)90.1%； 體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫劑，pH 3.0時(shí)，流速0.43 mL/min洗脫，解吸效果較好，解吸率達(dá)87.9%。青皮多酚中主要由沒食子酸、原兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、蘆丁和槲皮素等7種酚類物質(zhì)組成，經(jīng)過樹脂純化后含量較高的為表兒茶素、原兒茶素和蘆丁。結(jié)果表明，NKA-9樹脂作為核桃青皮多酚初步純化材料是可行的，且分離純化條件也可為工業(yè)生產(chǎn)提供理論參考。

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Separation and purification of polyphenols from walnut green husk by macroporous resin

MA Le, HAN Jun-qi*, BAI Huan-huan, ZHANG You-lin

(Shaanxi Normal University College of Food Engineering and Nutritional Science,Xi'an 710119, China)

ABSTRACTThe appropriate macroporous for separation and purification of polyphenols in walnut green husk was chosen by the adsorption and desorption experiment. The separation and purification condition was also optimized. Then the polyphenols from walnut green husk were qualitatively and quantitatively analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography) using gallic acid and protocatechuic acid as standards. Results showed that macroporous resin NKA-9 was suitable for purification of walnut green husk polyphenols. The absorption condition was: polyphenols 0.574 mg/mL, pH 1.0, feeding rate 1.3 mL/min. Under the above conditions, the adsorption could reach to 90.1%. The desorption of walnut green husk polyphenols could be obtained when the elution rate was 0.43 mL/min with 50% ethanol, pH 3.0. The desorption ratio was 87.9%. Moreover, the HPLC test showed that polyphenols in walnut green husk contained protocatechuic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, epicatechin, ferulic acid and rutin. Among those polyphenols, Epicatechin, protocatechuic acid and rutin content were higher.

Key wordswalnut green husk; polyphenols; macroporous resin; separation and purification

收稿日期：2015-09-02，改回日期：2015-10-14

基金項(xiàng)目：西安市農(nóng)業(yè)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(NC1505.4)資助

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603042

第一作者：碩士研究生(韓軍岐博士為通訊作者)。