多重微球流式熒光免疫技術(shù)檢測(cè)抗核抗體譜的評(píng)價(jià)與臨床應(yīng)用①

尚曉瑩 于 騰 孫桂榮 姚 遠(yuǎn) 張麗君 賀俠琴 劉明軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,青島266003)

抗核抗體(Antinuclear antibodies，ANA)的檢測(cè)對(duì)自身免疫病(Autoimmune disease，AID)的診斷、病情評(píng)估與治療監(jiān)測(cè)等具有重要的臨床價(jià)值。目前ANA的檢測(cè)方法主要為間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IIF)；抗核抗體譜的檢測(cè)方法主要為免疫印跡法(Immunoblot，IB)和ELISA法，均有自動(dòng)化程度低、僅為定性和半定量檢測(cè)等局限性。一些自身抗體(如抗dsDNA抗體、抗核小體抗體等)濃度的變化可以反映病情變化或藥物療效情況，而對(duì)這些自身抗體濃度變化的監(jiān)測(cè)需要采用定量檢測(cè)[1-3]。多重微球流式熒光免疫技術(shù)(Multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay， MBFFI，簡(jiǎn)稱：流式熒光免疫法)是一種以熒光編碼微球?yàn)楹诵模魇郊?xì)胞、激光分析、高速數(shù)字信號(hào)處理等多種技術(shù)于一體的多指標(biāo)并行分析技術(shù)平臺(tái)，可一次同時(shí)準(zhǔn)確定量檢測(cè)100種不同的生物分子；具有高通量、高靈敏度、高自動(dòng)化、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究是通過(guò)流式熒光免疫法檢測(cè)自身免疫病的抗核抗體譜，并與免疫印跡技術(shù)、IIF等傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比較，對(duì)流式熒光免疫法檢測(cè)抗核抗體譜的結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 2017年11月至2018年3月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院就診并臨床確診的自身免疫病患者的血清標(biāo)本共333例，同時(shí)選取排除自身免疫病的其他疾病患者血清44例(其他疾病組)和健康體檢者血清59例(對(duì)照組)。

1.1.2材料 流式熒光免疫法所用試劑及TESMI F3999全自動(dòng)加樣儀由上海透景生命科技有限公司提供，Luminex?200TM流式點(diǎn)陣儀為美國(guó)Luminex公司生產(chǎn)。免疫印跡法試劑及EUROBlotMasterⅡ免疫印跡儀購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司。間接免疫熒光法所用抗原基質(zhì)片(靶抗原為Hep-2細(xì)胞與猴肝組織)及試劑購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 受檢者空腹采靜脈血，離心分離血清，于當(dāng)天以免疫印跡法檢測(cè)抗核抗體譜及IIF法檢測(cè)ANA，另分裝一份-36℃冰箱保存，流式熒光免疫法檢測(cè)前復(fù)融至室溫。

1.2.2抗核抗體譜檢測(cè) 抗核抗體譜包括的項(xiàng)目有：抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)，抗著絲?？贵w(anti-Centromere),抗組蛋白抗體(anti-Histone),抗細(xì)胞漿組酰-tRNA合成酶抗體(anti-Jo-1)，抗核小體抗體(anti-nucleosome,anti-Nucl)，抗多肽復(fù)合體抗體(anti-PM-Scl),抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosomal P,anti-Rib-P),抗Robert抗原52抗體(anti-Ro52)，抗干燥綜合征A抗體(anti-SSA)，抗干燥綜合征B抗體(anti-SSB)，抗DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抗體(anti-Scl-70),抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)，抗核糖核蛋白抗體(anti-RNP),抗Smith抗體(anti-Sm)。流式熒光免疫法檢測(cè)步驟：血清加載在TESMI F3999全自動(dòng)加樣儀后進(jìn)行樣本處理，后進(jìn)入Luminex?200TM流式點(diǎn)陣儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理。dsDNA的Cut-off值為18 U/ml，其余指標(biāo)的Cut-off值為1 AI(AI=抗體指數(shù))。免疫印跡法檢測(cè)步驟：將膜條放入免疫印跡儀的溫育槽中，經(jīng)過(guò)5 min樣本緩沖液溫育后，加入1∶100稀釋的血清，室溫溫育30 min后清洗，再加入酶結(jié)合物，溫育30 min后清洗，加入底物液，溫育10 min后清洗，風(fēng)干后放置于掃描儀中，EUROLineScan軟件判讀陰陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3ANA檢測(cè) 采用間接免疫熒光法。血清1∶100 稀釋，滴加25 μl于抗原基質(zhì)片上，溫育30 min后清洗，再滴加25 μl FITC標(biāo)記的熒光二抗于抗原基質(zhì)片上，溫育30 min后清洗，封片，熒光顯微鏡下判讀陰陽(yáng)性結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩種檢測(cè)技術(shù)結(jié)果的一致性行Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≤0.4表明一致性差，0.4

2 結(jié)果

2.1流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測(cè)所有標(biāo)本的總體一致性比較 以MBFFI或IB法檢測(cè)抗核抗體譜的各指標(biāo)中有一項(xiàng)及以上為陽(yáng)性者，判為此標(biāo)本的抗核抗體檢測(cè)陽(yáng)性；各指標(biāo)均為陰性，判為此標(biāo)本的抗核抗體檢測(cè)陰性，并由此計(jì)算MBFFI或IB法檢測(cè)ANA的靈敏度、特異度[5-7]。用兩種方法對(duì)總共436例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的一致率為83.26%，Kappa值=0.655，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測(cè)各組各項(xiàng)目的一致性比較 病例組中各項(xiàng)目一致率在79.88%至99.40%之間，Kappa值在0.106至0.958之間，其中抗Centromere一致性最好(Kappa值=0.958)，抗Scl-70一致性最差(Kappa值=0.106)。對(duì)照組中各項(xiàng)目一致率在96.61%至100.00%之間，其他疾病組中各項(xiàng)目一致率在95.45%至100.00%之間。結(jié)果見(jiàn)表2、3。

2.3三種方法診斷自身免疫病的靈敏度、特異度比較 間接免疫熒光法的靈敏度最高，免疫印跡法、間接免疫熒光法分別與流式熒光免疫法比較，靈敏度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)。流式熒光免疫法的特異度最高，免疫印跡法、間接免疫熒光法分別與流式熒光免疫法比較，特異度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。流式熒光免疫法與間接免疫熒光法聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度比流式熒光免疫法單獨(dú)檢測(cè)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。免疫印跡法與間接免疫熒光法聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度比免疫印跡法單獨(dú)檢測(cè)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表4。流式熒光免疫法、免疫印跡法、流式熒光免疫法與間接免疫熒光法聯(lián)合檢測(cè)及免疫印跡法與間接免疫熒光法聯(lián)合檢測(cè)的約登指數(shù)分別為0.686、0.660、0.706及0.633。

表1所有標(biāo)本流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果(n)

Tab.1ResultsforallsamplesbyMBFFIandimmunoblot(n)

IBPositiveNegativeTotalMBFFIPositive22319242Negative54140194Total277159436

表2病例組流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測(cè)各項(xiàng)目比較

Tab.2ComparisonofresultsforeachitembyMBFFIandimmunoblotinAIDpatients

AntigenPositive rateMBFFIIBConcordance rateKappacoefficientAMA-M212.91%2.40%88.29%0.203Centromere7.51%8.11%99.40%0.958Histone22.52%13.21%79.88%0.324Jo-11.50%2.40%98.50%0.608Nucl11.41%16.52%92.49%0.689PM-Scl7.51%3.90%90.39%0.112Rib-P9.31%11.41%96.70%0.822Ro-5243.84%48.35%93.09%0.861SSA36.64%43.84%91.59%0.826SSB13.51%14.11%93.99%0.748Scl-7014.41%2.40%85.59%0.106dsDNA21.92%9.31%83.78%0.403RNP17.72%20.72%88.59%0.633Sm12.31%7.51%93.99%0.666

3 討論

抗核抗體檢測(cè)對(duì)AID的診斷、病情評(píng)估和療效監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值，多種抗核抗體檢測(cè)已列入AID的診斷標(biāo)準(zhǔn)或指南中[8-11]，如抗dsDNA抗體、抗Sm抗體已列入SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；抗SSA、SSB抗體已列入干燥綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。目前抗核抗體及抗核抗體譜的檢測(cè)方法：IIF、免疫印跡法和ELISA，均有一定的局限性。IIF因?yàn)閷?duì)核型和滴度的鑒定有主觀性，使得各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果很難取得一致性，且自動(dòng)化程度低，僅為定性檢測(cè)。免疫印跡法及ELISA主要用于特異性抗體的鑒定，但均為定性或半定量檢測(cè)且自動(dòng)化程度不高。流式熒光免疫法可彌補(bǔ)上述方法的不足，且可定量檢測(cè)特異性自身抗體，從而可評(píng)估某種特異性自身抗體對(duì)AID病情變化、療效監(jiān)測(cè)的價(jià)值。本研究中，流式熒光免疫法與免疫印跡法總體一致性一般。病例組中大部分項(xiàng)目?jī)煞N檢測(cè)方法的一致性較高(14項(xiàng)中9項(xiàng)的Kappa值在0.6以上，5項(xiàng)在0.7以上)。一致性最好的為抗Centromere，一致性最差的為抗Scl-70?？筍cl-70被認(rèn)為是系統(tǒng)性硬化病的標(biāo)記性抗體[12]。本研究沒(méi)有具體統(tǒng)計(jì)各病種的抗Scl-70陽(yáng)性率，可能系統(tǒng)性硬化病兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率差異大致相同，而其他自身免疫病的兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率差異較大導(dǎo)致的一致率差。AMA-M2是原發(fā)性膽汁性肝硬化的血清診斷標(biāo)志抗體，其一致性差的可能原因同抗Scl-70[13]?？筆M-Scl的一致性亦較差，可能兩種方法檢測(cè)此項(xiàng)的陽(yáng)性率均很低所致。對(duì)照組及其他疾病組兩種方法一致性很高且陽(yáng)性率很低。

表4流式熒光免疫法、免疫印跡法及間接免疫熒光法靈敏度、特異度比較

Tab.4ComparisonofsensitivityandspecificitybetweenMBFFI,IBandIIF

MethodsSensitivity(%)Specificity(%)IB79.61)86.42)MBFFI70.398.3IIF92.81)3)76.31)MBFFI+IIF94.31)76.31)IB+IIF95.53)67.83)

Note：Compared with MBFFI,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with IB,3)P<0.01.

表3對(duì)照組及其他疾病組流式熒光免疫法與免疫印跡法檢測(cè)各項(xiàng)目比較

Tab.3ComparisonofresultsforeachitembyMBFFIandimmunoblotincontrolsandotherdiseases

AntigenControlsPositive rateMBFFIIBConcordancerateOther diseasesPositive rateMBFFIIBConcordancerateAMA-M20.00%0.00%100.00%2.27%0.00%97.73%Centromere0.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%Histone0.00%1.69%98.31%4.55%0.00%95.45%Jo-10.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%Nucl0.00%0.00%100.00%0.00%0.00%100.00%PM-Scl0.00%3.39%96.61%0.00%0.00%100.00%Rib-P0.00%0.00%100.00%0.00%2.27%97.73%Ro-520.00%3.39%96.61%4.55%2.27%97.73%SSA0.00%0.00%100.00%2.27%2.27%95.45%SSB0.00%0.00%100.00%2.27%0.00%97.73%Scl-701.69%1.69%96.61%4.55%0.00%95.45%dsDNA0.00%0.00%100.00%4.55%0.00%95.45%RNP0.00%3.39%96.61%0.00%2.27%97.73%Sm0.00%1.69%98.31%0.00%0.00%100.00%

IIF檢測(cè)ANA的熒光核型具有一定的提示作用，但一種自身抗體可出現(xiàn)不同的熒光核型，不同的自身抗體也可出現(xiàn)相同的熒光核型，不能僅從熒光核型來(lái)推斷特異性自身抗體種類[3]。免疫印跡法所用的抗原必須是純化的抗原，才能保證被測(cè)定抗體的準(zhǔn)確性和特異性，但目前許多自身抗體的確切抗原不明確且不易被純化，僅有少部分抗原有純化的產(chǎn)品能用于特異性檢測(cè)[14]。專家共識(shí)建議：臨床應(yīng)用中可先用IIF法檢測(cè)ANA，若為陽(yáng)性，需進(jìn)一步檢測(cè)特異性自身抗體[3]。本研究顯示，流式熒光免疫法的診斷靈敏度雖然低于免疫印跡法與IIF法，但特異度高于后兩者，而IIF法檢測(cè)ANA的靈敏度高于其余兩方法。本研究中流式熒光免疫法與IIF法不一致的結(jié)果中5.88%為流式熒光免疫法陽(yáng)性且IIF法陰性，與Nifli等[7]的研究不一致，其為77.04%。原因是本研究所用流式熒光免疫法的試劑不再添加Hep-2抗原成分，Hep-2為IIF靶抗原，從而降低了靈敏度但提高了特異度。流式熒光免疫法與IIF法聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度比流式熒光免疫法單獨(dú)檢測(cè)高。這恰好提示：IIF檢測(cè)ANA作為初篩試驗(yàn)?zāi)壳叭允亲詈玫?，而流式熒光免疫法可替代免疫印跡法檢測(cè)ANA作為確認(rèn)試驗(yàn)。

綜上所述，流式熒光免疫法檢測(cè)抗核抗體譜與傳統(tǒng)的免疫印跡法相比，一致性尚可，特異度更高，與IIF組合應(yīng)用更符合臨床需求。且流式熒光免疫法自動(dòng)化程度更高，檢測(cè)速度更快，對(duì)某些特異性自身抗體可定量檢測(cè)從而監(jiān)測(cè)病情變化。流式熒光免疫法可替代免疫印跡法成為新一代的特異性自身抗體確認(rèn)試驗(yàn)檢測(cè)方法。