流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的兩種方法比較①

蔡思齊 鄧志輝

(南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)系,廣州510515)

自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK cell)是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及腫瘤免疫密切相關(guān)。在多種細(xì)胞因子(如IL-2、IL-15等)、飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder cells)的作用下，NK細(xì)胞可發(fā)生增殖和活化，分泌細(xì)胞因子和增強(qiáng)細(xì)胞毒功能。目前，NK細(xì)胞免疫治療已成為細(xì)胞免疫治療的重要方法，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，對(duì)評(píng)估病患免疫水平及細(xì)胞免疫治療效果具有重要意義。

檢測(cè)外周血或體外培養(yǎng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，是評(píng)估NK細(xì)胞活性的主要方法，也是了解NK細(xì)胞功能最直接的方法。目前NK細(xì)胞活性檢測(cè)的主要方法有：“金標(biāo)準(zhǔn)”51Cr釋放法、LDH釋放法、MTT法等。這些方法或存在放射性污染，或易受實(shí)驗(yàn)條件、操作者熟練程度干擾，重復(fù)性差；或者無(wú)法區(qū)分靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞死亡，不能很好地反映NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能水平。本文在已有方法的基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞術(shù)比較鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein-AM)釋放法，及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯/7-氨基-放線(xiàn)菌素 D(CFSE/7-AAD)雙染色法檢測(cè)體外培養(yǎng)后的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞及白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，為NK細(xì)胞毒活性檢測(cè)提供一種較為穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、靈敏度高的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來(lái)源 K562細(xì)胞株(深圳市漢科生物工程有限公司張明杰教授贈(zèng)送)，白血病原始細(xì)胞留取自在深圳市血液中心進(jìn)行骨髓移植HLA配型的白血病患者，NK細(xì)胞采自健康志愿獻(xiàn)血者。按知情同意原則，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑和儀器 X-vivo15培養(yǎng)液(瑞士Lonza公司)，RPMI1640完全培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液[生工生物工程(上海)股份有限公司]，抗人 CD56、CD3抗體(美國(guó)BD Pharmingen公司)，HANK細(xì)胞體外培養(yǎng)試劑盒(深圳漢科生物工程有限公司)，Calcein-AM(美國(guó)Thermo Fisher公司)，CFSE、7-AAD(美國(guó)BD Pharmingen公司)，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱HF240(上海力申科學(xué)儀器廠(chǎng))，TDL-400低速臺(tái)式大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))，BD ACCURI C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Pharmingen公司)。

1.2方法

1.2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與NK細(xì)胞培養(yǎng) 采集7名健康志愿獻(xiàn)血者靜脈血10 ml/人份，密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用X-vivo15培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×106ml-1，于37.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平置培養(yǎng)13～14 d(HANK細(xì)胞體外培養(yǎng)試劑盒,按說(shuō)明書(shū)使用)。使用抗人CD56、CD3抗體在BD ACCURI C6流式細(xì)胞儀上測(cè)定NK細(xì)胞(CD3-CD56+)含量。

1.2.2白血病原始細(xì)胞的分離與處理 4例初診、未經(jīng)治療的白血病患者的骨髓樣本，采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離獲得白血病原始細(xì)胞，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3兩種方法檢測(cè)7例NK細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

1.2.3.1Calcein-AM釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞毒作用 取培養(yǎng)13～14 d的NK細(xì)胞及靶細(xì)胞，洗滌去除培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整NK細(xì)胞密度，備用。

Calcein-AM標(biāo)記靶細(xì)胞：取PBS以24℃、300 g離心10 min，洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107ml-1；加入終濃度為5 μmol/L的Calcein-AM，混勻，置于25℃、避光處孵育30 min。取出細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液充分洗滌，并調(diào)整靶細(xì)胞密度為4×105ml-1，備用。

效-靶細(xì)胞共培養(yǎng)：將處理好的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按不同的效靶比(20∶1、10∶1)加入U(xiǎn)形底96孔培養(yǎng)板中，在25℃下100 g離心1 min使細(xì)胞密切接觸。5%CO237℃培養(yǎng)箱，共培養(yǎng)4 h。設(shè)置僅NK細(xì)胞或僅靶細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照，計(jì)算自然死亡率。

Calcein-AM釋放法靶細(xì)胞死亡率檢測(cè)：收集96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞，PBS液洗滌細(xì)胞并重懸細(xì)胞。首先根據(jù)FSC和SSC確定靶細(xì)胞群，在FL-1通道，記錄共培養(yǎng)前后靶細(xì)胞MFI(Mean fluorescence intensity)值(MFI自發(fā)熒光、MFI標(biāo)記)，再記錄效靶細(xì)胞群及陰性對(duì)照在共培養(yǎng)后的MFI(MFI共培養(yǎng)、MFI對(duì)照)；計(jì)算共培養(yǎng)后MFI變化值占初始熒光強(qiáng)度的比例，再扣除自然死亡率，即為靶細(xì)胞死亡率[1]。計(jì)算公式為：靶細(xì)胞死亡率=(MFI共培養(yǎng)-MFI自發(fā)熒光)/(MFI標(biāo)記-MFI自發(fā))-(MFI對(duì)照-MFI自發(fā)熒光)/(MFI標(biāo)記-MFI自發(fā))。

1.2.3.2CFSE/7-AAD雙染法檢測(cè)NK細(xì)胞毒作用 NK細(xì)胞準(zhǔn)備同步驟1.2.3.1。CFSE/7-AAD法標(biāo)記靶細(xì)胞：用DPBS液洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×107個(gè)/ml。加入CFSE(美國(guó)BD Pharmin-gen公司)，終濃度為2.5 μmol/L，混勻后置于37℃水浴箱中，避光孵育10 min。取出細(xì)胞，用含有10%FBS的冷 RPMI1640充分洗滌。RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整靶細(xì)胞密度為4×105ml-1，備用。效靶細(xì)胞培養(yǎng)及陰性對(duì)照設(shè)置同步驟1.2.3.1。

CFSE/7-AAD法靶細(xì)胞死亡率檢測(cè)：收集96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞，PBS液洗滌細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞，加入4 μl 7-AAD標(biāo)記死亡細(xì)胞，混勻，室溫避光孵育20～25 min。PBS液洗滌1次。根據(jù)FSC和SSC確定靶細(xì)胞群，對(duì)CFSE+細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門(mén)，分析該細(xì)胞群中 CFSE+/7-AAD+雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比率即為靶細(xì)胞死亡率。計(jì)算公式：靶細(xì)胞死亡率=殺傷后靶細(xì)胞死亡率-靶細(xì)胞自然死亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，方差不齊時(shí)使用Cochran&Cox近似t檢驗(yàn)(t′檢驗(yàn))。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NK細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 初始培養(yǎng)時(shí)NK細(xì)胞占PBMC的比例僅為(11.76±3.55)%，自第5天開(kāi)始增加，至培養(yǎng)第13天，NK細(xì)胞比例增至(83.65±3.18)%(表1)。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的NK細(xì)胞比例變化進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，決定系數(shù)R2=0.928，經(jīng)F檢驗(yàn)P=0.000 5，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；回歸系數(shù)b=0.644，對(duì)b進(jìn)行t檢驗(yàn)，P=0.000 5，NK細(xì)胞純度與培養(yǎng)時(shí)間存在直線(xiàn)關(guān)系，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其N(xiāo)K細(xì)胞比例隨之增加。

2.2Calcein-AM及CFSE對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記結(jié)果 在前述工作濃度下，Calcein-AM及CFSE均能對(duì)密度為1×107ml-1的靶細(xì)胞進(jìn)行有效標(biāo)記，二者對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記率均可達(dá)99%以上。在FL-1通道上能夠顯著地與NK細(xì)胞的自發(fā)熒光峰進(jìn)行區(qū)分(圖1)。

2.3培養(yǎng)第13天的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性 NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(表2)：在對(duì)K562細(xì)胞的殺傷中，隨著效靶比的增高，兩種方法檢出NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均增高。但在效靶比20∶1時(shí)，CFSE/7-AAD法檢出的靶細(xì)胞死亡率高于Calcein-AM釋放法(圖2)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在效靶比10∶1時(shí)，NK的細(xì)胞毒作用減弱，CFSE/7-AAD法(圖3A～C)所檢測(cè)出的細(xì)胞毒性高于Calcein-AM釋放法(圖2A～D)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

NK細(xì)胞對(duì)白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(見(jiàn)表2)：本文從4名白血病患者中分離的白血病原始細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例為(91.00±1.83)%。在對(duì)白血病原始細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)中，CFSE/7-AAD檢出的細(xì)胞毒性顯著高于Calcein-AM釋放法(P<0.05)。 在對(duì)3、4號(hào)患者白血病原始細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用弱，Calcein-AM釋放法中FL-1上MFI改變不顯著，盡管能夠計(jì)算靶細(xì)胞死亡率，但結(jié)果不準(zhǔn)確、誤差大(圖2E～H)，而CFSE/7-AAD能夠靈敏地檢出較弱的細(xì)胞毒作用(圖3D～F)，與Calcein-AM法比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法所檢測(cè)的各組靶細(xì)胞自然死亡率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.45，P=0.81)。

圖1 靶細(xì)胞經(jīng)Calcein-AM或CFSE標(biāo)記前后FL-1通道上熒光強(qiáng)度變化及NK細(xì)胞自發(fā)熒光

表1NK細(xì)胞體外培養(yǎng)的純度變化(n=7)

Tab.1PurityofNKcellsduringvitroexpansion(n=7)

Duration of NK cells vitro expansion0 d3 d5 d7 d9 d11 d13 dParameters of linear regressionbPPurity of NK cells(%,x±s)11.76±3.556.22±2.8926.05±5.5638.40±7.5761.20±10.3573.91±6.7083.65±3.180.6440.0005

Target cellsDiagnosisK562-1#ALL2#AML3#AML4#AML10∶1Calcein-AM44.29±9.189.50±3.5014.16±6.552.07±0.692.96±1.81CFSE/7-AAD55.59±5.2528.22±5.4331.67±5.015.72±1.3111.59±4.63P-value0.010.000 010.000 10.000 30.000 220∶1Calcein-AM55.40±11.4023.16±4.8122.32±5.903.44±0.954.65±2.24CFSE/7-AAD61.14±7.6633.66±3.5237.30±2.409.69±2.5514.63±4.46P-value0.200.00 10.000 040.000 10.001

圖2 Calcein-AM 法釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

Note：1#，2#，3#，4# represent the leukemia blast isolated from 4 different leukemic patients at diagnosis.

3 討論

本文中，隨機(jī)健康獻(xiàn)血者外周血PBMC中NK細(xì)胞含量?jī)H有(11.76±3.55)%。其他針對(duì)不同地區(qū)中國(guó)人群外周血NK細(xì)胞含量的研究表明，隨機(jī)人群外周血PBMC中NK細(xì)胞含量?jī)H有(7.35～15.21)%[2-4]。本文對(duì)PBMC進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得純度較高的NK細(xì)胞群，既滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞數(shù)量的要求，也可避免大量采血，減少對(duì)患者的負(fù)擔(dān)。

Calcein-AM被用于真核細(xì)胞活力測(cè)定、細(xì)胞示蹤，近年有文獻(xiàn)報(bào)道將其用于細(xì)胞毒作用檢測(cè)，能夠替代51Cr釋放法，重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便且更加精確[5-7]。 Calcein-AM能夠透過(guò)細(xì)胞膜，在酯酶水解作用下產(chǎn)生Calcein并發(fā)出熒光。由于凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞，Calcein釋放，細(xì)胞群熒光強(qiáng)度減弱，MFI減低，因而能用于細(xì)胞毒作用的檢測(cè)。但Calcein-AM釋放法原理與51Cr釋放法相似，因此存在一些51Cr釋放法的缺陷。51Cr釋放法及Calcein-AM都是基于整體水平的檢測(cè)，無(wú)法檢出單細(xì)胞水平的殺傷。并且二者標(biāo)記細(xì)胞都依賴(lài)于細(xì)胞質(zhì)的作用，難以標(biāo)記一些細(xì)胞質(zhì)含量少的細(xì)胞，如Daudi細(xì)胞和Raji細(xì)胞，且從細(xì)胞死亡至標(biāo)記物從釋放有時(shí)間差[8]。前述因素導(dǎo)致了51Cr釋放法及Calcein-AM的適用范圍受到限制、靈敏度降低。

CFSE廣泛地用于細(xì)胞示蹤和細(xì)胞增殖研究，同時(shí)也用于細(xì)胞毒活性的測(cè)定[9-11]。CFSE能夠穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，在胞內(nèi)產(chǎn)生羧基熒光素分子，發(fā)出熒光。因此CFSE能夠非特異性地標(biāo)記整群活細(xì)胞，不需要依賴(lài)特異性抗原-抗體反應(yīng)，適用的靶細(xì)胞范圍廣，且在細(xì)胞中熒光維持時(shí)間長(zhǎng)、不易衰減。7-AAD是一種核酸染料，正常情況下，它不能通過(guò)正常細(xì)胞膜。隨著細(xì)胞凋亡、死亡，細(xì)胞膜對(duì)7-AAD的通透性逐漸增加，使之結(jié)合細(xì)胞凋亡中的DNA，在合適波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出明亮的紅色熒光。且7-AAD具有發(fā)射波譜較窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾小的特點(diǎn)，適于多色熒光分析。CFSE及7-AAD二者聯(lián)合使用，能夠在單細(xì)胞水平上檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的死亡率，實(shí)驗(yàn)靈敏度高，穩(wěn)定性好。

在兩種方法對(duì)靶細(xì)胞標(biāo)記上，Calcein-AM及CFSE均能非特異性地快速標(biāo)記靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記率高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，在FL-1通道上能顯著地與效應(yīng)細(xì)胞區(qū)分。在檢出NK細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)中，靶細(xì)胞死亡率隨著效靶比的增加而升高。但CFSE法檢出在不同效靶比、不同靶細(xì)胞的死亡率高于Calcein-AM釋放法。

在對(duì)K562細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，20∶1的效靶比下，Calcein-AM與CFSE法檢出的死亡率分別為(55.40±11.40)%和(61.14±7.66)%，CFSE法檢出率高于前者，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.20)；但在10∶1組中，二者檢出的死亡率則為(44.29± 9.18)%和(55.59±5.25)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，CFSE/7-AAD法較為敏感。

HLA Ⅰ 類(lèi)抗原與NK細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)分子相配位，共同調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。由于K562細(xì)胞缺乏與KIR相配位的HLA Ⅰ類(lèi)抗原表達(dá)[12,13]，KIR分子對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用完全被解除，NK細(xì)胞被激活。文獻(xiàn)報(bào)道從白血病患者體內(nèi)新分離的白血病原始細(xì)胞表面的HLA Ⅰ類(lèi)抗原選擇性下調(diào)[14,15]，NK細(xì)胞的抑制作用部分解除。因此NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用較強(qiáng)，而對(duì)白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞毒作用則受HLA Ⅰ類(lèi)抗原下調(diào)水平的影響，不同程度地減弱。本實(shí)驗(yàn)中，兩種方法所檢出的NK細(xì)胞對(duì)不同白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，均較K562弱。在檢測(cè)4株不同患者來(lái)源的白血病原始細(xì)胞中，CFSE法在10∶1和20∶1的效靶比下，檢出的靶細(xì)胞死亡率均高于Calcein-AM釋放法，各組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，詳見(jiàn)表2。但在細(xì)胞死亡率較低時(shí)，Calcein-AM釋放法的MFI變化微弱，不能準(zhǔn)確地計(jì)算出相對(duì)變化值，對(duì)靶細(xì)胞死亡率的計(jì)算不準(zhǔn)確。但CFSE法則可以通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞群中對(duì)CFSE+7/AAD+細(xì)胞進(jìn)行分析，直觀的呈現(xiàn)靶細(xì)胞死亡率，不依賴(lài)MFI變化。

以往研究者報(bào)道的靶細(xì)胞標(biāo)記方法，如：張嘉等[16,17]對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)標(biāo)記，借由EGFP在FL-1通道的熒光來(lái)區(qū)別靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞。但該法需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使靶細(xì)胞攜帶有EGFP基因，進(jìn)而表達(dá)熒光蛋白。此法延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期，對(duì)于新分離的白血病原始幼稚細(xì)胞而言，體外培養(yǎng)則可能引發(fā)表型改變，與患者體內(nèi)的白血病原始幼稚細(xì)胞存在差異。Ozdemir等[18]利用K562白血病原始幼稚細(xì)胞系表達(dá)CD33這一細(xì)胞表面抗原，使用抗CD33特異性熒光抗體對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而在CD33+細(xì)胞群中分析靶細(xì)胞死亡率。但對(duì)于一些不表達(dá)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞，抗體標(biāo)記法并不適用；且抗體標(biāo)記法的標(biāo)記強(qiáng)度取決于靶細(xì)胞表面抗原表達(dá)密度，標(biāo)記某些在細(xì)胞表面表達(dá)較少的特異性抗原時(shí)，則難以很好地標(biāo)記靶細(xì)胞。

綜上所述，本文比較了Calcein-AM釋放法及CFSE/7-AAD雙染色法，在不同效靶比分別對(duì)K562細(xì)胞株和不同患者來(lái)源的白血病原始細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩種染色方法均能對(duì)不同的靶細(xì)胞進(jìn)行有效標(biāo)記和區(qū)分；在較高的效靶比和較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用(如：對(duì)K562細(xì)胞)下，兩種方法對(duì)靶細(xì)胞死亡率檢出的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在細(xì)胞毒作用較弱的情況下，CFSE/7-AAD雙染法檢測(cè)白血病原始細(xì)胞的死亡率優(yōu)于Calcein-AM單染法，具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)。