超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定糧食中有機磷酸酯及其二酯代謝物

張博鈉，侯敏敏，錢承敬，史亞利*，蔡亞岐

（1.國科大杭州高等研究院（UCAS） 環(huán)境學院，浙江 杭州 310024；2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室，北京 100083；3.中國科學院大學，北京 100049；4.中糧營養(yǎng)健康研究院，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

有機磷酸酯（OPEs）作為阻燃劑或增塑劑廣泛應用于橡膠制品、紡織品、電子設備、家具及建筑材料等消費品中［1］。近年來，部分鹵系阻燃劑（如多溴聯(lián)苯醚），由于其毒性、長距離遷移性和生物累積性等逐步被淘汰。OPEs 作為替代品，阻燃性能優(yōu)良，產(chǎn)量和使用量逐年增加。OPEs 通常以物理方式而非化學鍵合的形式添加于各類消費品中，穩(wěn)定性較差，因此在消費品生產(chǎn)、運輸和使用全過程均可能通過揮發(fā)、浸泡溶出或磨損等方式釋放到環(huán)境中［1］。大量研究顯示，目前OPEs 在室內(nèi)外空氣［2-3］、灰塵［4］、沉積物［5］、水體［2］、土壤［6］、生物樣本［7］乃至人體樣本［8］中檢出，表明OPEs 普遍存在于生活環(huán)境中，可能會威脅人類健康。

研究表明多種OPEs 對生物體表現(xiàn)出多方面的毒性效應，如神經(jīng)毒性［9］、生殖毒性［10］、致癌性［11］、內(nèi)分泌干擾效應［12］等?？紤]到OPEs在環(huán)境中普遍存在，人體會通過呼吸、灰塵攝食、皮膚吸收、飲食及飲水等多種途徑攝入OPEs［13］。目前，多項研究通過采集空氣和灰塵樣品研究人體通過呼吸和灰塵攝食對OPEs的暴露，僅有少數(shù)研究評估了通過飲食攝入對OPEs的暴露［14-16］。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)食用大米是人體暴露OPEs的潛在的主要途徑。糧食及其制品作為人們?nèi)粘ｏ嬍车闹魇吃?，占?jù)人們膳食的重要部分。食用受到污染的糧食可能會影響人體健康。

進入人體的OPEs 能夠發(fā)生代謝轉化，生成其二酯代謝物（di-OPEs）或羥基化的產(chǎn)物［17］，最后通過尿液排出體外，因此通常利用尿液中的OPEs 代謝物作為標志物評估人體對OPEs 的暴露情況［18］。值得注意的是，先前的研究忽略了人體直接從環(huán)境和飲食中攝入的OPEs 代謝物。然而最近有研究發(fā)現(xiàn)OPEs代謝物本身也存在于食物和灰塵樣品中，如Hou等［19］在淡水魚中檢測到OPEs代謝物。He等［20］在澳大利亞采集的食物和飲用水樣品中檢出磷酸二丁酯（DBP）和磷酸二苯基酯（DPHP）等di-OPEs。Van等［21］研究證實了人們可通過灰塵攝入di-OPEs，表明人體中OPEs代謝物可能直接來源于飲食或灰塵攝食。

目前已有研究在固體樣品（如糧食和土壤）中檢測到OPEs 及di-OPEs，通過使用不同的分析檢測方法，包括固相萃取聯(lián)用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）［20，22］、超聲提取聯(lián)用氣相色譜-串聯(lián)質譜（GC-MS）［23］等，但這些研究通常采取不同的前處理方法分別檢測OPEs 及di-OPEs，費時費力，且消耗較多有機溶劑。因此，建立同時檢測糧食樣品中OPEs及di-OPEs的分析方法具有重要意義。

本研究在優(yōu)化萃取凈化前處理條件的基礎上，建立了一種同時測定糧食樣品中14種OPEs及其8種di-OPEs的UPLC-MS/MS 法。采用該方法對采集的25個小麥樣品中目標化合物進行測定，以期了解我國糧食樣品中有機磷酸酯及其代謝物的污染水平，并據(jù)此對我國成年人和兒童攝入小麥的風險進行評估。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BJ-150 型多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；DHG-9023A 烘箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DP200D-1 氮吹濃縮儀（東莞市譜標實驗器材科技有限公司）；UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Triple quadTM三重四極桿串聯(lián)質譜檢測系統(tǒng)（MS/MS，美國AB SCIEX 公司）；ENVI-18 固相萃取柱（6 mL/500 mg，Supelco 公司）；HLB 固相萃取柱（6 mL/200 mg，Waters 公司）；0.22 μm 尼龍濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）；1 mL 注射器（江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司）。超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。

1.2 標準溶液的配制

OPEs 單標儲備液及其內(nèi)標儲備液（1 000 mg/L）用乙腈配制，分別量取10 μL 單標儲備液，用乙腈稀釋至10 mL，配成質量濃度為1 mg/L 的混合標準儲備液和混合內(nèi)標儲備液。di-OPEs 單標儲備液及其內(nèi)標儲備液（1 000 mg/L）用甲醇配制，分別量取10 μL 單標儲備液，用甲醇稀釋至10 mL，配成質量濃度為1 mg/L 的混合標準儲備液和混合內(nèi)標儲備液，于-4 ℃儲存?zhèn)溆?。使用時，用甲醇配制成質量濃度為0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取一定量的小麥置于干凈玻璃管中，加入5 mL甲醇后，手動搖晃20 s，取出清洗液，重復2次，清洗后的小麥于80 ℃烘干20 min，粉碎成粉末。準確稱取1.0 g粉末樣品于15 mL玻璃離心管中，加入質量濃度為1 mg/L 的OPEs 及其代謝物的內(nèi)標混合溶液各10 μL，靜置老化1 h，再加入3 mL 甲醇，超聲萃取60 min 后，轉移上清液；再向殘留部分加入3 mL 甲醇，超聲萃取30 min，重復2 次，最后將3次上清液合并待凈化。

采用ENVI-18 固相萃取柱對樣品進行凈化處理，首先用5 mL 甲醇活化萃取柱，將萃取液直接加載到活化好的小柱上并收集，待樣品加載完成后，再用5 mL 甲醇進行洗脫，將收集的洗脫液氮吹至1 mL，通過0.22 μm有機濾膜后轉移至進樣小瓶，待檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：25 ℃，流速：400 μL/min；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，B為甲醇。OPEs的梯度洗脫程序：0～1 min，10%～40% B；1～4 min，40%～90% B；4～4.1 min，90%～100% B；4.1～9 min，保持100% B；9～9.1 min，100%～10%B；9.1～13 min，保持10%B。di-OPEs 的梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持20%B；0.5～1 min，20%～40%B；1～4 min，40%～90%B；4～7.5 min，保持90%B；7.5～7.6 min，90%～20%B；7.6～12 min，保持20%B。

1.4.2 質譜條件 對于OPEs，離子源：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；檢測方式：多重反應監(jiān)測模式（MRM）；氣簾氣壓力：0.14 MPa，碰撞氣壓力：0.02 MPa，離子源噴霧電壓：5 000 V，溫度：600 ℃，霧化氣壓力：0.34 MPa，輔助霧化氣壓力：0.28 MPa。對于di-OPEs，離子源：電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；檢測方式：MRM；氣簾氣壓力：0.07 MPa，碰撞氣壓力：0.02 MPa，離子源噴霧電壓：-4 500 V，溫度：500 ℃，霧化氣壓力：0.34 MPa，輔助霧化氣壓力：0.34 MPa。其余質譜參數(shù)見表1。

表1 14種OPEs及8種di-OPEs的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters for 14 OPEs and 8 di-OPEs

2 結果與討論

2.1 凈化方法的優(yōu)化

由于OPEs 及其代謝物的性質存在差異，先前研究通常采用不同的凈化方法，對于OPEs，首先用乙腈和超純水活化ENVI-18 小柱，將換相成水相的萃取液加載到小柱中，上樣完成后負壓抽干小柱，然后用含有25%二氯甲烷的乙腈溶液進行洗脫（方法1）。對于di-OPEs，首先用甲醇和超純水活化HLB小柱，將換相成水相的萃取液加載到小柱中，上樣完成后負壓抽干小柱，用甲醇洗脫目標物（方法2）。上述兩種凈化方法均需負壓抽干柱子，耗時較長，過程較繁瑣，且對于同時檢測OPEs 以及di-OPEs 需要處理樣品2次。因此，本研究對樣品凈化方法進行了改進，即首先用甲醇活化ENVI-18小柱，然后直接將甲醇相的萃取液加載到活化好的小柱上并收集，然后用甲醇洗脫（方法3）。

實驗對比了改進前后凈化方法的處理效果（見圖1）。結果表明，凈化方法1 和3 對于大部分OPEs均具有較好的回收效果，采用凈化方法1，除TBOEP 外，其余13 種OPEs 的回收率為90.1%～154%，相對標準偏差（RSD）為8.3%～43%；采用凈化方法3，14 種OPEs 的回收率為64.0%～131%，RSD 為0.90%～22%。整體上，采用方法1，TnBP 和TBOEP 的回收率偏高，且RSD 大于方法3。對于di-OPEs，采用方法2 和3，8 種di-OPEs 的回收率分別為79.2%～112%和71.1%～141%，RSD 分別為5.0%～34%和0.57%～19%。鑒于改進后的方法3 對22 種目標化合物均具有較好的回收效果，無需負壓抽干小柱，且節(jié)約時間，因此最終選擇凈化方法3，即將甲醇萃取液直接上樣進行凈化。

圖1 不同凈化方法對14種OPEs（A）與8種di-OPEs（B）的回收率（n=3）Fig.1 Recoveries of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）using different purifying methods（n=3）

2.2 線性范圍、檢出限與定量下限

配制質量濃度為0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的14種OPEs和8種di-OPEs的混合標準溶液，按照“1.4”儀器條件進行分析，以待測物的質量濃度為橫坐標（x，μg/L），待測物與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果表明，14種OPEs和8種di-OPEs在0.1～20 μg/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)（r）大于0.99。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算方法檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），14 種OPEs 的LOD 為0.005 02～1.94 ng/g，LOQ 為0.016 7～6.45 ng/g；8 種di-OPEs 的LOD 為0.005 70～1.00 ng/g，LOQ 為0.018 9～3.33 ng/g（見表2）。在最佳實驗條件下，14 種OPEs 及8 種di-OPEs標準溶液的總離子流色譜圖見圖2。

表2 14種OPEs及8種di-OPEs的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits of 14 OPEs and 8 di-OPEs

圖2 14種OPEs（A）與8種di-OPEs（B）標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）standard solutions

2.3 回收率與相對標準偏差

以小麥為基質進行基質加標回收試驗以評價方法的準確度與精密度，向其中添加3 個不同濃度水平（5、10、20 μg/L）的混合標準溶液，每個水平平行3 次，按照優(yōu)化后的方法進行測定。由表3 可知，14 種OPEs 的加標回收率為60.0%～131%，RSD 為0.89%～22%；8 種di-OPEs 的回收率除BBOEP 外（141%），其它均在62.4%～121%之間，RSD 為0.57%～22%。整體上，該方法的準確性較好，精密度較高，能夠滿足檢測要求。

表3 小麥樣品中14種OPEs及8種di-OPEs的加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（n=3）

（續(xù)表3）

2.4 實際樣品分析與風險評估

采用本方法對25 個小麥樣品進行檢測，結果見表4。14 種OPEs 的總含量為0.843～23.5 ng/g，中位含量為2.33 ng/g。TEP、TCEP、TCIPP 和EHDPP 在全部樣品中均檢出，TEHP、TPHP、TMPP 和TBOEP的檢出率高于50%。其中，TCIPP是小麥中最主要的OPEs，含量為0.525～2.14 ng/g，中位含量為0.960 ng/g。8 種di-OPEs 的總含量為0.126～4.81 ng/g，中位含量為1.15 ng/g。DBP 和DPHP 在所有樣品中均檢出，BDCPP 和BEHP 的檢出率高于50%。其中BEHP 是小麥中最主要的di-OPEs，中位含量為0.529 ng/g，這可能與其具有直接的工業(yè)應用有關。以上結果表明OPEs 和di-OPEs 在小麥樣品中普遍存在。

表4 小麥樣品中14種OPEs及8種di-OPEs的檢測結果（ng/g）Table 4 Detection results of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（ng/g）

根據(jù)Zhang 等［14］采用的風險評估方法，本文評估了我國成年人和兒童通過食用小麥對OPEs 及di-OPEs 的暴露情況。采用下式估算人體每日通過食用小麥對OPEs 及di-OPEs 的攝入量：EDI=CW×CFW/BW。其中：EDI 為每日攝入量，ng/kg bw/day；CW為小麥中OPEs 或di-OPEs 的含量，ng/g；CFW為居民日均小麥消費量，g/day；BW為人體質量，kg。

成人日均小麥消費量取自《中國統(tǒng)計年鑒》［24］，為323 g/day；成人體重取自《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告（2020 年）》中18 歲及以上居民男性（69.6 kg）和女性（59 kg）體重的平均值，為64.3 kg。兒童（3～12周歲）的平均體重為25 kg，日均糧食消費量（谷物）為165 g/day［25］。

根據(jù)美國環(huán)保署（USEPA）的定義，RfD 值代表一種化合物每日經(jīng)口暴露于人體的閾值，被視為人體暴露于非致癌有毒物質風險評估的重要指標。對于我國成年人和兒童，成年人通過食用小麥攝入14種OPEs 的總暴露量為4.23～118 ng/kg bw/day，兒童為5.56～155 ng/kg bw/day；成年人通過食用小麥攝入8 種di-OPEs 的總暴露量為0.633～24.2 ng/kg bw/day，兒童為0.832～31.7 ng/kg bw/day（見表5）。整體上，兒童的暴露量高于成人，TCIPP 是通過食用小麥每日攝入量最高的OPE，估算的兒童和成人的EDI 中位值分別為6.33、4.82 ng/kg bw/day，BEHP 是通過食用小麥每日攝入最高的di-OPE，估算的兒童和成人的EDI中位值分別為3.49、2.66 ng/kg bw/day。每種OPEs通過食用小麥的暴露量比其對應的RfD值低2～5個數(shù)量級，表明存在較低的健康風險。但考慮到糧食的生產(chǎn)、加工、運輸過程可能會增加OPEs及其代謝物的污染，進而導致人體更高的暴露風險，因此仍需要更多的研究關注人體通過飲食對OPEs及di-OPEs的暴露及相關的健康風險。

表5 成人和兒童通過食用小麥攝入的OPEs及di-OPEs估算結果（ng/kg bw/day）Table 5 Estimation of daily per capita wheat dietary intakes and risk assessment exposure to OPEs and di-OPEs for adults and children（ng/kg bw/day）

3 結 論

本研究建立了超聲提取/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測糧食樣品中有機磷酸酯及其二酯代謝物的分析方法。該方法前處理操作簡便，節(jié)約時間和溶劑，經(jīng)過一次處理即可完成所有目標物的濃縮凈化，方法學考察表明22種目標物質的回收率良好，重現(xiàn)性高，滿足檢測要求?；谠摲椒▽嶋H小麥樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，8種OPEs和4種di-OPEs普遍存在，暴露估算結果表明我國成人和兒童通過食用小麥攝入的OPEs遠低于其RfD，健康風險較低。