抑郁樣小鼠額葉體積的減少與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的下降有關(guān)

崔維維，龔莉雅，陳純輝，唐佳渝，金 欣，李紫欣，靖林林，文 戈

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院影像中心，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；4南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院手術(shù)室，廣東 廣州 510315

抑郁癥是一種高病發(fā)率、高自殺率和高復(fù)發(fā)率的異質(zhì)性疾?。?］。盡管已有數(shù)十年的基礎(chǔ)科學(xué)、臨床神經(jīng)科學(xué)和精神病學(xué)研究，但人們對(duì)抑郁癥的內(nèi)在發(fā)病機(jī)制仍然不明確?；隗w素的形態(tài)學(xué)方法（VBM）是目前常用的無創(chuàng)分析活體大腦解剖學(xué)的方法之一，多項(xiàng)抑郁癥患者VBM 分析研究結(jié)果表明，額葉、海馬與杏仁核等邊緣系統(tǒng)的腦區(qū)體積在抑郁癥患者中明顯下降［2-5］，但對(duì)于抑郁癥患者VBM分析結(jié)果的內(nèi)在機(jī)制的研究仍然不夠清楚。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是中樞神經(jīng)分布最廣泛的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，尤其對(duì)于神經(jīng)元成熟，突觸形成和突觸可塑性至關(guān)重要［7,8］。BDNF 在前額葉、海馬與杏仁核等邊緣系統(tǒng)中高表達(dá)［9］，這些腦區(qū)都與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān)。有研究表明抑郁癥患者血漿BDNF 水平與抑郁癥的嚴(yán)重程度存在負(fù)相關(guān)［9-12］，此外，額葉內(nèi)BDNF 的表達(dá)下降在壓力引起的抑郁中發(fā)揮重要的作用［13,14］，因此猜想額葉內(nèi)BDNF 表達(dá)異常可能與抑郁癥VBM 結(jié)果改變有關(guān)。

由于抑郁癥患者VBM 分析結(jié)果的差異腦區(qū)內(nèi)分子水平難以檢測(cè)，而慢性不可預(yù)知溫和刺激(CUMS)造模小鼠是一種較為理想和可靠的抑郁動(dòng)物模型，造模后探索能力顯著下降、興趣喪失、行為絕望以及快感缺乏與抑郁癥臨床表現(xiàn)中的精神運(yùn)動(dòng)性阻抑癥狀極為相似［6］。因此，本研究擬通過CUMS 造模小鼠檢測(cè)腦區(qū)組織內(nèi)的BDNF 水平，探究抑郁癥VBM 分析結(jié)果與相應(yīng)腦區(qū)內(nèi)BDNF 表達(dá)水平的內(nèi)在關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只6 周齡雄性C57 小鼠購(gòu)買自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心信息管理平臺(tái)。

C57 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與抑郁造模組，12只/組，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本研究已通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（編號(hào)：IACUC-LAC-20220920-002）。

1.2 CUMS 抑郁造模

抑郁造模組小鼠被隨機(jī)每天給予以下刺激：剝奪水24 h、剝奪食物24 h、禁錮4～6 h和強(qiáng)迫在冷水（8～10 ℃）中游泳10 min，連續(xù)刺激5 周。正常對(duì)照組不接受任何處理。在造模過程中，造模組小鼠死亡2只，剩余10只。

1.3 行為學(xué)測(cè)試

1.3.1 礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 在測(cè)試前的3 d里，讓小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)者撫摸小鼠。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，用75%的酒精擦拭礦場(chǎng)盒子。礦場(chǎng)盒子是一個(gè)長(zhǎng)30 cm、寬30 cm、深35 cm 的方形盒子。每只小鼠被放入盒子后，使用EthoVision 軟件（7.0 版;Noldus，瓦赫寧根）檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 透明的玻璃容器中裝滿大約35 cm深的水，溫度為28 ℃。在實(shí)驗(yàn)前3 d，老鼠被允許游泳1次/d，以熟悉環(huán)境和實(shí)驗(yàn)者。實(shí)驗(yàn)中，將小鼠輕輕放入容器中，讓其游5 min，記錄不動(dòng)時(shí)間，小鼠的不動(dòng)狀態(tài)是放棄掙扎，只保持頭部露出水面。

1.4 小動(dòng)物磁共振

1.4.1 小動(dòng)物磁共振掃描 磁共振設(shè)備是南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室7.0 T 小動(dòng)物磁共振掃描儀（PharmScan,Bruker）。在正式掃描之前，先將小鼠放在含有5%異氟烷的麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)，待小鼠腳趾收縮反應(yīng)消失，對(duì)光反射遲鈍后將小鼠固定轉(zhuǎn)移至掃描床，連接呼吸機(jī)用2.5%異氟烷維持麻醉狀態(tài)，用37 ℃的加熱墊對(duì)小鼠腹部保溫。壓力傳感器（SAII Instruments,Model1030 Monitoring&Gating System）可在掃描過程中檢測(cè)小鼠的呼吸頻率、心率與體溫，待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，即可進(jìn)行掃描。用三維T2 加權(quán)成像快速采集弛豫增強(qiáng)序列（RARE）獲取結(jié)構(gòu)像，參數(shù)如下：重復(fù)時(shí)間（TR）=1800 ms，回波時(shí)間（TE）=45 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，采樣矩陣=256×256，體素大小=0.078 mm×0.078 mm×0.512 mm，32 層，層厚/間隔=0.512/0 mm。在采集圖像過程中由于2 只小鼠麻醉不穩(wěn)定，掃描圖像質(zhì)量差而未納入統(tǒng)計(jì)（對(duì)照組：n=12；CUMS模型組：n=8）。

1.4.2 小動(dòng)物磁共振圖像分析 將DICOM 格式的圖像轉(zhuǎn)換為NIFTI 格式，采用ITKSNAP 與MATLAB（MathWorks,Natick,MA）軟件，即自動(dòng)與手動(dòng)相結(jié)合的方式剝掉小鼠腦部頭皮。使用SPM8 軟件（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm8/）和MATLAB 軟件進(jìn)行VBM 分析，其預(yù)處理的大致流程如下：首先，每個(gè)T2 加權(quán)圖像被調(diào)整了10 倍大小，將調(diào)整大小的t2加權(quán)圖像對(duì)齊到C57Bl/6 圖譜的小鼠大腦解剖模板上；其次，根據(jù)組織概率圖，將結(jié)構(gòu)像分割成灰質(zhì)、白質(zhì)與腦脊液3部分，然后將灰質(zhì)部分的圖像空間歸一化到模板［15］。第三，通過Jacobian 調(diào)制歸一化信號(hào)強(qiáng)度；最后，使用8 mm FWHM 高斯核對(duì)得到的圖像進(jìn)行平滑處理，平滑后的圖像即可用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)。具體流程（圖1）。VBM 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析使用的是SPM8 軟件，大致流程包括統(tǒng)計(jì)建模、模型評(píng)估、設(shè)計(jì)Contrasts，兩組之間采用雙樣本T檢驗(yàn)，得到差異腦區(qū)（P＜0.001，當(dāng)團(tuán)塊水平大于等于10 756 時(shí)，過P=0.05的FDRc矯正）。

圖1 VBM 分析流程圖Fig.1 Flowchart of voxel-based morphometry(VBM)analysis.

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

麻醉小鼠灌注PBS，根據(jù)小鼠腦圖譜分離額葉皮質(zhì)腦組織。然后以100μL/mg 的比例向組織中加入WB裂解液（Beyotime,P0013）。渦旋（60 Hz，60 s）和離心（12 000×g，4 ℃，15 min）后，使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime Biotechnology,P0009）定量蛋白裂解物。各取30 μg 樣品經(jīng)過十烷基硫酸酯聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，25 ℃下用5%BSA 阻斷2 h。一抗（1∶5000 dilution;Abcam;ab108319）4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h。結(jié)果通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行可視化（GE 醫(yī)療生物科學(xué)）。使用Imaging J軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

麻醉小鼠前后分別灌注PBS與多聚甲醛，取出小鼠腦組織固定，脫水后，OCT 包埋，切片機(jī)切成20 μm厚的切片。PBS洗3遍，山羊血清封閉0.5 h，一抗（1∶500 dilution;Abcam）4 ℃孵育過夜，PBST 洗3遍，二抗常溫避光孵育1 h，PBS 洗3遍常溫孵育DAPI 5 min，封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism8 軟件對(duì)行為學(xué)及蛋白定量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照組與造模組之間比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUMS 造模小鼠的抑郁行為

在礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，CUMS 造模后的小鼠在礦場(chǎng)運(yùn)動(dòng)的總距離差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2A、C），但在礦場(chǎng)中央的運(yùn)動(dòng)距離下降（P＜0.05，圖2B、C），相比對(duì)照小鼠，CUMS造模小鼠自發(fā)活動(dòng)變化不明顯，但小鼠對(duì)中央?yún)^(qū)域的探索行為明顯下降。造模后的小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間增加（P＜0.05，圖2D）。經(jīng)過5周的CUMS，小鼠表現(xiàn)出探索行為的下降與行為絕望的增加。

圖2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A、B、C)礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(D)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)Fig.2 Behavioral test results of the mice in the control group(n=12)and chronic unpredictable mild stimulation(CUMS)group(n=10).A:Total walking distances in open-field test.B:Central walking distances in open-field test.C:Diagram in open field test,and red frame indicates the central area.D:Immobile time in forced swimming test.*P＜0.05 vs control.

2.2 CUMS 抑郁小鼠額葉灰質(zhì)體積的下降

采集造模組與對(duì)照組小鼠的磁共振圖像，通過VBM 分析方法，分析對(duì)照組與CUMS組的小鼠全腦灰質(zhì)體積，結(jié)果顯示CUMS 組小鼠的額葉皮質(zhì)（FC）體積明顯下降（P＜0.001，當(dāng)團(tuán)塊水平大于等于10 756 時(shí)，過P=0.05 的FDRc 矯正，圖3）。

圖3 VBM 分析結(jié)果Fig.3 Results of VBM analysis.The map shows clusters of decreased (red) volumes in the CUMS model group compared to the control group(Control:n=12;CUMS:n=8).P＜0.001,when the mass level was greater than or equal to 10 756,the FDRc was corrected with P=0.05.

2.3 CUMS 抑郁小鼠額葉皮質(zhì)體積的下降與額葉內(nèi)BDNF 表達(dá)下降有關(guān)

在所有測(cè)試的樣本中，分別檢測(cè)到14 和28 000 BDNF 免疫反應(yīng)條帶，分別代表前體BDNF（pBDNF）和成熟BDNF（mBDNF）。與對(duì)照組相比，CUMS 造模組小鼠成熟形式的BDNF 蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05，圖4A、B），前體形式的BDNF 在對(duì)照組與造模組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖4A、C）。為進(jìn)一步驗(yàn)證mBDNF 在造模組表達(dá)下降的這一趨勢(shì)，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，額葉皮質(zhì)內(nèi)的mBDNF熒光強(qiáng)度在造模組較對(duì)照組也成下降趨勢(shì)（圖4E）。將VBM 分析得到的差異團(tuán)塊的體積大小與蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中成熟BDNF 表達(dá)水平做相關(guān)分析，結(jié)果顯示，VBM 分析得到的差異團(tuán)塊的體積大小與成熟BDNF 表達(dá)水平正相關(guān)（圖4D）。

圖4 CUMS 與正常對(duì)照組BDNF 表達(dá)水平Fig.4 Expression level of BDNF in the frontal cortex in CUMS and control groups.A-C: Western blotting of BDNF expression in the frontal cortex in the control(n=6)and CUMS(n=6)groups.D:Relationship between the relative expression of mBDNF and cluster volume in the control (n=6) and CUMS (n=6) groups.E:Immunofluorescence of BDNF in the frontal cortex of the mice(Original magnification:×200).*P＜0.05.

3 討論

礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)行為與探索行為，小鼠對(duì)空曠的場(chǎng)地具有畏懼感，并偏好躲在角落，因此小鼠逃避往空曠場(chǎng)地的中心移動(dòng)，但又存在對(duì)中央?yún)^(qū)域的好奇而驅(qū)使其探索，故礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可對(duì)小鼠的探索行為進(jìn)行評(píng)估，其在礦場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的總距離反映了小鼠的自發(fā)活動(dòng)，中央距離則反映小鼠的探索行為，是抑郁行為的表現(xiàn)。本文利用CUMS 造模，在不影響礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的總距離的前提下，造模小鼠在中央的運(yùn)動(dòng)距離明顯下降，表明造模小鼠出現(xiàn)了探索行為的減少。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，我們給小鼠營(yíng)造了一種無法逃離的強(qiáng)迫環(huán)境，小鼠會(huì)試圖逃脫，反復(fù)失敗后會(huì)保持靜止，陷入行為絕望，而抑郁小鼠的行為絕望持續(xù)時(shí)間會(huì)更久。造模后在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中小鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯增加，這表明小鼠行為絕望的增加，同樣是抑郁行為的表現(xiàn)。

在一項(xiàng)抑郁癥患者的磁共振研究中，經(jīng)VBM 發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者前額葉體積較正常健康對(duì)照明顯下降［3］，為了探究抑郁小鼠同抑郁癥患者灰質(zhì)腦體積的變化是否具有一致性，我們同樣采用了在活體上能無創(chuàng)對(duì)小鼠灰質(zhì)體積進(jìn)行分析的方法-VBM，分析結(jié)果顯示CUMS造模的抑郁小鼠較正常組小鼠的額葉皮質(zhì)體積明顯下降，這種結(jié)果與抑郁癥患者的VBM分析結(jié)果相一致［3,4］，進(jìn)一步驗(yàn)證了額葉在抑郁癥發(fā)病中起到的作用。

BDNF 與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展和治療有關(guān)，是目前抑郁癥相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域研究最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［16］，抑郁癥發(fā)病的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說也被提出。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑郁小鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)成熟的BDNF 蛋白表達(dá)水平下降，并且免疫熒光實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)，這表明了BDNF 的降低可能是抑郁小鼠額葉皮質(zhì)體積下降的重要原因。有研究中指出血清BDNF 在抑郁癥患者前額葉體積下降的可能作用［3］，而本實(shí)驗(yàn)首次證明了抑郁樣小鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)部BDNF 表達(dá)水平的降低與額葉皮質(zhì)體積下降是存在相關(guān)的。

BDNF 在大腦中是非常重要的營(yíng)養(yǎng)蛋白，主要在神經(jīng)元中合成，并在神經(jīng)元發(fā)育、突觸可塑性和精神疾病的病理和治療中起著重要的作用［17-20］。額葉皮質(zhì)是抑郁癥發(fā)病發(fā)展中持續(xù)受損的腦區(qū)之一［21］，BDNF 是神經(jīng)元生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，額葉內(nèi)神經(jīng)元萎縮在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中十分關(guān)鍵［22-25］。本研究發(fā)現(xiàn)額葉體積在抑郁小鼠中出現(xiàn)下降，并且額葉體積的大小與BDNF 在額葉內(nèi)的表達(dá)水平存在正相關(guān)。因此，推測(cè)BDNF 表達(dá)不足導(dǎo)致額葉內(nèi)神經(jīng)元的萎縮進(jìn)而引起了抑郁小鼠額葉灰質(zhì)體積的下降，這可能是BDNF 表達(dá)水平的下降與額葉灰質(zhì)體積下降存在相關(guān)的內(nèi)在原因。

本文首次將CUMS 抑郁小鼠額葉皮質(zhì)體積的下降的機(jī)制與額葉內(nèi)BDNF 表達(dá)下降聯(lián)系起來，壓力造模后BDNF 表達(dá)下降引起的額葉皮質(zhì)異常的結(jié)構(gòu)可能參與了抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。但本研究?jī)H觀察了額葉內(nèi)BDNF 表達(dá)水平的下降，對(duì)于其它腦區(qū)內(nèi)BDNF 的水平是否也有改變沒有驗(yàn)證，并且對(duì)于BDNF 是否是通過影響了神經(jīng)元的生長(zhǎng)進(jìn)而引起額葉皮質(zhì)的萎縮，仍需進(jìn)一步探索。