基于全二維氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜高通量檢測(cè)獨(dú)活揮發(fā)油化學(xué)成分

錢沉魚(yú)，陳嘯天，肖 雪，周雪倩，王玉梅，向章敏*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070）

獨(dú)活屬于傘形科當(dāng)歸屬，是當(dāng)歸的干燥根［1］，在中國(guó)藥典中被列為治療風(fēng)濕病的止痛藥和類似藥物，并用作不同中藥處方的重要組成部分［2-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，獨(dú)活具有較好的生物及生理活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等［4-6］。此外，從中藥植物中提取分離出的揮發(fā)油成分，具有預(yù)防和治療人類各種疾病的功效［7-10］。然而，中藥揮發(fā)油是非常復(fù)雜的天然產(chǎn)物，由成百上千種成分組成。常規(guī)的一維氣相色譜儀（One-dimensional gas chromatography，1-DGC）在化學(xué)分析領(lǐng)域通常作為分離和分析的有效工具之一［11-13］，但是，1-DGC 通常難以成功分離復(fù)雜基質(zhì)中的多種化學(xué)組成，即使色譜柱容量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于容納所有樣品組分所需的峰容量，也經(jīng)常發(fā)生峰共流出、雜峰干擾、分離度不夠等現(xiàn)象［14］。全二維氣相色譜（Comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）與1-DGC相比具有更高的色譜分離度和峰容量，成為分離天然植物揮發(fā)油復(fù)雜成分的有效手段之一［15-16］。目前，GC×GC 已成功用于各種植物揮發(fā)油的化學(xué)成分分析，如玫瑰木（Aniba rosaeodora）、薰衣草（Lavandula Linn.）、香料（Piper regnellii）等植物揮發(fā)油［17-19］，與1-DGC 相比，通過(guò)GC×GC 方法鑒定出的化合物更多、更詳細(xì)、更準(zhǔn)確。

本文基于全二維氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC-QTOF MS）對(duì)獨(dú)活揮發(fā)油成分進(jìn)行高通量檢測(cè)，通過(guò)匹配因子、保留指數(shù)（RI）和高分辨精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性分析，共鑒定了207 種化學(xué)成分，是目前為止分析獨(dú)活揮發(fā)油化學(xué)成分最多的方法，為挖掘其更多、更有用的藥用價(jià)值及綜合利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7250 氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司），配置SSM1800 固態(tài)熱調(diào)制器（雪景電子科技有限公司）和PAL RSI120三合一自動(dòng)進(jìn)樣器（瑞士CTC公司）；FW80研磨儀（天津泰斯特公司）；ND100-1 氮吹儀（杭州瑞誠(chéng)公司）；AL-104 電子天平（美國(guó)Mettler-Toledo 公司）；ZNHW-Ⅱ電熱套（鞏義予華儀器有限公司）以及其他常用玻璃儀器。

甲醇、正己烷（色譜純，美國(guó)Merck 公司）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，廣州化工廠）；超純水（自制）；正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C25，純度≥99.5%）、十六酸甲酯（純度＞98.5%）、苯乙醛（純度＞90%）均購(gòu)于Sigma-Aldrich Fluka 公司；α-蒎烯（純度≥99.0%）、α-松油醇（純度≥98%）均購(gòu)于Aladdin 公司；β-法尼烯（純度≥95%，Herbest公司）。

1.2 儀器分析條件

氣相色譜條件：色譜柱組合為HP-5 MS（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm）以及DB-17 MS（50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷，1.0 m × 0.18 mm × 0.18 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；進(jìn)樣量為0.5 μL；分流比為20∶1；升溫程序如下：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至250 ℃并保持1 min；載氣為氦氣，恒流模式且保持流速為1.0 mL/min。

調(diào)制器條件：冷區(qū)溫度為-50 ℃，進(jìn)入熱區(qū)和離開(kāi)熱區(qū)的溫度相對(duì)于柱溫為分別偏差+ 30 ℃和+120 ℃，兩個(gè)熱區(qū)的上限溫度均為320 ℃；調(diào)制周期為4 s。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，電離能量為70 eV；離子源溫度為200 ℃；四極桿溫度為150 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為m/z45～500；采集速率為50 Hz。

1.3 前處理方法

本文采用常規(guī)水蒸氣蒸餾提取法［20］。將獨(dú)活研磨成粉狀過(guò)60 目篩后，稱取30.000 g 粉末置于1 000 mL水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾瓶中，并加入350 mL水和50 g NaCl，接上冷凝裝置，加熱至沸騰后開(kāi)始計(jì)時(shí)3 h。樣品提取完畢后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，轉(zhuǎn)移至2 mL色譜瓶中待測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

化合物定性鑒定通過(guò)與NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（NIST/EPA/NIH 2017）進(jìn)行匹配，選擇正、反匹配因子均高于750 的化合物，同時(shí)使用保留指數(shù)和精確質(zhì)量數(shù)對(duì)化合物作進(jìn)一步確認(rèn)［21-22］。根據(jù)峰面積歸一化法進(jìn)行半定量分析［23-25］。使用Mass Hunter（B.08.00，Agilent Technologies）軟件進(jìn)行1-DGC 數(shù)據(jù)處理；采用Canvas（V1.8.0，J＆X Technologies）軟件進(jìn)行GC×GC數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 全二維氣相色譜分離

本文比較了1-DGC 和GC×GC 的色譜分離效果，其結(jié)果如圖1 所示。在1-DGC 分析中共鑒定67 種化合物，而通過(guò)GC×GC可鑒定207種化合物（見(jiàn)表1），是1-DGC分離化合物數(shù)量的3.1倍。

表1 獨(dú)活揮發(fā)油的化學(xué)成分鑒定Table 1 Chemical composition identification of Radix Angelicae Pubescentis essential oil

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

此外，1-DGC分離存在嚴(yán)重的共洗脫現(xiàn)象，從圖1選中的區(qū)域可看出，1-DGC僅檢測(cè)到3個(gè)峰，分別為水芹醛、4-羥基-2-甲基苯乙酮、乙酸芐酯，而GC×GC 在相同保留時(shí)間處分離得到了6 個(gè)峰，新增加的3 個(gè)物質(zhì)分別是3-甲基-4-異丙基苯酚、2-蒈烯-10-醛、對(duì)-甲基異丙基苯-7-醇。因此，從1-DGC和GC×GC 色譜圖及檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比可看出，GC×GC 分離可使得共流出峰有很好的改善效果，增加了峰的檢測(cè)數(shù)量，從而進(jìn)一步揭示獨(dú)活揮發(fā)油的更多化合物組成，包括在1-DGC 分析中未發(fā)現(xiàn)的微量成分，同時(shí)獲得更為準(zhǔn)確的定性、定量效果。

圖1 獨(dú)活揮發(fā)油的1-DGC與GC×GC色譜圖Fig.1 Chromatograms of Radix Angelicae Pubescentis essential oils by 1-DGC and GC×GC

為更好地顯示獨(dú)活揮發(fā)油化學(xué)成分在全二維氣相色譜上的族類分離效果，根據(jù)化合物官能團(tuán)不同進(jìn)行分類，包括酸類、醇類、醛類、醚類、酯類、酮類、酚類、碳?xì)浠衔锛捌渌衔铩８黝愇镔|(zhì)的全二維氣相色譜族類分離效果如圖2所示。

由圖2 知，酸類、醛類和醚類物質(zhì)在兩個(gè)維度色譜柱上均能實(shí)現(xiàn)較好的族分離效果，其中酸類物質(zhì)分布最為分散，在一維色譜上的保留時(shí)間從10 min 到46 min，而醛類物質(zhì)的一維色譜保留時(shí)間大部分在30 min 內(nèi)，主要與化合物的極性有關(guān)。酯類物質(zhì)在兩個(gè)色譜柱上的保留時(shí)間分布相對(duì)均勻，表明酯類物質(zhì)的分子量和極性范圍相對(duì)接近。其次，對(duì)碳?xì)浠衔锒裕鼈冎饕蓡屋疲ǖ头肿樱┖捅栋胼疲ǜ叻肿樱┙M成，極性相對(duì)較弱，所以在二維色譜柱上的保留時(shí)間通常小于2.6 s，而苯酚類物質(zhì)由于極性相對(duì)較高，所以在一維色譜柱上比較分散，且在二維色譜柱上的保留時(shí)間大于2.5 s。因此，本文所使用的色譜柱組合對(duì)獨(dú)活揮發(fā)油具有較好的族分離效果。

圖2 全二維氣相色譜族分離效果Fig.2 Two-dimensional distribution of different chemical classes

2.2 定性分析

按照“1.4”方法進(jìn)行定性分析，共鑒定了獨(dú)活揮發(fā)油中的207 種化合物信息。首先基于NIST 庫(kù)檢索，篩選正向、反向匹配度均大于750 的化合物，然后通過(guò)分子離子峰的精確分子量，以及實(shí)測(cè)保留指數(shù)做進(jìn)一步的化合物結(jié)構(gòu)確認(rèn)。根據(jù)所鑒定207 種化合物的匹配因子分布圖（如圖3），正向、反向匹配因子大于800 的化合物占90%以上，而且正向匹配度大于900的有16種，反向匹配度大于900的有40種化合物。因此，通過(guò)全二維氣相色譜的二次分離，化合物質(zhì)譜具有較好的匹配效果。

圖3 化合物的匹配因子范圍Fig.3 Match factor range for detected compounds

其次，利用分子離子峰信息對(duì)所鑒定的化合物進(jìn)行定性分析，207 種化合物中有95.2%以上含有分子離子峰，但有少部分化合物由于在70 eV EI 電離條件下很容易碎裂，很難找到其分子離子峰信息［26］。比較了化合物分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)的實(shí)測(cè)值和理論值之間的誤差，結(jié)果表明，存在分子離子峰的所有化合物質(zhì)量偏差均在± 3 ppm 之內(nèi)，符合利用高分辨精確質(zhì)量數(shù)對(duì)化合物的定性要求［27］。因此，利用精確質(zhì)量數(shù)的高分辨質(zhì)譜可以進(jìn)一步提高所鑒定化合物結(jié)構(gòu)的可靠性。

此外，保留指數(shù)（RI）是化合物定性的最有效手段之一，通常要保證所鑒定化合物的實(shí)測(cè)值與文獻(xiàn)值之間的差值在±40 之間［28］，而且保留指數(shù)的應(yīng)用可進(jìn)一步篩選和減少譜庫(kù)檢索提供的化合物數(shù)量，提高定性結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。按照“1.2”儀器分析條件，采用正構(gòu)烷烴（C8～C25）對(duì)所鑒定化合物的保留指數(shù)進(jìn)行實(shí)測(cè)，并與文獻(xiàn)值相比較。結(jié)果顯示，本文所鑒定化合物的實(shí)測(cè)保留指數(shù)值與文獻(xiàn)值之間具有良好的一致性，所有差值均在可接受范圍內(nèi)（＜40），且80%以上物質(zhì)的保留指數(shù)偏差在20 之內(nèi)，進(jìn)一步提高了化合物的定性準(zhǔn)確性。

為進(jìn)一步證實(shí)定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究選取5 種標(biāo)樣對(duì)真實(shí)樣品中的化合物進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證（表2）。由表2可知，實(shí)測(cè)樣品的一維與二維保留時(shí)間均與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致。其次，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留指數(shù)偏差均在20之內(nèi)，且精確質(zhì)量偏差不超過(guò)1 ppm，證實(shí)了鑒定結(jié)果的可信度。

表2 5種標(biāo)樣質(zhì)譜信息與真實(shí)樣品的定性信息對(duì)比Table 2 The comparison of mass spectrum informations of selected standards and corresponding compounds in true samples

2.3 定量分析

采用“1.4”方法對(duì)所鑒定的207種獨(dú)活揮發(fā)油成分進(jìn)行半定量分析，其分類比較結(jié)果如圖4所示。獨(dú)活揮發(fā)油的各類物質(zhì)含量大小依次為酯類（36.27%）＞醇類（15.68%）＞酚類（14.69%）＞碳?xì)浠衔铮?3.60%）＞酮類（4.93%）＞酸類（2.45%）＞醚類（1.10%）＞醛類（0.77%），其他成分為3.39%。由此可看出，酯類、醇類、酚類、碳?xì)浠衔锸仟?dú)活揮發(fā)油最豐富的化學(xué)成分，其中包括27種酯、63種碳?xì)浠衔铩?1種醇及8種酚類。其次，歐芹酚甲醚的含量最高，相對(duì)含量為30.07%，其具有促分泌、驅(qū)蟲(chóng)、抗增殖等生物活性，與文獻(xiàn)報(bào)道歐芹酚甲醚是獨(dú)活中主要化合物的結(jié)論相符［29］。此外，α-沒(méi)藥醇（3.34%）、2-（二乙氨基苯基甲基）環(huán)己醇（2.87%），β-水芹烯（2.68%）和4-羥基-3-甲基苯乙酮（2.23%）等活性物質(zhì)的相對(duì)含量也較高［30-32］，具有較好的藥用價(jià)值。因此，本文的檢測(cè)結(jié)果可提供獨(dú)活揮發(fā)油最全最有用的物質(zhì)信息，對(duì)于挖掘獨(dú)活揮發(fā)油的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥用價(jià)值具有重要意義。

圖4 獨(dú)活揮發(fā)油化學(xué)成分的分類比較Fig.4 Comparison of Radix Angelicae Pubescentis essential oils chemical composition by different classes

3 結(jié) 論

為深入了解獨(dú)活揮發(fā)油的物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥用價(jià)值，本文采用全二維氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)水蒸氣蒸餾獲得的獨(dú)活揮發(fā)油成分進(jìn)行高通量分析。利用全二維氣相兩根色譜柱的正交分離效果，更好地解決了常規(guī)一維色譜方法中峰共流出的問(wèn)題，從而提高了色譜峰容量，實(shí)現(xiàn)了高通量分析。此外，結(jié)合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)以及保留指數(shù)進(jìn)一步定性確認(rèn)，提升了化合物定性的準(zhǔn)確性。本文共檢測(cè)到獨(dú)活揮發(fā)油中207 種化學(xué)成分，是目前為止鑒定獨(dú)活揮發(fā)油成分最多的分析方法。此外，化合物半定量分析表明，酯類、醇類、酚類和碳?xì)浠衔锸仟?dú)活揮發(fā)油的主要化學(xué)成分。本研究為獨(dú)活揮發(fā)油藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其他揮發(fā)油化學(xué)成分的高通量分析提供了方法參考。