GM-CSF分泌型肝癌疫苗對荷瘤鼠脾血細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性的影響

郭銀燕 文 劍 張永臣 楊永峰

腫瘤疫苗是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。為了提高其免疫原性，常需在腫瘤疫苗中加入佐劑。滅活腫瘤細(xì)胞加粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）主動免疫療法是目前已知的腫瘤免疫療法中最為安全和有效的方法。GM-CSF作為腫瘤疫苗免疫佐劑已在腎癌、惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等進(jìn)行了臨床試驗(yàn)[1～4]，并取得了一定的療效。有研究表明能表達(dá)GM-CSF的自體腫瘤細(xì)胞經(jīng)照射后能增強(qiáng)全身免疫反應(yīng)[5]。我們制備了GM-CSF分泌型肝癌疫苗并免疫小鼠，獲得了明顯的抗腫瘤效果，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物與試劑 SPF級雌性5周齡ICR小鼠，體重18～22g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。GM-CSF分泌細(xì)胞（每支0.3ml，含4×106細(xì)胞）及原代腫瘤細(xì)胞處理試劑盒購自北京博渥德生物技術(shù)有限公司。H22小鼠肝癌細(xì)胞株（每支0.1ml，至少含有1×106細(xì)胞）購于美國Sciencell公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%滅活胎牛血清的RPMI1640（GIBCO公司）完全培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶（美國Sigma公司）消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

三、GM-CSF分泌型肝癌疫苗的制備 將H22細(xì)胞株按原代腫瘤細(xì)胞處理操作說明滅活處理后與GM-CSF分泌細(xì)胞按照5∶2比例混合，其分泌GM-CSF量大于1μg/106細(xì)胞/24h。

四、肝癌細(xì)胞移植瘤動物模型制備 復(fù)蘇小鼠肝癌細(xì)胞株H22，按細(xì)胞濃度1×106細(xì)胞/只注入小鼠腹腔內(nèi)，接種7d形成腹水瘤后再在小鼠體內(nèi)傳3代后使用；取生長旺盛且無血性的腹水，在無菌條件下制成2×107/ml的細(xì)胞懸液，以2×106細(xì)胞/0.1ml/只接種于3組小鼠右前肢皮下。4天后，開始在右側(cè)背部皮下進(jìn)行免疫治療。將肝癌細(xì)胞移植瘤動物隨機(jī)分成三組（每組 5只），即 1，H22-GM-CSF組：接種GM-CSF分泌型H22肝癌疫苗，每只“H22腫瘤細(xì)胞”0.1ml和“GM-CSF分泌細(xì)胞”30μl，融合后混合，再注射；2，H22組：接種H22肝癌細(xì)胞瘤苗，每只“H22腫瘤細(xì)胞”0.1ml；3，PBS組：接種 PBS，每只 0.1ml。每周免疫注射1次，共3次。免疫小鼠后每3d用卡尺測量一次腫瘤體積。腫瘤體積（tumor volume，TV）的計算公式為：TV=1/2×a×b2。其中a和b分別表示長和寬，取均值，描繪各組荷瘤小鼠腫瘤生長曲線。

五、小鼠脾血CTL殺傷活性檢測 分別于免疫前及末次免疫后1周，處死小鼠，取其脾細(xì)胞，制備成效應(yīng)細(xì)胞懸液，以小鼠肝癌H22細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)刺激，觀察效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷比率。采用細(xì)胞增殖計數(shù)法（cell counting kit-8，CCK-8）法，將對數(shù)生長期小鼠肝癌細(xì)胞H22，以1×106/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100μl，按效 /靶比 50:1、25:1和5:1的比例分別加入脾臟細(xì)胞懸液100μl，每組設(shè)立3個復(fù)孔，同時設(shè)立靶細(xì)胞對照組、效應(yīng)細(xì)胞組和空白對照組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，每孔分別加入CCK-8試劑10μl，培養(yǎng)箱中孵育4h，使用酶聯(lián)免疫分析儀檢測各孔在波長450nm處的吸光度。按下列公式計算CTL殺傷活性，即殺傷活性（%）=[1-（效靶混合細(xì)胞的平均A值-效應(yīng)細(xì)胞的平均A值）/對照孔的平均A值]×100%。

結(jié)果

一、荷瘤鼠腫瘤體積的變化 在免疫小鼠后21天，H22-GM-CSF組、H22組和PBS組小鼠腫瘤體積分別為 0.63±0.05mm3、1.47±0.75mm3和 1.79±0.34 mm3（P<0.05，圖1）。

圖1 各組小鼠腫瘤體積的變化

二、小鼠脾CTL殺傷活性的變化 小鼠在免疫前，當(dāng)效/靶比為5∶1、25∶1和50∶1時，CTL殺傷活性分別為1.87±1.32%、5.81±2.82%和14.12±2.60%。在GM-CSF-H22免疫后，小鼠CTL殺傷活性顯著高于其他兩組（表1）。

表1 各組小鼠脾CTL殺傷活性（%，）的比較

表1 各組小鼠脾CTL殺傷活性（%，）的比較

與PBS組和H22組比，①P<0.01

效：靶=5:1 效：靶=25:1 效：靶=50:1 GM-CSF-H22 12.1±3.2① 22.2±7.1① 60±6.1①H22 10.2±4.3 9.0±1.5 17.4±0.9 PBS 3.4±1.9 5.6±0.9 12.2±0.6

討論

GM-CSF是一種人體內(nèi)天然存在的23kD糖蛋白，具有刺激造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞增殖、分化和活化作用的細(xì)胞因子。GM-CSF的主要作用是對粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系細(xì)胞的維持存活、促進(jìn)生長、誘導(dǎo)分化和增強(qiáng)功能等。GM-CSF可維持造血前體細(xì)胞和成熟血細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞）的存活；能夠促進(jìn)造血前體細(xì)胞（包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨核細(xì)胞等前體細(xì)胞）增殖分化。GM-CSF能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬功能，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，對粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有直接的趨化作用。GM-CSF誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟和功能性分布的作用已受到廣泛關(guān)注，有可能被應(yīng)用于免疫治療中誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞[6]。

CTL表面的TCR對靶抗原的識別及其對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)具有高度特異性，它只殺傷表面帶有特異性腫瘤抗原和MHC-I類分子的靶細(xì)胞[7]。CTL細(xì)胞數(shù)與被殺傷的腫瘤細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)對小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行瘤細(xì)胞-脾細(xì)胞混合培養(yǎng)，其目的是使CTL進(jìn)一步活化，因?yàn)榛罨疌TL需要兩種不同的信號。一類信號來自TCR特異性識別靶細(xì)胞膜上MHC-I類分子-抗原肽復(fù)合物，并通過CD3分子參與抗原識別信號的傳遞；第二信號來自于CTL膜表面各種輔助分子如CD28、CD2、LFA-1和靶細(xì)胞表面相應(yīng)配體分子（如B7）?；罨腃TL還需在活化的CD4+Th1細(xì)胞分泌的IL-2等細(xì)胞因子的作用下，才能分化為效應(yīng)性CTL。在這兩種信號作用下就觸發(fā)了CTL細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)。其細(xì)胞毒效應(yīng)機(jī)制主要有兩種[8]，①細(xì)胞裂解性殺傷：CTL分泌諸如穿孔素一類的介質(zhì)損傷靶細(xì)胞膜，顆粒酶可經(jīng)由穿孔素在靶細(xì)胞膜上構(gòu)筑的小孔進(jìn)入靶細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。在CTL-靶細(xì)胞相互接觸的區(qū)域形成密封的袋，CTL胞內(nèi)顆粒由高爾基體區(qū)向接觸區(qū)移動并釋放顆粒內(nèi)的穿孔素和粒酶，穿孔素導(dǎo)致靶細(xì)胞膜形成許多跨膜小管，粒酶通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞最終引起細(xì)胞腫脹、破裂；②誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:即CTL表達(dá)的Fas配體與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Fas受體結(jié)合，從而啟動腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞通過分泌腫瘤壞死因子、顆粒酶以進(jìn)一步破壞靶細(xì)胞。對某一個靶細(xì)胞攻擊后，CTL仍然保持完整并具有活性，能夠繼續(xù)攻擊其它靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在瘤苗接種后H22-GM-CSF肝癌細(xì)胞瘤苗組效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力增加明顯，遠(yuǎn)高于其他各組，并且隨著效靶比增大，CTL殺傷活性增強(qiáng)。可以推斷該疫苗免疫效果主要通過直接活化CD8+T細(xì)胞而產(chǎn)生。

GM-CSF分泌型肝癌疫苗治療H22移植性肝癌荷瘤鼠使腫瘤生長得到明顯抑制，荷瘤鼠外周血CTL在體外對同種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性殺傷活性。

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