空間分辨測量解析三（2，2′-聯(lián)吡啶）釕（Ⅱ）電化學(xué)發(fā)光機(jī)理的研究進(jìn)展

胡詩帆，王亞鋒，蘇 彬

（浙江大學(xué) 化學(xué)系 分析化學(xué)研究所，浙江 杭州 310058）

1 電化學(xué)發(fā)光概述

電化學(xué)發(fā)光（ECL）是由電極表面的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)引發(fā)的暗場光輻射［1］，可通過電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，且無需外加激發(fā)光，具有時(shí)空可控性強(qiáng)、背景信號低和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［2-3］。ECL在生物傳感、發(fā)光器件、核酸檢測、免疫分析等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［4-5］。以三（2，2′-聯(lián)吡啶）釕（Ⅱ）（Ru(bpy)2+3）為探針的ECL 是現(xiàn)行免疫分析中最先進(jìn)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方法之一。Roche Diagnostics 和Meso Scale Discovery 等公司開發(fā)的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中，包括腫瘤標(biāo)志物、傳染性疾病、心血管疾病等多種疾病的早期診斷。

1.1 電化學(xué)發(fā)光的研究進(jìn)展

1927 年，Dufford 等［6］在無水乙醚中電解格氏試劑時(shí)發(fā)現(xiàn)了發(fā)光現(xiàn)象。1929 年，Harvey 等［7］用多種不同的金屬電極在電解堿性魯米諾水溶液時(shí)，觀察到了陰極和陽極區(qū)的發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光研究的序幕從此拉開。然而，受到儀器設(shè)備等限制，電化學(xué)發(fā)光研究在最初的幾十年進(jìn)展緩慢。直到20世紀(jì)60年代，光電倍增管（PMT）和電荷耦合器件（CCD）等高靈敏光電傳感器的出現(xiàn)，極大地促進(jìn)了ECL 的研究發(fā)展。60年代中期，Kuwana等［8］用PMT研究了脈沖電壓下魯米諾電化學(xué)發(fā)光的動力學(xué)，并提出了新的發(fā)光機(jī)理。Hercules和Bard等［9-10］報(bào)道了稠環(huán)芳烴類化合物在有機(jī)溶劑中的ECL。這類有機(jī)化合物的電化學(xué)發(fā)光對溶劑的要求較高，大多不能直接在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)，因此其應(yīng)用受到很大的限制。無機(jī)金屬配合物，如Ru(bpy)2+3等，是目前應(yīng)用最廣泛的ECL探針。1972年，Bard等［11］首次報(bào)道了Ru(bpy)2+3在乙腈中的ECL。隨后，他們以草酸鹽和過硫酸鹽作為共反應(yīng)劑，構(gòu)建了水溶液中的ECL 體系，拓寬了ECL 的應(yīng)用范圍［12-14］。1987 年，Engstrom 等［15-18］發(fā)展了電化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)，將電極表面的活性位點(diǎn)和電流密度的分布可視化，研究了電極的邊緣效應(yīng)和電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)在空間上的變化，為電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的研究提供了全新的方法。1990 年，Powell 等［19］首次將三正丙胺（TPrA）作為共反應(yīng)劑用于ECL 中，當(dāng)發(fā)光體和共反應(yīng)劑均被氧化時(shí)，可觀察到較強(qiáng)的ECL 信號。同時(shí)，該工作還提出了氧化-還原路徑，為胺類共反應(yīng)劑的開發(fā)和Ru(bpy)2+3/TPrA 體系在生物、醫(yī)藥、臨床等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1995年，Wightman等［20］采用快速電位脈沖法研究了超微電極表面單分子的電化學(xué)發(fā)光，并確定了反應(yīng)中的速控步驟。21 世紀(jì)以來，納米材料作為新型電化學(xué)發(fā)光體（如不同結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)：硒化鎘、硫化鎘、硒化鎘/硫化鎘/硫化鋅［21-22］等）引起了研究者的研究興趣，也極大地增大了發(fā)光分子的選擇范圍［23］。此外，Xu 等［24］將2-（二丁氨基）乙醇（DBAE）這種毒性低、水溶性好的羥乙基胺類分子作為共反應(yīng)劑，發(fā)現(xiàn)以鉑或者金電極作為工作電極時(shí)，ECL的強(qiáng)度會顯著提高。

1.2 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理

電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理一般可以分為湮滅型機(jī)理和共反應(yīng)劑型機(jī)理［5］。

1.2.1 湮滅型電化學(xué)發(fā)光 湮滅型電化學(xué)發(fā)光主要發(fā)生在有機(jī)溶劑中，并且需要在電極上施加正負(fù)雙階躍脈沖電位，電極表面電化學(xué)還原和氧化反應(yīng)產(chǎn)生的高能陰、陽離子自由基A-·和D+·之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)（其中，A 和D 可以是同種物質(zhì)也可以是不同物質(zhì)），形成激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子躍遷回基態(tài)產(chǎn)生光輻射（圖1）。

圖1 湮滅型電化學(xué)發(fā)光機(jī)理Fig.1 Reaction mechanisms of annihilation ECL

圖2 Ru(bpy) 2+3 /TPrA共反應(yīng)劑型電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)機(jī)理Fig.2 Reaction mechanisms of coreactant ECL for Ru(bpy) 2+3 /TPrA system

電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的過程較為復(fù)雜，涉及電極-溶液界面的電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)、活性中間體的生成與擴(kuò)散、激發(fā)態(tài)的生成和輻射復(fù)合等，目前對電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的理解仍不十分清楚。解析電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理對設(shè)計(jì)新型電化學(xué)發(fā)光體系，提高發(fā)光效率，篩選發(fā)光分子和共反應(yīng)劑，調(diào)控發(fā)光區(qū)域和發(fā)展高效免疫分析體系等具有重要意義。

2 電化學(xué)發(fā)光機(jī)理解析

電化學(xué)發(fā)光是一種表面限域的分析方法，ECL 的發(fā)光層限域在電極表面附近，發(fā)光層主要由ECL反應(yīng)過程和反應(yīng)中間體的壽命所決定［29］。以Ru(bpy)2+3/TPrA體系為例，當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度較低時(shí)，發(fā)光層的厚度由TPrA+·的擴(kuò)散決定，由于TPrA+·不穩(wěn)定，其擴(kuò)散距離受限，發(fā)光層局域在電極表面附近；而當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度較高時(shí)，電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)由催化路徑主導(dǎo)，發(fā)光層的厚度由Ru(bpy)3+3的擴(kuò)散決定，在一定時(shí)間尺度上電化學(xué)氧化產(chǎn)生的Ru(bpy)3+3可在溶液中穩(wěn)定存在，Ru(bpy)3+3的擴(kuò)散使發(fā)光層在空間上延展。因此，改變發(fā)光分子或共反應(yīng)劑的種類和濃度、施加的電位、電位的持續(xù)時(shí)間等可以改變各路徑在ECL 反應(yīng)中的占比，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對發(fā)光層的空間調(diào)控。空間分辨測量是一種獲得空間分辨信息的有效方法，主要分為橫向（平行于電極表面方向）空間分辨測量和縱向（垂直電極表面方向）空間分辨測量。其中，縱向空間分辨測量可以直接對電極表面發(fā)光層的厚度等參數(shù)進(jìn)行測量，是研究發(fā)光機(jī)理最直接和有效的方法之一。目前，掃描電化學(xué)顯微鏡（SECM）和電化學(xué)發(fā)光顯微成像（ECLM）技術(shù)是實(shí)現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光空間分辨測量的主要方法和工具。

2.1 掃描電化學(xué)顯微鏡（SECM）技術(shù)

SECM 是基于電化學(xué)反應(yīng)的微區(qū)測量技術(shù)［30-31］，以超微電極（UME）為工作電極和掃描探針（Tip）［32］，具有較高的靈敏度和空間分辨率。Fan 等［33］使用SECM 和超微金屬電極研究了電極尖端產(chǎn)生的ECL，得出ECL 強(qiáng)度與電極-基底之間距離的定量關(guān)系。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對基底表面的成像，空間分辨率達(dá)到1 μm。如圖3 所示，Miao 等［27］將Ru(bpy)2+3修飾到氧化銦錫（ITO）基底電極表面，以直徑為1.5 mm 的半球形金電極作為Tip，研究了Ru(bpy)2+3/TPrA 的ECL 并提出了低氧化電位反應(yīng)路徑。在實(shí)驗(yàn)過程中，ITO 電極處于開路狀態(tài)，發(fā)光分子不會在電極表面直接被氧化。在Tip 上施加+ 0.85 V（vs.Ag/AgCl）的氧化電位，溶液中的TPrA 在Tip 表面被氧化為TPrA+·。Tip 沿垂直于基底電極的方向向基底漸近，當(dāng)Tip 距離基底表面5～6 μm 時(shí)，PMT 開始檢測到ECL 信號，并且隨著距離的進(jìn)一步減小，ECL強(qiáng)度呈指數(shù)型增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPrA+·在水溶液中的最遠(yuǎn)擴(kuò)散距離約為6 μm，進(jìn)一步結(jié)合擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算出TPrA+·的半衰期約為0.2 ms。

圖3 SECM與ECL聯(lián)用示意圖（A），ECL強(qiáng)度隨Tip-基底之間距離的變化曲線（B）［27］Fig.3 Experimental setup for studying ECL by SECM（A），dependence of ECL intensity on the distance between Tip and substrate（B）［27］

Bard課題組［34］還運(yùn)用SECM 研究了湮滅型電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)機(jī)理，其原理如圖4所示。在SECM 探針與基底之間的微小間隙中，電極表面產(chǎn)生的自由基之間發(fā)生湮滅反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)，ECL 的強(qiáng)度與距離相關(guān)。以紅熒烯和Ru(bpy)2+3作為發(fā)光分子，改變探針與基底之間的距離得到一系列ECL 強(qiáng)度-距離曲線，并由這些發(fā)光曲線計(jì)算出穩(wěn)態(tài)條件下湮滅型電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，計(jì)算結(jié)果與有限元多物理場模擬結(jié)果相吻合。

圖4 SECM用于研究湮滅型電化學(xué)發(fā)光機(jī)理的示意圖（A），及ECL強(qiáng)度-電位曲線隨Tip與基底之間距離的變化（B）［34］Fig.4 Schematic illustration of SECM used in annihilation ECL（A），dependence of ECL intensity-potential curve on the distance between Tip and substrate（B）［34］

SECM 在電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)和機(jī)理研究中有著重要的應(yīng)用，但其空間分辨率很大程度上受到探針尺寸的限制，且超微電極可能會對研究體系有一定的影響。因此，目前電化學(xué)發(fā)光空間分辨測量主要基于電化學(xué)發(fā)光成像。

2.2 電化學(xué)發(fā)光顯微成像（ECLM）技術(shù)

近年來，隨著光學(xué)成像儀器靈敏度的逐漸提高，ECL 成像分析發(fā)展迅速。ECL 成像需要結(jié)合電荷耦合器件或電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）實(shí)現(xiàn)。CCD 可以將光學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電流信號，并能將電流信號進(jìn)行放大和轉(zhuǎn)換，以圖像的形式輸出，具有響應(yīng)速度快、分析通量高、成像視野寬的優(yōu)勢［35］。與CCD相比，EMCCD增加了電子寄存器，其檢測靈敏度可達(dá)到單光子水平，能夠顯著地提高ECL成像的靈敏度和信噪比。為了提高空間分辨率，ECL 成像通常需要結(jié)合顯微鏡使用，即ECLM［36］。目前，ECLM技術(shù)主要應(yīng)用于免疫分析［37］、酶生物傳感［38］、細(xì)胞成像［39-40］、核酸分析及指紋成像［41-44］。

Sojic 課題組［45］在亞微米尺寸的光纖陣列表面濺射ITO 層，并在ITO 表面涂覆絕緣材料，僅使錐形尖端暴露。Ru(bpy)2+3與TPrA 在尖端產(chǎn)生的ECL 可以通過光纖傳輸，并使用CCD 相機(jī)對ECL 過程進(jìn)行成像。陣列電極錐形尖端的直徑約為0.6 μm，間距約為4 μm。電極之間的ECL 圖像不重疊，尺寸約為1～1.5 μm。計(jì)算可得，ECL 發(fā)光區(qū)域被限制在電極表面約400 nm 的范圍內(nèi)，此即為Ru(bpy)2+*3在電極表面的分布范圍。

近年來，ECLM 也被用于研究微球體系的電化學(xué)發(fā)光機(jī)理。Sojic 課題組［46］利用夾心免疫反應(yīng)將Ru(bpy)2+3固定在直徑為12 μm 的聚苯乙烯微球表面，通過俯視和側(cè)視顯微成像，研究了微球表面ECL的空間分布。如圖5 所示，熒光圖像表明Ru（bpy）32+均勻分布于微球表面。因?yàn)殡娮铀泶┑木嚯x僅為1～2 nm，所以Ru(bpy)2+3分子在電極表面的直接氧化可以忽略不計(jì)。以TPrA 作為共反應(yīng)劑時(shí)，施加+1.1 V的氧化電位，TPrA 在電極表面被氧化為TPrA+·，但由于TPrA+·的擴(kuò)散距離有限，只在距離電極表面3～4 μm 的范圍內(nèi)觀察到明顯的ECL 信號。微球頂部的發(fā)光信號則來源于微球?qū)Φ撞縀CL 信號的物理匯聚，并非源于微球頂部的ECL。以DBAE 作為共反應(yīng)劑時(shí)，在微球表面未檢出ECL 信號。這是由于微球體系的ECL 由共反應(yīng)劑自由基的擴(kuò)散和分布決定，而DBAE+·的壽命遠(yuǎn)小于TPrA+·（約為TPrA+·的十分之一），能擴(kuò)散的距離非常有限，故產(chǎn)生的發(fā)光信號無法被檢出。因此，雖然Ru(bpy)2+3/DBAE溶液相體系的發(fā)光更強(qiáng)且發(fā)光效率更高［23］，但并不適用于微球免疫分析。該課題組還對Ru(bpy)2+3修飾的微球的不同區(qū)域（電極表面附近和遠(yuǎn)離電極表面的位置）進(jìn)行成像，證明了共反應(yīng)劑的氧化是微球體系ECL的關(guān)鍵步驟［47］。除共反應(yīng)劑外，緩沖溶液也會對微球表面的ECL產(chǎn)生較大的影響。Fiorani等［48］報(bào)道了一種通過改變緩沖溶液的濃度調(diào)控微球表面發(fā)光層厚度的方法。當(dāng)磷酸緩沖溶液的濃度增大時(shí)，緩沖能力增強(qiáng)，起緩沖作用的離子與質(zhì)子結(jié)合的速率增加，使TPrA+·脫質(zhì)子的速率加快，TPrA+·的最大擴(kuò)散距離減小，微球表面發(fā)光層的厚度減小，發(fā)光強(qiáng)度降低。

圖5 在直徑為12 μm的聚苯乙烯微球表面修飾Ru(bpy) 2+3 的示意圖（A），俯視（a）和側(cè)視（b）顯微成像示意圖（B），以及單個(gè)聚苯乙烯微球的熒光和ECL圖像（C）［46］Fig.5 Schematic illustration of immobilizing Ru(bpy) 2+3 on the surface of polystyrene（PS）bead with a diameter of 12 μm（A），the optical configurations used for imaging the functionalized bead：top-view（a）and side-view（b）（B），and side-view PL and ECL images of single PS bead（C）［46］

Paolucci 課題組［49］結(jié)合ECLM、SECM 和質(zhì)譜等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一種能增強(qiáng)ECL 強(qiáng)度的共反應(yīng)劑中間體。將發(fā)光分子在單位時(shí)間釋放的光子數(shù)定義為轉(zhuǎn)化頻率（TOF），根據(jù)ECL 圖像計(jì)算不同直徑微球的TOF，發(fā)現(xiàn)TOF 隨微球直徑減小而明顯增大。此外，將Ru(bpy)2+3修飾在基底上，以TPrA 作為共反應(yīng)劑，SECM 的探針漸近基底的過程中，同樣觀察到當(dāng)探針距離基底表面小于1 μm 時(shí)，ECL 強(qiáng)度隨距離的進(jìn)一步減小呈指數(shù)型增強(qiáng)，表明電極表面附近存在一種活性更高、不同于TPrA+·的共反應(yīng)劑中間體。同時(shí)，根據(jù)ECL 強(qiáng)度與距離的關(guān)系曲線計(jì)算出電極表面附近和距離電極表面較遠(yuǎn)處共反應(yīng)劑中間體的壽命分別為5 μs和700 μs。在ECL過程中，質(zhì)譜同時(shí)檢出TPrA+·和二丙胺陽離子自由基（DPrA+·），表明后者是提高電極表面附近ECL 強(qiáng)度的關(guān)鍵。進(jìn)一步在體系中加入N-二丙基異丁胺（DPIBA），電極表面附近的ECL 強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。這是因?yàn)镈PIBA 是一種含有支鏈的胺類共反應(yīng)劑，其C—N 鍵斷裂時(shí)生成的碳正離子比TPrA 的C—N 鍵斷裂時(shí)生成的碳正離子更穩(wěn)定，所以DPIBA 的C—N 鍵更容易斷裂生成DPrA+·。該工作優(yōu)化了微球尺寸并在反應(yīng)體系中加入DPIBA，其ECL強(qiáng)度提高了128%。

Sojic 課題組［50-51］采用ECLM 技術(shù)研究了納米通道內(nèi)的ECL，并比較了薄層電化學(xué)池中共反應(yīng)劑型和湮滅型電化學(xué)發(fā)光的特點(diǎn)。納米通道被固定在SiN殼層中的兩個(gè)Pt電極之間，長度約為20 μm，高度約為100 nm，其俯視圖和截面示意圖如圖6A、B 所示。將反應(yīng)體積限制在飛升級，活性中間體在微小體積內(nèi)的擴(kuò)散距離很短，能顯著增強(qiáng)ECL 的強(qiáng)度。當(dāng)納米通道內(nèi)同時(shí)存在Ru(bpy)2+3和TPrA 時(shí)，分別在微電極上施加氧化電位和還原電位，TPrA立即被消耗，納米通道中產(chǎn)生極弱的ECL（圖6C）；在微電極上只施加氧化電位，無法產(chǎn)生Ru(bpy)+3，僅在納米通道的兩端產(chǎn)生發(fā)光（圖6D）。而當(dāng)納米通道中只有Ru(bpy)2+3時(shí)，Ru(bpy)2+3可以在電極之間高效循環(huán)，產(chǎn)生均勻的發(fā)光（圖6E）。作者用電化學(xué)發(fā)光成像比較了多種反應(yīng)路徑共存時(shí)，納米通道內(nèi)共反應(yīng)劑型電化學(xué)發(fā)光和湮滅型電化學(xué)發(fā)光的貢獻(xiàn)，證明了顯微成像技術(shù)是解析電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的重要方法。

圖6 納米流體裝置的俯視圖（A）和截面示意圖（B）；納米通道內(nèi)湮滅型和共反應(yīng)劑型電化學(xué)發(fā)光同時(shí)存在（C），納米通道內(nèi)只有共反應(yīng)劑型電化學(xué)發(fā)光（D），納米通道內(nèi)只有湮滅型電化學(xué)發(fā)光（E）［51］Fig.6 Top-view（A）and schematic cross-sectional（B）images of a nanofluidic device，mixed annihilation and coreactant modes in presence of TPrA（C），coreactant mode（D）and annihilation mode（E）［51］

Guo等［52］采用無電鍍金的方法制備了金微米管電極，并通過顯微成像技術(shù)，研究了Ru(bpy)2+3的濃度以及共反應(yīng)劑種類對發(fā)光層厚度的影響。如圖7 所示，以TPrA 作為共反應(yīng)劑，當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度由10 μmol/L 增至500 μmol/L 時(shí)，ECL 的圖像由圓環(huán)變?yōu)閳A斑，對應(yīng)發(fā)光層的厚度由3.1 μm 增至超過4.5 μm。當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度較高時(shí)，催化路徑起主導(dǎo)作用，電極表面產(chǎn)生的Ru(bpy)3+3的擴(kuò)散使發(fā)光層在空間延展。而以相同濃度的DBAE 作為共反應(yīng)劑時(shí)，ECL圖像的形狀不隨Ru(bpy)2+3濃度的變化而變化，始終為表面限域的圓環(huán)，表明DBAE 自由基不穩(wěn)定，擴(kuò)散距離較短。該工作證明了可以通過改變發(fā)光分子的濃度或改變共反應(yīng)劑的種類對電化學(xué)發(fā)光的空間分布進(jìn)行調(diào)控。Ding 等［53］采用化學(xué)沉積法制備了類似的超高密度微孔電極陣列，研究了Ru(bpy)2+3/TPrA 體系在微孔內(nèi)的ECL 行為。TPrA 自由基在微孔內(nèi)部徑向和軸向擴(kuò)散的疊加使管壁內(nèi)側(cè)的ECL 強(qiáng)度最強(qiáng)。當(dāng)Ru(bpy)2+3濃度較低時(shí)，單個(gè)微孔中ECL的圖像為環(huán)形，且形狀不隨曝光時(shí)間的延長而改變。

圖7 通過微米管電極測量發(fā)光層厚度的原理示意圖（A）及不同Ru(bpy) 23 +濃度下的ECL圖像（B）［521］Fig.7 Illustration of measuring the thickness of ECL layer through microtube electrodes（A），and ECL images recorded in 0.01 mol/L phosphate buffer（pH 7.4）containing 25 mmol/L TPrA and 10 μmol/L/500 μmol/L Ru（bpy）23 +（B）［52］

改變共反應(yīng)劑的濃度，同樣可以實(shí)現(xiàn)對發(fā)光層厚度的調(diào)控。Ding 等［54］在ITO 電極表面制備了惰性半球形光膠點(diǎn)陣列，其直徑約為20 μm，高度約為5.1 μm。當(dāng)在電極上施加適當(dāng)?shù)难趸娢粫r(shí)，未被光膠點(diǎn)覆蓋的電極表面將產(chǎn)生ECL 信號，而光膠點(diǎn)覆蓋的位置則不發(fā)生ECL 反應(yīng)，對應(yīng)于ECL圖像中的黑色圓形（圖8A）。如圖8B-E所示，Ru(bpy)2+3的濃度為500 μmol/L，當(dāng)TPrA的濃度由20 mmol/L 減小到2.5 mmol/L 時(shí)，黑色圓形的面積明顯變小，同時(shí)圓心的ECL 強(qiáng)度增強(qiáng)，表明隨著TPrA 濃度的降低，發(fā)光層從電極表面限域擴(kuò)展至遠(yuǎn)離電極表面處（幾微米）。當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度較高且TPrA 的濃度較低時(shí)，電極表面氧化產(chǎn)生的Ru(bpy)3+3能夠向本體溶液中擴(kuò)散較遠(yuǎn)的距離，并通過催化路徑發(fā)光，此時(shí)發(fā)光層厚度較大；而當(dāng)提高TPrA 的濃度時(shí)，Ru(bpy)3+3與TPrA 的反應(yīng)速率增加，Ru(bpy)3+3在擴(kuò)散過程中被大量消耗，其擴(kuò)散距離變短，相應(yīng)的發(fā)光層厚度也變?。▓D8F）。

圖8 發(fā)光層厚度變化對ECL圖像中光膠點(diǎn)陣列面積的影響示意圖（A）；在500 μmol/L Ru(bpy) 2+3 和20 mmol/L（B）、5 mmol/L（C）、2.5 mmol/L（D）TPrA中，光膠點(diǎn)陣列的ECL圖像（比例尺為20 μm）；在不同TPrA濃度下單個(gè)光膠點(diǎn)的歸一化ECL強(qiáng)度曲線（E）；以及在高、低TPrA濃度下發(fā)光層的分布示意圖（F）［54］Fig.8 Schematic illustration of modulating the thickness of ECL layer to image an inert photoresist spot（A），ECL images of photoresist spots in phosphate buffer saline containing 500 μmol/L Ru(bpy) 2+3 and different concentrations of TPrA（B：20 mmol/L；C：5 mmol/L；D：2.5 mmol/L，the scale bars are 20 μm），normalized ECL intensity profiles along a single photoresist spot at different concentrations of TPrA（E），and illustration of the thickness of ECL layer at a high and low concentration of TPrA（F）［54］

電化學(xué)發(fā)光成像可以將激發(fā)態(tài)分子的分布可視化，在電化學(xué)發(fā)光機(jī)理研究中有著重要的應(yīng)用。但受到光學(xué)衍射極限（～200 nm）的限制，成像的空間分辨率仍為亞微米級，在測量發(fā)光層厚度時(shí)還存在一定的局限性。

2.3 電化學(xué)發(fā)光自干涉光譜（ECLIS）

薄膜光學(xué)干涉指的是從薄膜的不同界面處反射的兩束或多束相干光發(fā)生疊加的現(xiàn)象，是一種非入侵式、無需標(biāo)記、超靈敏的測量方法。薄膜的折射率或厚度的微小變化均會引起干涉光譜形狀的變化和光譜峰位置的移動。因此，薄膜光學(xué)干涉在痕量檢測、分子識別和免疫分析等領(lǐng)域有重要應(yīng)用［55］。Wang 等［56］將電化學(xué)發(fā)光和薄膜光學(xué)干涉相結(jié)合，發(fā)展了電化學(xué)發(fā)光自干涉光譜（ECLIS），將電化學(xué)發(fā)光空間分辨測量的縱向空間分辨率提高至納米水平。如圖9A 所示，以二氧化硅/硅片作為基底，濺射厚度約為4 nm 的鈦黏附層和10 nm 的超薄金層，以此作為工作電極。在ECL 過程中，電極表面附近的發(fā)光分子直接發(fā)射的光和從電極界面反射的光之間發(fā)生干涉，得到含一系列有序排列的干涉峰的干涉光譜。結(jié)合雙光束干涉模型和傳輸矩陣模型，對光譜進(jìn)行模擬解析，即可計(jì)算得到發(fā)光分子與電極表面的距離或發(fā)光層的厚度。將Ru(bpy)2+3分別用3-巰基丙酸或含50 個(gè)堿基對的雙鏈DNA 分子固定在電極表面，測得Ru(bpy)2+3與電極表面的垂直距離分別為1.5 nm 和8.7 nm，證明了電化學(xué)發(fā)光自干涉光譜具有納米水平的縱向空間分辨率。對于溶液相的Ru(bpy)2+3/TPrA體系，當(dāng)Ru(bpy)2+3的濃度由1 μmol/L增至1 mmol/L時(shí)，干涉峰發(fā)生明顯的紅移和展寬，測得發(fā)光層厚度由350 nm 增加至950 nm（圖9B）。ECLIS具有較高的縱向空間分辨率，為電化學(xué)發(fā)光機(jī)理的研究提供了新思路。

圖9 電化學(xué)發(fā)光自干涉光譜的原理（左）及實(shí)驗(yàn)裝置（右）示意圖（A），以Au/SiO2/Si 電極作為工作電極，施加電位為1.2 V，在1 μmol/L Ru(bpy) 23 +/60 mmol/L TPrA（黑線）和1mmol/L Ru(bpy) 23 +/30 mmol/L TPrA（紅線）（0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）中測得的歸一化ECL自干涉光譜（B）［56］Fig.9 Schematic illustration of principle（left）and experimental setup（right）for ECL self-interference spectroscopy（A），normalized ECL self-interference spectra obtained using a Au/SiO2/Si electrode in phosphate buffer（0.2 mol/L，pH 7.4）containing 1 μmol/L Ru(bpy) 23 +/60 mmol/L TPrA（black curve）and 1 mmol/L Ru(bpy) 23 +/30 mmol/L TPrA（red curve）at applied potential of 1.2 V（B）［56］

3 總結(jié)與展望

ECL具有背景信號低、時(shí)空可控性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)勢。Ru(bpy)2+3作為最經(jīng)典的ECL發(fā)光體，基于其的ECL 體系已在生化分析、生物成像、臨床診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。雖然對Ru(bpy)2+3體系發(fā)光機(jī)理的研究已持續(xù)了很多年，湮滅型ECL 和共反應(yīng)劑型ECL 路徑也已提出很多年，但目前仍未在實(shí)驗(yàn)上得到直接證明，對Ru(bpy)2+3體系發(fā)光機(jī)理的理解仍不十分清楚，尤其是共反應(yīng)劑型ECL，涉及的反應(yīng)過程較為復(fù)雜，反應(yīng)中間體的壽命較短，對不同條件下的反應(yīng)機(jī)理尚無明確定論。目前常用的電化學(xué)發(fā)光分析方法測量的大多為電極表面的整體平均信息（如發(fā)光強(qiáng)度），缺少空間分辨信息，無法準(zhǔn)確揭示反應(yīng)機(jī)理。而空間分辨測量能夠直接得到電極表面附近Ru(bpy)2+*3或者共反應(yīng)劑自由基的分布，是最簡單、高效的解析發(fā)光機(jī)理的方法之一。目前，而空間分辨測量主要基于SECM 和ECLM，但SECM使用的探針可能會干擾初始的ECL體系，使測量的結(jié)果偏離真實(shí)值；而ECLM則受限于光學(xué)衍射極限，分辨率仍停留在亞微米水平。ECLIS 是一種靈敏度更高的分析方法，具有納米級的縱向空間分辨率，有望實(shí)現(xiàn)發(fā)光層厚度的準(zhǔn)確測量，進(jìn)而解析發(fā)光機(jī)理。此外，將ECL 與質(zhì)譜、電子自旋共振技術(shù)結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)對反應(yīng)中間體的直接測量，進(jìn)而解析發(fā)光機(jī)理。

ECL 是目前生化分析中最先進(jìn)的檢測技術(shù)之一，而對Ru(bpy)2+3/TPrA 這一經(jīng)典體系機(jī)理的解析也是目前最為重要的研究方向之一。闡明ECL 的機(jī)理，除了可提高其分析檢測性能外，對設(shè)計(jì)高效的發(fā)光分子、篩選合適的共反應(yīng)劑、調(diào)控發(fā)光層厚度和設(shè)計(jì)新型電化學(xué)發(fā)光傳感器也具有指導(dǎo)性意義，亦有助于拓寬其在生物傳感、發(fā)光器件、核酸檢測、免疫分析、環(huán)境監(jiān)測等研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。