雙齒圍沙蠶化學成分及其浸膏抗腫瘤活性的研究

宋淑梅++馬睿霄++金楓清++佟長青++翟興月++李偉

摘 要： 采用硅膠柱色譜及薄層制備色譜等手段從雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）中分離純化出2種化合物。對所獲得的化合物通過理化常數(shù)測定、波譜數(shù)據(jù)分析同文獻對照的方法進行了結(jié)構(gòu)鑒定。同時，采用CCK-8方法對雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分分別進行抑制腫瘤細胞活性測試。結(jié)果表明，從雙齒圍沙蠶中分離得到2種化合物分別為：膽甾-4烯3α，6β醇（1）和 （E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro -1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol（2），且化合物1是首次從沙蠶中分離得到。抑制腫瘤細胞活性測試表明，70%乙醇浸提獲得的雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分對人胃癌細胞AGS、人肝癌細胞HepG2以及人卵巢癌細胞SKOV3均具有抑制細胞增殖作用，且具有劑量和時間依賴性，可作為潛在的抗腫瘤藥物進行進一步研究。

關(guān)鍵詞： 雙齒圍沙蠶；化學成分；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定；抑制腫瘤細胞活性

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis），又名沙蟲、海蟲、海蜈蚣等，分類學上屬于環(huán)節(jié)動物門（Annelida）、多毛綱（Polychaeta）、沙蠶科（Nereidae）、圍沙蠶屬（Perinereis） [1]。雙齒圍沙蠶廣泛分布于我國渤海、黃海、東海、南海沿海灘涂[2]。雙齒圍沙蠶具有很高的營養(yǎng)價值，含有豐富的粗脂肪、粗蛋白、不飽和脂肪酸，人體必需的八種氨基酸以及多種礦物質(zhì)和維生素，享有海中“冬蟲夏草”的美稱[3-4]。而且沙蠶養(yǎng)殖成本低，經(jīng)濟價值高，被廣泛用于魚、蝦、蟹人工育苗和養(yǎng)殖。

沙蠶作為海洋無脊椎動物，因其特殊的生活環(huán)境，代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎獨特、生物活性較強的特點。干信等采用氯仿萃取醚脫脂、草酸鹽沉淀、反復加熱分離即傳統(tǒng)的液體-液體的提取法，以及超臨界CO2技術(shù)從沙蠶中制備了一種雜環(huán)堿（沙蠶毒素）[5]。鄧志會等采用硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜、CM-Sepharose FF陽離子交換色譜和Sephacryl S-100 HR 凝膠過濾色譜，從沙蠶體內(nèi)分離純化出一種分子質(zhì)量為28～32 kDa的具有纖溶活性的新型金屬蛋白酶[6]。鄧志會等用pH7.4的生理鹽水作為對照，研究體外沙蠶金屬蛋白酶（NVMP）對家兔新鮮血液的抗凝血和對血栓溶解作用[7]。張偉云等從雙齒圍沙蠶體內(nèi)分離出了一種分子量為33 ku和14.4 ku的纖溶酶[8]。白若倫等研究了沙蠶蛋白酶在降低血液黏度方面的藥理作用[9]。張云龍等分離純化了的沙蠶蛋白酶（溶栓素），其等電點約為3.0，相對分子質(zhì)量在30×105左右[10]。沙蠶蛋白酶可以溶解纖維蛋白，有可能用于預防和治療心、腦梗死，腦動脈和肺動脈血栓形成等疾病作為降纖和溶栓類藥物[11-13]。李云磊等人對采集于福建海岸的沙蠶（Nereis virens）用有機溶劑進行提取，得到提取物A2經(jīng)硅膠柱洗脫，獲得的洗脫組分C2具有顯著的體外抑制HeLa細胞的活性[13]。陳顥等發(fā)現(xiàn)一種從雙齒圍沙蠶和多齒圍沙蠶體內(nèi)提取出的一種溶血栓纖溶酶，該沙蠶激酶可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服藥[14]。潘衛(wèi)東等從雙齒圍沙蠶中發(fā)現(xiàn)一種新的堿性蛋白，該堿性蛋白具有顯著抗菌活性及抗癌作用[15]。汪靖超等人從雙齒圍沙蠶中分離純化出一種蛋白酶，該蛋白酶具有酪蛋白酶活性，有望開發(fā)為一種新型的助消化類藥物[16]。李榮貴等通過運用基因工程的方法表達出了重組沙蠶溶栓性活性蛋白酶（PPA），PPA在體外有纖溶酶原激活活性[17]。但總體來說，對沙蠶化學成分的研究報道還不多。本研究中，對雙齒圍沙蠶化學成分進行分離純化并對它的浸膏抗腫瘤活性進行了研究，旨在為雙齒圍沙蠶的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為海洋藥物的研發(fā)提供生物來源。

1 材料和方法

1.1 材料

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）于2013年在遼寧省大連市長興市場購買；硅膠G與GF254購自青島海洋化工有限公司；人胃癌細胞AGS、人肝癌細胞HepG2、人卵巢癌細胞SKOV3來自中國科學院上海細胞庫；CCK-8檢測試劑盒（Dojindo，CK04）來自株式會社同仁化學研究所；96孔板（NEST，貨號 701001）為上海銳賽生物技術(shù)有限公司提供；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 雙齒圍沙蠶浸膏的制備 1 354 g新鮮雙齒圍沙蠶，勻漿粉碎后置于圓底燒瓶中，加入4倍體積70%乙醇熱浸提2 h，濾出提取液，殘渣中繼續(xù)加4倍體積70%乙醇提取，重復3次。合并提取液，離心取上清液進行減壓濃縮，將濃縮液凍干后得總浸膏。

將上述得到的總浸膏依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取3次。將萃取液減壓濃縮，自然風干，得到石油醚層浸膏（7.06 g），乙酸乙酯層浸膏（3.77 g），正丁醇層浸膏（11.44 g）。

1.2.2 雙齒圍沙蠶化學成分的分離純化 石油醚層浸膏5.5 g，溶解于適量的石油醚中，然后將其滴加到8.2 g硅膠（300～400目）中，充分攪拌使樣品與硅膠充分吸附，然后靜置將石油醚揮干備用。

稱取硅膠（300～400目）44 g，濕法裝柱后用石油醚進行洗脫平衡，然后將上述揮發(fā)完全的拌樣硅膠均勻加入，用石油醚-丙酮體系（100∶0～0∶100）進行梯度洗脫，每個比例洗脫5個柱體積，收集并濃縮洗脫液。然后通過薄層層析法進行跟蹤分析，合并類似組分，得到a、b、c、d、e、f、g、h 8個組分。對組分b進行制備薄層色譜層析，重結(jié)晶得到化合物1。

乙酸乙酯層浸膏3 g溶解于適量乙酸乙酯中，然后將其滴加到4.5 g硅膠（300～400目）中，充分攪拌使樣品與硅膠充分吸附，然后靜置將石油醚揮干備用。

稱取硅膠（300～400目）30 g，濕法裝柱后用二氯甲烷進行洗脫平衡，然后將上述揮發(fā)完全的拌樣硅膠均勻加入，用二氯甲烷-甲醇體系（100∶0～0∶100）進行梯度洗脫，每個比例洗脫5個柱體積，收集并濃縮洗脫液。然后通過薄層層析法進行跟蹤分析，合并類似組分，得到A、B、C 3個組分。對組分A進行制備薄層色譜層析，得到A1、A2、A3 3個亞組分，亞組分A2重結(jié)晶得到化合物2。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 核磁共振光譜（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振儀（500/125 MHz）上進行，以四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標。

1.2.4 體外抗腫瘤活性測定 稱取雙齒圍沙蠶總浸膏 16 mg ，加8 mL超純水溶解配制成濃度為2 mg/mL的母液備用。稱取雙齒圍沙蠶總浸膏24 mg，用4 mL乙酸乙酯溶解配制成濃度為6 mg/mL的母液備用。

將細胞懸液（SKOV3/AGS/HepG2：5×103個細胞/孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，加入上述樣品溶液，使最終濃度分別為2、20、200 μg/mL。于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6、12及36 h后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，測定其在450 nm處的吸光值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)以X ±S表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

用70%乙醇對雙齒圍沙蠶進行熱浸提后，得到雙齒圍沙蠶浸膏。然后對得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進行萃取，得到3部分萃取物。利用薄層層析、硅膠柱層析、沉淀薄層色譜（pTLC）及重結(jié)晶等多種手段，分別對石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分及正丁醇萃取部分進行進一步分離純化。從石油醚萃取部分分離得到1種化合物為化合物1，從乙酸乙酯萃取部分分離得到1種化合物為化合物2。從正丁醇層獲得的化合物有待于進一步鑒定。

化合物1：白色針狀晶體，mp 246～250 ℃，Liebermann-Burchard 反應呈陽性，表明化合物1可能為甾體類化合物，分子式為C27H46O2。 1H NMR δ：5.5（1H，bs），0.73（3H，s），1.23（3H，s），0.92（d，J=6Hz），0.85（H，d，J=6.6Hz），087（3H，d，J=6.6Hz）；13C NMR δ：38.53、2772、66.5、127.63、147.6、73.12、27.26、35.01、53.84、36.9、21.36、29.56、42.4、55.55、22.94、39.16、55.75、11.9、21.13、35.36、17.42、36.24、23.24、38.68、27.1、21.13、21.36。以上波普數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[18]對照，確定化合物1為膽甾-4烯3α，6β醇（Cholest-4-ene-3α，6β-diol），此化合物為首次從沙蠶中分離得到（圖1）。

圖1 化合物1化學結(jié)構(gòu)

化合物2：無色針狀結(jié)晶，mp 137-138 ℃，Liebermann-Burchard 反應呈陽性，表明化合物2可能為甾體類化合物，分子式為C29H48O。1H NMR δ：0.69（3H，s），0.89 （3H，1.09） ，2.32 （25H，m），2.02（1H，s） 3.53（1H，m）， 5.18（2H，m），5.36（1H，m） .13C NMR δ：37.57、3178、71.79、42.38、140.86、121.69、31.72、3328、52.27、36.58、21.17、28.30、42.38、56.94、24.37、38.89、56.84、11.94、19.46、35.85、18.81、36.29、31.99、136.10、131.92、33.28、22.63、2286、21.17.以上波普數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[19]對照，最終確定化合物2為：（E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol（圖2）。

圖2 化合物2化學結(jié)構(gòu)

2.2 抗腫瘤活性實驗結(jié)果

沙蠶總浸膏對AGS細胞（圖3 A）、HepG2細胞（圖3 B）以及SKOV3（圖3 C）3株腫瘤細胞的生長活力抑制活性測定結(jié)果。由圖可以看出：沙蠶總浸膏濃度為200 μg/mL時，其對AGS細胞的抑制活性在其與細胞作用2 h后就顯示出抑制作用，并且隨著作用時間的增加，對細胞的抑制作用也隨之加強。沙蠶總浸膏與HepG2細胞作用時，樣品濃度為200 μg/mL時，作用時間為6 h時表現(xiàn)出一定的抑制作用，作用36 h后抑制作用十分顯著，抑制率為34.04%。沙蠶總浸膏與SKOV3相作用時，樣品濃度為200 μg/mL時，從作用2 h開始就表現(xiàn)出了較為顯著的抑制活性，且隨著作用時間的增加，抑制能力加強，在作用時間為12和36 h時的抑制率分別為43.3%和789%。沙蠶總浸膏在濃度分別為2 μg/mL和20 μg/mL時針對3株腫瘤細胞的抑制活性均不顯著。

A-AGS，B-HepG2，C-SKOV3

圖3 沙蠶總浸膏對三種癌細胞的抑制活性

圖4為乙酸乙酯層浸膏對3株腫瘤細胞的抑制活性。從圖中可以看出乙酸乙酯萃取部分與AGS細胞作用時，乙酸乙酯萃取部分在濃度為200 μg/mL時作用時間在2 h就開始表現(xiàn)出明顯的抑制活性，并隨著作用時間的增加而活性增加，最后在200 μg/mL濃度作用36 h后抑制率達到40.24%（圖4 A）。乙酸乙酯萃取部分與HepG2細胞作用時，從低濃度的2 μg/mL到200 μg/mL均表現(xiàn)出了抑制活性，而且抑制活性從作用時間2 h就開始表現(xiàn)出來，直到作用時間達到36 h，抑制活性隨時間增加而增強，且在200 μg/mL的抑制活性最強（圖4 B）。乙酸乙酯萃取部分與SKOV3細胞作用時，低濃度的樣品沒有表現(xiàn)出明顯抑制活性，在200 μg/mL時表現(xiàn)出顯著的抑制活性，在作用36 h后抑制率達到47.2%（圖4 C）。

A-AGS，B-HepG2，C-SKOV3

圖4 乙酸乙酯萃取部分對三種癌細胞的抑制活性

3 討論

用70%乙醇對雙齒圍沙蠶進行熱浸提后，得到雙齒圍沙蠶浸膏。然后對得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進行萃取并進一步分離純化，獲得2個化合物?；衔?為膽甾-4烯3α，6β醇，此化合物為首次從雙齒圍沙蠶中分離得到?；衔?最初發(fā)現(xiàn)于紅藻Acantophora spicifera中[18]?；衔?為（E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2-yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，化合物2首先發(fā)現(xiàn)于柳珊瑚中[19]。

抑制腫瘤細胞活性測試表明，70%乙醇浸提獲得的雙齒圍沙蠶浸膏及乙酸乙酯萃取部分對人胃癌細胞AGS、人肝癌細胞HepG2以及人卵巢癌細胞SKOV3均具有一定的抑制細胞增殖作用，且具有劑量和時間依賴性，這提示進一步對雙齒圍沙蠶浸膏進行研究，可能獲得潛在的具有腫瘤細胞的化學成分。

在雙齒圍沙蠶中不斷發(fā)現(xiàn)新的化學成分，豐富了雙齒圍沙蠶化學成分的數(shù)據(jù)，為利用雙齒圍沙蠶做為海洋藥物的來源提供了更多的可能性。

參考文獻：

[1]

蔣霞敏，柳敏海.沙蠶科的研究進展[J].海洋科學，2008，32（4）： 82-86

[2]吳寶玲，孫瑞平，楊德漸.中國近海沙蠶科研究[M].北京：海洋出版社，1981：13-19，171-172

[3] 楊士平，劉慧玲，邱德全.天然和養(yǎng)殖沙蠶營養(yǎng)成分分析[J].飼料工業(yè)，2013，34（ 10 ）：53-55

[4] 朱國萍，陳子騰，葉寧.湛江養(yǎng)殖雙齒圍沙蠶營養(yǎng)成分的測定[J].當代水產(chǎn)，2014（8）：76-77

[5] 干信.用超臨界CO2萃取法從沙蠶中提取高純度沙蠶毒素的研究[J].科學技術(shù)，1997（5）：35-36

[6] 鄧志會，孫賀，林巖，等.一種新型具有纖溶活性的沙蠶金屬蛋白酶的分離及性質(zhì)研究[J].中國生物化學與分子生物學報，2011；27（8）：768-74

[7] 鄧志會，孫東升，李波，等.沙蠶金屬蛋白酶體外抗凝血與溶栓作用[J].中國老年學雜志，2012，11（32）：4709-4710

[8] 張偉云，陳顥，汪水娟，等.沙蠶纖溶酶的一種純化方法[J].中草藥，2001，32（8）：673-674

[9] 白若倫，李奇，劉佳，等.沙蠶蛋白酶對血小板聚集及血液流變學的影響[J].中國新藥雜志，2009，18（10）：930-933

[10] 張云龍，崔佳樂，付海英，等.溶栓素的分離純化及特性測定[J].中國生化藥物雜志，2005，26（1）： 18-21

[11] 李奇，遲秀梅，石立紅，等.N-V蛋白酶體內(nèi)外纖維蛋白溶解活性的實驗研究[J].中國藥理學通報，2006，22（8）： 976-979

[12] 李奇，洪敏，付海英，等.溶栓素抗凝血和抗血栓形成作用的實驗研究[J].吉林大學學報（醫(yī)學版），2004，30（3）： 401-403

[13] 李云磊，張榮生，李峰，等.沙蠶活性物質(zhì)的分離提取及對HeLa細胞的毒性分析[J].福州大學學報（自然科學版），2014，42（1）：149-153

[14] 陳顆，張偉云，譚仁祥，等.沙蠶激酶及其提取方法和用途.中國發(fā)明專利：98111280.3[P].1999

[15] 潘衛(wèi)東，戈峰.一種從雙齒圍沙蠶中提取的蛋白質(zhì)及其制備方法和用途.中國發(fā)明專利：03102033.X[P]

[16] 汪靖超，趙峰，李榮貴，等.雙齒圍沙蠶蛋白酶的純化及其性質(zhì)[J].世界華人消化雜志，2007，15（8）：500-506

[17] 李榮貴，趙峰，楊宏，等.重組沙蠶溶栓活性蛋白酶的純化及其性質(zhì)研究[J].中國海洋藥物，2007，26（2）：1-6

[18] Wahidulla S，d'Souza L，Govenker M.Lipid constituents of the red alga Acantophora spicifera.Phytochemistry，1998，48：1203-1206

[19] 蘇鏡娛，龍康侯，簡志剛.中國柳珊瑚化學成分的研究（v）[J].中山大學學報，1984（1）：97-101

Constituents in Perinereis aibuhitensis and inhibitory activity of all extracts from P.aibuhitensis against tumour cells

SONG Shu mei1，MA Rui xiao1，JIN Feng qing1，TONG Chang qing1，ZHAI Xing yue2，LI Wei1

（1.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China； 2.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China）

Abstract ：Two compounds were isolated from Perinereis aibuhitensis by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on tumour cells of all extracts from P.aibuhitensis were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that two compounds were obtained and identified as cholest-4-ene-3α，6β-diol and （E）-17-（4，7-dimethyloct-5-en-2yl）-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-3-ol.All extracts from P.aibuhitensis using 75% EtOH and ethyl acetate layer exhibited the potent inhibitory activities against HepG2，AGS and SKOV3 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.

Key words ：Perinereis aibuhitensis；constituent；structural identification；tumour cell

（收稿日期：2015-07-29）