小鼠初級(jí)精母細(xì)胞GC-2 中TUBB4B 的表達(dá)及其對(duì)NF-κB 和MAPK信號(hào)通路的調(diào)控

劉桐佳，王萬(wàn)倫，張 婷，劉 爽，邊艷超，張傳領(lǐng)，肖 瑞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)1內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059

微管蛋白（TUBB4B）是β-tubulin的一種同型異構(gòu)體,微管蛋白家族成員之一［1］。微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的基礎(chǔ)成份，由α-tubulin和β-tubulin構(gòu)成異二聚體［2］。參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，分化，遷移，以及細(xì)胞凋亡等多個(gè)生命過(guò)程［3］。在雄性生殖領(lǐng)域已有研究表明，微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，參與了許多關(guān)鍵性的生精過(guò)程［4］；微管動(dòng)力學(xué)可能參與精子發(fā)生過(guò)程中精細(xì)胞的重塑、物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞器的極性分布［5］；圓形精子中微管蛋白首先在精子核的周圍負(fù)極，逐漸增加并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合形成manchette結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)分化形成長(zhǎng)型精子；隨著精子發(fā)生的進(jìn)行，α-tubulin和β-tubulin蛋白從中心體延伸形成精子尾部，并與鞭毛軸突的其他組成成份排列形成獨(dú)特的9+2結(jié)構(gòu)［6］；且在精子獲能過(guò)程中伴隨著微管蛋白(TUBB4B,TUBB1A)的氧化激活［7］；在這些精子發(fā)生與獲能的過(guò)程中微管蛋白扮演者重要的角色。

浦肯野細(xì)胞變性小鼠，由于Nna1基因突變導(dǎo)致，成年雄性小鼠因精原細(xì)胞與精子細(xì)胞細(xì)胞凋亡而引起精子數(shù)量顯著減少，同時(shí)出現(xiàn)精子頭部嚴(yán)重畸形與精子尾部粗細(xì)不均的發(fā)育異常的精子［8］。Nna1具有ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)，所編碼的蛋白質(zhì)C末端具有金屬羧肽酶結(jié)構(gòu)域因此也稱胞漿羧肽酶CCP-1（CCP1）［9］。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸中TUBB4B與CCP1相互作用，暗示TUBB4B可能在雄性不育和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中存在重要的作用［10］。并有最新研究報(bào)道TUBB4B作為關(guān)鍵因子，其表達(dá)缺失可造成精原細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞周期阻滯等現(xiàn)象［11］。

精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)性多階段的單向性的進(jìn)程，在此過(guò)程中涉及細(xì)胞分裂，分化，以及細(xì)胞間的相互作用［12］。而對(duì)于精子發(fā)生的調(diào)控作用不僅賴于各基因的有序表達(dá)，也依賴于各分子間的相互作用以及相應(yīng)信號(hào)通路的適時(shí)開(kāi)啟與關(guān)閉。就目前研究進(jìn)展來(lái)看，我們對(duì)于TUBB4B在雄性生殖細(xì)胞各細(xì)胞階段中所發(fā)揮調(diào)控機(jī)制還不明確。在整個(gè)生精過(guò)程中，初級(jí)精母細(xì)胞是開(kāi)啟減數(shù)分裂的關(guān)鍵，也是決定后續(xù)單倍體精子形成的重要細(xì)胞時(shí)段，初級(jí)精母細(xì)胞作為銜接精原細(xì)胞與精細(xì)胞之間的橋梁，同時(shí)也是精原細(xì)胞進(jìn)行定向分化的第一個(gè)細(xì)胞時(shí)段［13］。因此我們選擇初級(jí)精母細(xì)胞（GC-2）作為研究對(duì)象，進(jìn)一步探究TUBB4B對(duì)雄性生殖細(xì)胞的調(diào)控作用機(jī)制以及與漿羧肽酶CCP1之間的相互作用，來(lái)揭示其在雄性生殖系統(tǒng)中的重要功能。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)使用的初級(jí)精母細(xì)胞（GC-2）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（www.cellbank.org.cn）；DMEM、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、DMSO（Gibco）；總RNA提取試劑盒（#DP431,TIANGEN）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Takara）；DAPI（F6057,SIGMA）；Phosopho-NFkB p65（93H1），NF-kB p65，MAPK（ErK1/2），Phosopho-MAPK（ErK1/2），MAPK p38（Cell Signaling）；Anti-betaⅡTubulin（abcam），Anti-PolyE（AdipoGen），CCP1（proteintech）。TUBB4B，CCP1基因敲減和過(guò)表達(dá)所用慢病毒由吉?jiǎng)P基因構(gòu)建及包裝，慢病毒介導(dǎo)的siRNA目標(biāo)片序列為：TUBB4B-RNAi：gcGCATCAACGTG TACTACAA；陰性病毒CON313：gcTTCTCCGAACG TGTCACGT；CCP1-RNAi：gcGAGTTTCTTAGTTGC CAAA；陰性病毒CON077：gcTTCTCCGAACGT GT CACGT。慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表質(zhì)粒信息為：LV-TUB B4B，Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，陰性對(duì)照組病毒（CON335）；LV-CCP1，原件順序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，陰性對(duì)照組病毒（CON335）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GC-2 細(xì)胞培養(yǎng)需要用DMEM 高糖培養(yǎng)基（DMEM,Gibco Island,NY,USA）配制成含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco）的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37 ℃，5%CO2濕度下，每2～3 d傳代。

1.3 慢病毒感染

慢病毒感染，使用24 孔板每孔接種6×104GC-2細(xì)胞，并加入300 μL 2 mg/mL的感染增強(qiáng)液，輔助慢病毒感染，使用病毒量1.5 μl/孔：TUBB4B敲減陽(yáng)性組加入病毒：TUBB4B-RNAi，TUBB4B敲減陰性組加入病毒：陰性病毒CON313；TUBB4B過(guò)表達(dá)陽(yáng)性組加入病毒：LV-TUBB4B，TUBB4B過(guò)表達(dá)陰性組加入病毒：陰性對(duì)照組病毒（CON335），并補(bǔ)足1 mL完全培養(yǎng)基。12 h 后撤病毒。得到TUBB4B 基因敲減陽(yáng)性組（TUBB4B-KD），TUBB4B基因敲減陰性組（NC-KD）；TUBB4B基因過(guò)表達(dá)陽(yáng)性組（TUBB4B-OE），TUBB4B基因過(guò)表達(dá)陰性組（NC-OE）。并用含嘌呤霉素5 μg/mL的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)的GC-2細(xì)胞5～7 d。用熒光顯微鏡觀察感染后的細(xì)胞熒光。CCP1基因敲減組（CCP1-KD）與恢復(fù)表達(dá)組（CCP1-RE）的GC-2細(xì)胞為本課題組前期試驗(yàn)制備，以經(jīng)嘌呤霉素篩選并穩(wěn)定表達(dá)。

1.3 細(xì)胞免疫熒光

預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液1 mL，固定細(xì)胞20 min，1 mL PBS 潤(rùn)洗吸干。1 mL 0.5%TritonX-100（10 mL PBS+50 μL TritonX-100）（AMRESCO）透化10 min。1 mL PBS 潤(rùn)洗3 次，吸干。向載玻片中央滴加一抗Phosopho-NF-kB p65（稀釋濃1∶200），NF-kB p65（稀釋濃度1∶200）；37 ℃恒溫箱放置1 h；1 mL PBS潤(rùn)洗3次，吸干。滴加熒光二抗（CY3稀釋濃度1∶50）；室溫避光孵育30 min；1 mLPBS潤(rùn)洗3次后吸干。中央滴加DAPI染色液，蓋上蓋玻片，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞沉淀中加入1 mL/90 mm 培養(yǎng)皿的RZ 裂解液，用移液槍吹打混勻。放在冰盒中靜置3 min，使之充分裂解；高速離心4 ℃12 000 r/min 離心5 min；取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL無(wú)酶EP管中；依照天根總RNA提取試劑盒（TIANGEN）說(shuō)明書提取組織總RNA。使用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA濃度。以每2000 ng總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板依照TaKaRa定量PCR試劑盒（Takara）說(shuō)明書，配反應(yīng)體系后，將配置好的體系混勻，短暫離心后放入PCR儀中。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95℃5 s；60℃34 s，共40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)的TUBB4B（NM_146116），CCP1（NM_001048008），基因保守區(qū)域使用primer5軟件設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所用定量PCR引物（表1）。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequences used in this study

1.5 Western blot檢測(cè)

按照100 μL/90 mm培養(yǎng)皿的比例向細(xì)胞沉淀中加入RIPA細(xì)胞裂解液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑PMSF（按比RIPA∶PMSF=100∶5）提取總蛋白。蛋白定量后，取60 μg的蛋白用8%的分離膠70 V電泳，蛋白樣達(dá)到濃縮膠和分離膠交界時(shí)，電壓調(diào)為110 V電泳，電泳約1 h，終止電泳。將蛋白膠樣轉(zhuǎn)到NC膜、5%脫脂牛奶封閉室溫2 h，后孵育一抗：Phosopho-NF-kB p65；p38 MAPK Antibody；NF-kB p65（Cell Signaling），濃度按1∶1000，搖床4 ℃過(guò)夜；用1×TBST在搖床上搖洗10 min 3次；孵育相應(yīng)種屬的熒光二抗（熒光二抗；抗體稀釋液=1∶1000），室溫1 h；1×TBST 在搖床上搖洗10 min 3次；避光條件下置于Odessry CLX紅外激光成像系統(tǒng)（Licor）掃描并觀察結(jié)果。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖速率

按1×104/孔在96孔板接種，用培養(yǎng)基補(bǔ)足至100 μL，96孔板四周加入PBS，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h使細(xì)胞貼壁。分別在細(xì)胞接種后的6、12、24、48、72 h向相應(yīng)孔位中加入10 μL CCK Solution溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取出，開(kāi)蓋放置在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度A450nm，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期

90 mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%時(shí)（約8×106個(gè)細(xì)胞）去除舊培養(yǎng)基，1 mL PBS清洗細(xì)胞后，500 μL胰酶消化細(xì)胞離壁。后離心將細(xì)胞沉淀使用PBS清洗兩次后，棄廢液。用4 ℃預(yù)冷70%乙醇（無(wú)水乙醇7 mL+PBS 3 mL）緩慢加入細(xì)胞沉淀中，4 ℃過(guò)夜。將固定好的細(xì)胞1500 r/min離心5 min，棄上清。用1 mL的1×PBS清洗細(xì)胞3次，1500 r/min離心5 min，棄上清。加入50 μg/mL PI溶液、200 μg/mL RNase Staining Buffer溶液各500 μL重懸細(xì)胞，37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min。使用200 目的細(xì)胞篩網(wǎng)，將待測(cè)樣本篩入流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組樣本均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，qPCR結(jié)果通過(guò)2-△△Ct[ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），相對(duì)表達(dá)=2-ΔΔCt]方法統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用GraphPad Prism 5進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 GC-2細(xì)胞中TUBB4B與CCP1互相調(diào)控表達(dá)

慢病毒感染后GC-2細(xì)胞帶綠色熒光，慢病毒成功感染GC-2細(xì)胞（圖1A）。TUBB4B-KD與NC-KD相比mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯降低(mRNA表達(dá)量降低近58 倍，P＜0.0001，圖1B、D)；TUBB4B-OE 與NCOE相比mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高（mRNA表達(dá)量升高2倍，P＜0.05，圖1C、E）。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR及Western blot發(fā)現(xiàn)TUBB4B沉默后CPP1表達(dá)量降低（TUBB4B:P＜0.0001，CCP-1:P＜0.05，圖1F、I)；TUBB4B過(guò)表達(dá)后與CCP1表達(dá)升高（TUBB4B:P＜0.05，CCP-1:P＜0.0001，圖1G、J）；CCP1沉默（P＜0.0001）和恢復(fù)過(guò)表達(dá)（0.05＞P＞0.0001），TUBB4B表達(dá)也隨之降低（P＜0.05）與升高（P＜0.05，圖1H、K）；CCP1沉默后在TUBB4B表達(dá)降低的同時(shí)聚谷氨?；疨olyE表達(dá)水平升高，且當(dāng)CCP1表達(dá)量升高后在TUBB4B表達(dá)升高的同時(shí)聚谷氨酰化PolyE表達(dá)水平降低（圖1K）。

圖1 檢驗(yàn)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系并驗(yàn)證TUBB4B與CCP1之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系及相互作用Fig.1 Examination of the constructed stable cell lines and verification of the regulatory relationship and interaction between TUBB4B and CCP1.A: Fluorescence microscopy of GC2 cells infected with lentivirus (Original magnification: ×40).B,C:Western blotting results after TUBB4B silencing and overexpression.D,E: RT-qPCR results of TUBB4B mRNA expression after TUBB4B silencing and overexpression.F-K: Mutual regulatory relationship between TUBB4B and CCP1.I-K:CCP1-mediated polyglutamylated PolyE modification on TUBB4B.*P＜0.05,**P＜0.01,***P ＜0.0001,n=3.

2.2 TUBB4B敲減和過(guò)表達(dá)對(duì)初級(jí)精母細(xì)胞周期沒(méi)有明顯的影響

記錄不同時(shí)段TUBB4B沉默與過(guò)表達(dá)陽(yáng)性試驗(yàn)組與其陰性對(duì)照組的細(xì)胞CCK8熒光值即細(xì)胞數(shù)目，繪制相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)TUBB4B沉默和過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的累計(jì)增長(zhǎng)量無(wú)明顯差別（圖2A、B）；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TUBB4B沉默與過(guò)表達(dá)后與其陰性對(duì)照做相比各細(xì)胞周期未出現(xiàn)明顯的改變（圖2 C～H）。

圖2 探究TUBB4B沉默和過(guò)表達(dá)后其增殖與周期的改變Fig.2 Changes in proliferation and cell cycle of GC2 cells with TUBB4B silencing and overexpression.A,B:Cell proliferation rate did not change significantly after TUBB4B silencing or overexpression.C,D:Flow cytometry for analyzing cell cycle in GC2 cells with TUBB4B silencing.E: Cell cycle analysis of the cells with TUBB4B silencing.F,G:Flow cytometry for analyzing cell cycle ofGC2 cells with TUBB4B overexpression.H:Cell cycle analysis of GC2 cells with TUBB4B overexpression.***P＜0.0001,n=3.

2.3 在初級(jí)精母細(xì)胞中TUBB4B調(diào)控MAPK信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路

Western blot檢測(cè)TUBB4B沉默后NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子p-p65 表達(dá)無(wú)明顯改變，p65 表達(dá)明顯降（圖3A）；MAPK信號(hào)通路相關(guān)因子ErK1/2，p38表達(dá)無(wú)明顯變化，而p-ErK1/2表達(dá)明顯升高；當(dāng)TUBB4B表達(dá)量升高后p65，p-p65 明顯升高，p-ErK1/2 明顯降低，ErK1/2 與p38 表達(dá)無(wú)明顯改變（圖3B）；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TUBB4B表達(dá)量改變后發(fā)生變化的相應(yīng)通路因子在細(xì)胞水平定位，發(fā)現(xiàn)在核內(nèi)與胞質(zhì)均有表達(dá)（圖3D～F）；CCP1沉默和恢復(fù)表達(dá)后僅ErK1/2發(fā)生表達(dá)量相應(yīng)的升高與降低（圖3C）。

圖3 TUBB4B調(diào)控MAPK信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路Fig.3 TUBB4B regulates MAPK and NF-κB signaling pathways.A:TUBB4B knockdown decreases p65 expression and increases p-ErK1/2 expression.B: TUBB4B overexpression increases p65 and p-p65 expressions and decreases p-ErK1/2 expression.C:The expression of ErK1/2 was significantly increased after CCP1 silencing,and ErK1/2 was restored with CCP1 expression D,E,F: All the pathway factors were expressed in the nucleus and cytoplasm(×40).

3 討論

微管作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基本骨架之一，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞器定位、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞遷移等基本細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［14］。形成微管的主要蛋白為α,β-微管蛋白，大多數(shù)真核生物具有多種微管蛋白亞型，但它們?cè)诩?xì)胞骨架中的作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步深入研究［15］。已有研究報(bào)道微管蛋白的表達(dá)與化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變與多種疾病的病理生理狀態(tài)密切相關(guān)［1,16-18］；在精子發(fā)生中，微管蛋白與精子運(yùn)動(dòng)，獲能、精子與卵子結(jié)合等方面具有重要作用［4-7］；正常條件下，精子特征的8 字形尾鞭結(jié)構(gòu)和漸進(jìn)式的運(yùn)動(dòng)方式，會(huì)阻止精子與上皮細(xì)胞的結(jié)合，而精子獲能的過(guò)程中通常伴隨著精子過(guò)度激活的運(yùn)動(dòng)模式的改變：肌動(dòng)蛋白聚合（CAPZB）和微管蛋白過(guò)度活化（TUBB4B,TUB1A），這種改變?yōu)榫优c卵

子的結(jié)合提供了重要的條件［19］。微管蛋白的表達(dá)以及其在不同類型細(xì)胞或者細(xì)胞發(fā)育階段中發(fā)揮的作用可能不同。有最新研究發(fā)現(xiàn)，在精原細(xì)胞中TUBB4B的缺失會(huì)引起細(xì)胞增殖速率的減慢，細(xì)胞G1期明顯阻滯，G1/0期細(xì)胞群體增加，S期細(xì)胞群體顯著減少［11］。精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)性多階段的單向性的進(jìn)程，精原細(xì)胞經(jīng)歷多次有絲分裂后一部分細(xì)胞進(jìn)行定向分化成為初級(jí)精母細(xì)胞，生精過(guò)程中，初級(jí)精母細(xì)胞是開(kāi)啟減數(shù)分裂的關(guān)鍵，也是決定后續(xù)單倍體精子形成的重要細(xì)胞時(shí)段［13,14］。TUBB4B在初級(jí)精母細(xì)胞中的關(guān)鍵作用還未有相關(guān)研究報(bào)道。在我們前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TUBB4B在小鼠睪丸中廣泛表達(dá)［11］，而本次研究結(jié)果顯示TUBB4B在初級(jí)精母細(xì)胞GC-2中表達(dá)且該基因缺失后對(duì)細(xì)胞存活，形態(tài)及細(xì)胞增殖周期無(wú)明顯影響。該結(jié)果與在精原細(xì)胞中的的研究結(jié)果有所不同［22］。提示TUBB4B在雄性生殖細(xì)胞不同發(fā)育進(jìn)程中所發(fā)揮的功能不同。

CCP1作為生精過(guò)程中的重要因子，在生精細(xì)胞的多時(shí)期普遍表達(dá)，參與整個(gè)生精活動(dòng)。CCP1缺失的浦肯野細(xì)胞變性小鼠精子數(shù)量減少且形態(tài)發(fā)育異常［8］。研究發(fā)現(xiàn)該基因缺失會(huì)引起生精細(xì)胞發(fā)育阻滯在初級(jí)精母細(xì)胞的粗線期。TUBB4B作為潛在的CCP1作用底物［20,21］，提示二者在生精過(guò)程中具有重要作用。根據(jù)我們的研究發(fā)現(xiàn)，兩者在初級(jí)精母細(xì)胞GC2中存在正向的相互表達(dá)調(diào)控關(guān)系，且CCP1對(duì)TUBB4B具有去谷氨?；揎椬饔谩Ｒ延醒芯堪l(fā)現(xiàn)，在精子細(xì)胞中微管蛋白各亞型的谷氨?；姆g后修飾，與微管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相關(guān)；在黑腹果蠅大腦和睪丸中谷氨?；摩梁挺挛⒐艿鞍状罅勘磉_(dá)，且在精子鞭毛中也存在大量的這種翻譯后修飾現(xiàn)象［22］；TTLL介導(dǎo)的α-微管蛋白聚谷氨?；緩绞蔷映墒旌瓦\(yùn)動(dòng)所必需的，并且與男性生育能力密切相關(guān)［23］；以上結(jié)果說(shuō)明了谷氨酰化對(duì)維持微管蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用［24］。但在此次研究中CCP1 對(duì)TUBB4B的表達(dá)和修飾雖然具有調(diào)控作用，但其表達(dá)和修飾的變化并未引起初級(jí)精母細(xì)胞增殖異常，因此其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

已知NF-κB和MAPK信號(hào)通路對(duì)于精子發(fā)生具有重要調(diào)控作用［25-29］，且有研究發(fā)現(xiàn)CCP1會(huì)影NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)以及微管蛋白的谷氨酰胺化修飾從而引起浦肯野細(xì)胞發(fā)育異常［8,21,30］。TUBB4B的缺失在精原細(xì)胞中會(huì)引起增殖的抑制以及細(xì)胞周期的阻滯現(xiàn)象。但在本研究中TUBB4B的敲減并未引起初級(jí)精母細(xì)胞GC2增殖與周期的改變。為了探究這一現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)制，我們對(duì)NF-κB和MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵因子進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GC2細(xì)胞中，TUBB4B的敲減會(huì)引起p65表達(dá)量的明顯降低，抑制NF-κB信號(hào)通路；反之P-ErK1/2表達(dá)明顯升高，MAPK信號(hào)通路被激活。NF-κB信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路的相互代償作用可能是TUBB4B敲減后初級(jí)精母細(xì)胞增殖分裂未受影響的關(guān)鍵。

綜上所述，在初級(jí)精母細(xì)胞GC-2細(xì)胞中TUBB4B與CCP1表達(dá)相互調(diào)控，且CCP1對(duì)TUBB4B具有去谷氨酰化修飾作用，TUBB4B調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)通路，在生精過(guò)程中尤其是初級(jí)精母細(xì)胞階段具有重要作用。