澳洲堅果果皮不同溶劑提取物的含量和抗氧化活性

林文秋+楊為海+鄒明宏

摘要：以成熟的澳洲堅果為試驗材料，分別選用水和體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、70%乙醇與70%丙酮4種溶劑對澳洲堅果的新鮮果皮進(jìn)行浸提，測定各溶劑提取物的總酚、總黃酮與單寧含量及其抗氧化活性。結(jié)果表明，不同溶劑對澳洲堅果果皮中總酚、總黃酮與單寧含量以及DPPH、ABTS自由基清除能力與總抗氧化能力方面存在明顯差異，以體積分?jǐn)?shù)70%丙酮提取物的總酚、總黃酮與單寧含量最高，分別為（6.63±0.15） mg/g（FW）、（8.65±0.32） mg/g（FW）、（8.80±0.31） mg/g（FW）。其次是70%甲醇、70%乙醇；水提取物的含量最低。相關(guān)性分析表明，提取物中的總酚含量與其抗氧化能力顯著相關(guān)。可見，提取劑的性質(zhì)明顯影響其提取物的酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：澳洲堅果果皮；溶劑提取物；多酚；黃酮；抗氧化活性

中圖分類號： S667.901 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0171-04

澳洲堅果（Macadamia spp.）別稱夏威夷果，原產(chǎn)于澳洲，屬于山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia F. Mull）常綠喬木果樹，被譽為世界“干果之王”，以富含多種不飽和脂肪酸為主要特點，還含有蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素和維生素等，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效。 作為一種新興的高檔堅果類果品，澳洲堅果在國際市場上供不應(yīng)求，具有廣闊的市場前景。近年來，中國澳洲堅果產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，目前種植規(guī)模已達(dá)652 km2，年產(chǎn)帶殼果約9 700 t[1]。

澳洲堅果果實主要由果皮、種殼和果仁組成，其初加工的主要副產(chǎn)物為約占果實鮮質(zhì)量的1/2的果皮和約占帶殼果干質(zhì)量的2/3種殼。當(dāng)前國內(nèi)外對澳洲堅果果仁的營養(yǎng)成分[2-5]與保健價值[6-7]、種殼的功能性組分[8-10]及開發(fā)利用[11-13]等方面的研究報道較多，但對果皮內(nèi)含物的研究僅見于不同種質(zhì)果皮的粗蛋白、可溶性糖、單寧及礦質(zhì)元素含量的測定與分析[14-15]，至今尚未見有果皮酚類物質(zhì)及其抗氧化活性研究的報道。本試驗采用水和體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、70%乙醇與70%丙酮4種溶劑浸提澳洲堅果果皮，研究不同溶劑提取物的總酚和總黃酮含量及其抗氧化活性的差異，旨在探討適宜獲得澳洲堅果果皮中天然抗氧化物質(zhì)的提取溶劑，為開發(fā)和利用澳洲堅果果皮這一副產(chǎn)物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試澳洲堅果果皮為已成熟的澳洲堅果新鮮果實，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃，分離出果皮，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器有紫外可見分光光度計UV-1200，上海美譜達(dá)儀器有限公司；電子分析天平ML204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī)Heraeus Multifuge X1R，德國Thermo Fisher Scientific公司。

主要試劑包括Folin-Cioealteu試劑、沒食子酸、蕓香苷、Trolox（水溶性維生素E類似物）、DPPH、ABTS、TPTZ，均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 準(zhǔn)確稱取澳洲堅果果皮1.0 g，放入研缽中，液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，分別以體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水，料液比為 1 g ∶10 mL，充分混勻后置于37 ℃水浴中浸提1 h，4 ℃ 離心（2 200 g）20 min，取上清備用。

1.2.2 總酚含量測定 總酚含量的測定采用改良Folin-Cioealteu 法[16]。取0.5 mL樣品溶液與2.5 mL 10% Folin-Cioealteu反應(yīng)液于15 mL試管中，充分混勻，避光孵育5 min后與2.0 mL 20% Na2CO3溶液充分混勻，30 ℃水浴避光反應(yīng)1 h，于765 nm下測定吸光度，重復(fù)3次。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量（mg/g，F(xiàn)W）。

1.2.3 總黃酮含量測定 總黃酮含量的測定參照Benamar等的方法[17]。取0.5 mL樣品溶液與0.5 mL 5% NaNO2溶液于15 mL試管中，充分混勻，反應(yīng)5 min后加入0.5 mL 10% AlCl3搖勻，靜置6 min；再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH，于40 ℃水浴中避光反應(yīng)15 min后，于510 nm下測定吸光度，重復(fù)3次。以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮的含量（mg/g，F(xiàn)W）。

1.2.4 單寧含量的測定 單寧含量的測定參照等的方法。取2 mL樣品溶液加入含有25 mL蒸餾水和2.5 Folin-Donis試劑的容量瓶中，加入1mol/L的碳酸鈉溶液，劇烈振蕩，于30 ℃恒溫箱中放置1.5 h后，于680 nm下測定吸光度，重復(fù)3次。以單寧標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算單寧含量（mg/g，F(xiàn)W）。

1.2.5 抗氧化活性測定 DPPH自由基清除能力的測定。參照Vieira等的方法[18]，利用60 mL甲醇和40 mL乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH值5.5）現(xiàn)配DPPH溶液（50 μmol/L）。取 2.9 mL DPPH溶液，于517 nm下測定其初始吸光度（D0）；取2.9 mL DPPH溶液和0.1 mL樣品溶液充分混勻后，于 30 ℃ 水浴中避光反應(yīng)15 min，測定其吸光度（D15）。以甲醇-乙酸鈉緩沖液為空白調(diào)0，重復(fù)測定3次。樣品的DPPH自由基清除率按[100%-（D15/D0）× 100%]計算，用Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其抗氧化活性。

ABTS自由基清除能力的測定。參照Re等的方法[19]，將現(xiàn)配的ABTS反應(yīng)液（7 mmol/L）用80%乙醇稀釋至734 nm的吸光度為0.70±0.02，作為其初始吸光度（D0）；取0.1 mL樣品溶液與2.9 mL稀釋了的ABTS反應(yīng)液混勻，于30 ℃水浴中避光反應(yīng)7 min，測定其吸光度（D7）。以80%乙醇為空白調(diào)0，重復(fù)測定3次。樣品的ABTS自由基清除率按[100%-（D7/D0）× 100%]計算，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其抗氧化能力。

總抗氧化能力的測定。參照Benzie等的FRAP法[20]，將乙酸鈉緩沖液（0.3 mol/L，pH值3.6）、TPTZ（10 mmol/L）與FeCl3·6H2（20 mmol/L）按體積比10 ∶1 ∶1現(xiàn)配FRAP試劑，取0.15 mL樣品溶液和2.85 mL FRAP反應(yīng)液混勻，于 37 ℃ 水浴中避光反應(yīng)20 min后，于593 nm下測定其吸光度，重復(fù)測定3次。以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總抗氧化能力。

1.2.6 統(tǒng)計分析 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅果果皮不同溶劑提取物的總酚、總黃酮與單寧含量

水和體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮為提取溶劑，測定澳洲堅果果皮的總酚（沒食子酸等效物）、總黃酮（蕓香苷等效物）和單寧（單寧酸等效物）的含量（表1）。由表1可知，不同溶劑提取的總酚、總黃酮、單寧含量均具有一定差異，其中體積分?jǐn)?shù)為70%丙酮的提取效果最佳，其次是體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇和70%的乙醇，水提取效果最差。70%丙酮提取液總酚含量（6.63 mg/g，F(xiàn)W）、總黃酮含量（8.65 mg/g，F(xiàn)W）、單寧含量（8.80 mg/g，F(xiàn)W）顯著高于70%乙醇（4.70、4.45、5.18 mg/g，F(xiàn)W ）、70%甲醇（4.39、3.9、5.19 mg/g，F(xiàn)W）和水（2.28、2.74、2.31 mg/g，F(xiàn)W）。比較而言，體積分?jǐn)?shù)70%丙酮提取液的總酚、總黃酮與單寧含量分別約是體積分?jǐn)?shù)70%甲醇與70%乙醇提取液的1.5、2.0、1.7倍，說明對澳洲堅果果皮中的總酚、總黃酮與單寧這3種物質(zhì)，體積分?jǐn)?shù)為70%丙酮的提取效果最好。

2.2 澳洲堅果果皮不同溶劑提取物的抗氧化活性

2.2.1 總抗氧化能力FRAP FRAP法是一種快速簡便、重復(fù)性好的測定總抗氧化能力的方法，待測生物活性物質(zhì)將Fe3+還原為Fe2+的能力越大，其抗氧化活性越強。本研究是以Fe2+當(dāng)量計算澳洲堅果果皮提取物的總抗氧化能力，結(jié)果見圖1。圖1表明，不同溶劑提取液的總抗氧化能力具有顯著差異，總抗氧化能力大小排序為70%丙酮>70%乙醇>70%甲醇>水，總抗氧化能力依次為（191.43±6.72）、（109.86±6.33）、（100.58±7.27）、（62.54±0.98） μmol/g。其中，70%丙酮提取液的總抗氧化能力顯著高于醇提取液和水。體積分?jǐn)?shù)70%丙酮提取液的總抗氧化能力約是醇提取液的1.9倍和水提取液的3.1倍。

2.2.2 DPPH自由基清除能力差異 DPPH法常用于抗氧

化劑清除自由基能力的評價。本研究中，以標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑Trolox為等效物來衡量澳洲堅果果皮4種溶劑提取物的 DPPH 自由基清除能力，結(jié)果如圖2所示。圖2表明，不同溶劑提取液對DPPH自由基清除能力不同，其對DPPH自由基清除能力順序為70%甲醇提取溶劑[（104.67±2.54） μmol/g，F(xiàn)W ]> 70%丙酮提取溶劑[（51.30±1.99） μmol/g，F(xiàn)W ]> 70%乙醇提取溶劑[（35.61±5.85） μmol/g，F(xiàn)W ]> 水[（34.19±0.40） μmol/g，F(xiàn)W]。4種溶劑中體積分?jǐn)?shù)70%甲醇提取溶劑的DPPH自由基清除能力顯著高于其他3種，而70%丙酮、70%乙醇和水3種溶劑的DPPH自由基清除能力差異不顯著，說明70%甲醇是澳洲堅果DPPH自由基清除能力的最佳提取溶劑。

2.2.3 ABTS自由基清除作用 與DPPH自由基類似，ABTS+與抗氧化劑反應(yīng)后溶液發(fā)生褪色，溶液褪色越明顯，則表明所檢測物質(zhì)的抗氧化能力越強。本研究以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)計算澳洲堅果果皮4種溶劑提取物的ABTS自由基清除能力，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同溶劑提取液對ABTS自由基的清除能力不同，其對ABTS自由基清除能力的強弱順序依次為70%丙酮[（136.31±6.09） μmol/g，F(xiàn)W]>70%甲醇[（100.79±0.93） μmol/g，F(xiàn)W ]>70%乙醇[（81.13±3.35） μmol/g，F(xiàn)W]>水[（60.35±0.67） μmol/g，F(xiàn)W]。4種溶劑中，體積分?jǐn)?shù)70%丙酮提取溶劑的ABTS自由基清除能力顯著高于其他3種，70%甲醇、70%乙醇提取溶劑ABTS自由基清除能力差異不顯著，說明70%丙酮是澳洲堅果ABTS自由基清除能力的最佳提取溶劑。

2.3 澳洲堅果果皮總酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析（表2）表明，總酚含量與單寧含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.901），與總黃酮含量不相關(guān)，由此說明單寧類化合物是澳洲堅果果皮酚類物質(zhì)的主要組成部分。此外，總酚與DPPH、ABTS、FRAP清除率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.901、0.978、0.921；單寧含量和DPPH、ABTS、FRAP清除率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.972、0.919、0.998；而總黃酮含量與DPPH、ABTS、FRAP清除率不相關(guān)，說明酚類物質(zhì)在澳洲堅果果皮抗氧化能力方面發(fā)揮著重要作用?？偡雍亢涂寡趸钚詼y定的3個指標(biāo)均有顯著相關(guān)性，表明DPPH、ABTS、FRAP清除率均適用于澳洲堅果進(jìn)行抗氧化能力的分析。

3 結(jié)論與討論

澳洲堅果果皮是澳洲堅果初加工后遺留的副產(chǎn)物，在整個果實中占較大比重。目前，國內(nèi)外澳洲堅果加工企業(yè)對果皮的回收利用還不夠重視，造成資源浪費，而且對環(huán)境還有一定的污染。對山核桃[21-22]、柑橘[23]、荔枝[24]等研究表明，果皮含有很多天然抗氧化成分，具有抗氧化、抗致突變、抗衰老、抗炎和抑菌等活性。植物多酚類物質(zhì)是天然的抗氧化劑，可有效地協(xié)助維持體內(nèi)自由基代謝的平衡，減少或防止相關(guān)疾病的發(fā)生[25]。雖然張明楷等報道了澳洲堅果果皮富含單寧物質(zhì)[14]，但對果皮的抗氧化活性尚未有研究。本研究結(jié)果表明，澳洲堅果果皮提取物含有較豐富的酚類與黃酮類化合物，對DPPH與ABTS自由基具有較強的清除能力，且具有較高的總抗氧化能力，表明澳洲堅果果皮提取物具有較好的抗氧化活性，可在防衰老、抗炎癥等方面發(fā)揮作用。然而，對于澳洲堅果果皮提取物中的活性成分及其作用機(jī)理，還有待于進(jìn)一步研究。

不同溶劑制備的提取物中多酚類含量及其抗氧化活性顯著不同，這可能與提取劑的極性有關(guān)[26]。以水、甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑，提取石榴皮[27]、紫蘇草[28]、板栗[29]、高粱[30]、棗果渣[31]的抗氧化活性物質(zhì)并對其抗氧化活性能力的分析發(fā)現(xiàn)，丙酮溶劑提取物的抗氧化活性顯著高于其他3種溶劑，其次是甲醇和乙醇，水最低。而菠蘿[32]、紅薯葉[33]和翠云草[34]的抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)，甲醇提取溶劑的抗氧化效果最好。本研究中利用不同極性的溶劑提取澳洲堅果果皮中抗氧化物質(zhì)，所獲提取物中的總酚、總黃酮與單寧含量也顯著不同，以致不同溶劑提取物清除DPPH和ABTS自由基能力以及總抗氧化能力存在顯著差異。其中，丙酮溶劑提取物的抗氧化能力顯著高于水、甲醇和乙醇。綜合分析4種提取溶劑抗氧化物的FRAP、ABTS和DPPH自由基清除能力可知，4種溶劑提取物均具有一定抗氧化能力，其中丙酮溶劑提取物抗氧化能力最高，其次是甲醇和乙醇，水提取物的抗氧化能力最低。綜上所述，體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶劑為提取澳洲堅果果皮中的抗氧化物質(zhì)最佳溶劑。

通過DPPH、ABTS和FRAP等方法對澳洲堅果果皮抗氧化活性測定發(fā)現(xiàn)，總酚含量與3種測定指標(biāo)均具有顯著相關(guān)性，該結(jié)果也客觀反映了3種方法測定澳洲堅果果皮抗氧化活性的準(zhǔn)確性。

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