基于多源數(shù)據(jù)融合技術(shù)的鹽酸青藤堿制備工藝一致性評價(jià)方法研究

吳思俊，王 龍，吳紅根，賀興立，仇 萍，李 正，李文龍*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 省部共建組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；3.湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，湖南 懷化 418000）

鹽酸青藤堿是從防己科植物青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.）以及毛青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils. var. cinereum Rehd. et Wils. ）的干燥藤莖中提取制備的生物堿單體，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、抗炎等多種藥理作用［1］。因具有療效確切、副作用較小等明顯優(yōu)勢，近些年來，以鹽酸青藤堿為活性藥物成分的制劑，如片劑、注射劑及外用制劑等，已被廣泛用于治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾?。?］。

青藤堿微溶于水，在制備過程中往往需要借助有機(jī)溶劑輔助提取。目前，工業(yè)生產(chǎn)鹽酸青藤堿多使用堿化水提取工藝，即藥材中加入水及一定量的熟石灰，堿化一段時(shí)間后加入一定量工業(yè)苯，回流提取，最后酸化、靜置、析晶。然而，苯為一級有毒溶劑，對人體危害極大，而且在溶劑的回收處理方面需通過繁鎖的工藝方能達(dá)到環(huán)保要求，在一定程度上增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本。因此，從尋找替代溶劑的角度出發(fā)，對提取工藝進(jìn)行適當(dāng)變更是非常必要的。然而，在藥品生產(chǎn)過程中更改工藝需嚴(yán)格按照法規(guī)要求進(jìn)行。2017 年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局組織制定了《已上市中藥生產(chǎn)工藝變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［3］，規(guī)定在不影響藥品安全性、有效性和質(zhì)量可控性的前提之下，可以考慮工藝變更。目前，鹽酸青藤堿制備工藝明確且較為固定，不同廠家生產(chǎn)的鹽酸青藤堿的純度基本都能達(dá)到98%以上。在這種情況下，產(chǎn)品質(zhì)量差異往往是受剩下的不到2%的雜質(zhì)所影響。但中藥是一個(gè)極其復(fù)雜的體系，由于藥材自身質(zhì)量的波動(dòng)性和不同廠家工藝過程控制水平的參差不齊，依靠傳統(tǒng)的分析技術(shù)（液相色譜、質(zhì)譜等）難以鑒別原料中所有雜質(zhì)的種類［4-5］。產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是：①中藥產(chǎn)品中雜質(zhì)含量較低，當(dāng)某些雜質(zhì)含量低于儀器檢測限時(shí)，無法獲得相關(guān)信號；②高效液相色譜多用于檢測具有紫外吸收的化合物，當(dāng)雜質(zhì)不具有紫外吸收時(shí)無法被成功檢測；③雜質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且種類繁多，當(dāng)缺少標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)難以實(shí)現(xiàn)定性定量分析。而缺少產(chǎn)品雜質(zhì)信息，則難以進(jìn)行原料整體質(zhì)量評價(jià)，要實(shí)現(xiàn)工藝變更更是無從談起。因此，獲取產(chǎn)品雜質(zhì)信息需要借助其他的分析技術(shù)。近紅外（Near-infrared，NIR）光譜技術(shù)因快速、無損、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已在眾多領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。NIR 光譜記錄的含氫基團(tuán)（C—H，O—H，N—H 等）的倍頻和合頻吸收峰，往往用于反映待測物的整體信息［6-8］。拉曼光譜（Raman spectroscopy，RS）技術(shù)則主要用于研究晶格和分子的振動(dòng)模式、轉(zhuǎn)動(dòng)模式以及在某一系統(tǒng)中的其他低頻模式，能夠分析出化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，與NIR 光譜有一定的互補(bǔ)性［9-10］。多源數(shù)據(jù)融合技術(shù)指對來自多種分析儀器的信號進(jìn)行多級別、多方面、多層次的處理，在一定準(zhǔn)則下加以分析、綜合，產(chǎn)生新的有意義的信息，以彌補(bǔ)單一來源分析信號信息量不足的缺點(diǎn)［11-13］。如將鹽酸青藤堿原料的兩種光譜信息進(jìn)行融合，即可獲得既包含活性成分信息和雜質(zhì)信息，又包含成分分子結(jié)構(gòu)信息的綜合數(shù)據(jù)，利用該數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量綜合評價(jià)具有理論上的可行性和實(shí)踐上的可操作性［14］。

本研究收集了不同廠家分別利用苯和氯仿生產(chǎn)的鹽酸青藤堿樣品，同時(shí)采集樣品的NIR 光譜和Raman 光譜，分別采用不同水平的數(shù)據(jù)融合策略對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用相似度匹配值（Similarity match value，SMV）、Hotelling T2和DModX 3 種統(tǒng)計(jì)量對樣品間的質(zhì)量差異進(jìn)行表征，旨在開發(fā)一種用于評價(jià)工藝變更前后產(chǎn)品質(zhì)量的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國），配有TQ Analyst 8.0 數(shù)據(jù)處理軟件；DXR顯微拉曼光譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，瑞士）。

從A 公司購買的酸水滲漉-氯仿萃取后制得的鹽酸青藤堿樣品（含量大于98%），共32 批，編號1 ～32；從B 公司購買的苯提取后制得的鹽酸青藤堿樣品（含量大于98%）共20 批，編號33 ～52；從C 公司購買的酸水滲漉-氯仿萃取后制得的鹽酸青藤堿樣品（含量大于98%）共20 批，編號53 ～72。

1.2 樣品質(zhì)量評價(jià)方法

1.2.1 相似度匹配模型建立 運(yùn)用Kennard-Stone 算法從32 份A 公司樣品中選取16 份作為校正集，剩下的16 份作為驗(yàn)證集。運(yùn)用TQ Analyst 8.0 軟件建立相似度匹配模型，然后利用模型進(jìn)行驗(yàn)證集SMV預(yù)測，根據(jù)模型預(yù)測出的SMV確定閥值。閥值確定原則：如果驗(yàn)證集SMV為正態(tài)分布，則可根據(jù)統(tǒng)計(jì)過程控制中的3σ原則確定閾值，即將閾值設(shè)置為SMV的平均值減去3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。待模型建立并確定閥值后，即可用于評估待測樣品與建模樣品的質(zhì)量差異。如果待測樣品的SMV 大于或等于閾值，則認(rèn)為樣品與A 公司樣品質(zhì)量一致性良好，相反，如果其SMV 小于閥值，則認(rèn)為兩者質(zhì)量差異較大［15-16］。

1.2.2 Hotelling T2與DModX 值 在中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制研究中，除將SMV 作為質(zhì)量一致性判別指標(biāo)外，還常常使用主成分分析（Principal component analysis，PCA）模型的統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。利用A公司的32批樣品建立PCA 模型，計(jì)算樣品的Hotelling T2和DModX 統(tǒng)計(jì)量數(shù)值并求得控制限。Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量由所有主成分的歸一化得分累加得到，指樣品偏離模型中心的距離，反映了模型內(nèi)部數(shù)據(jù)變化的程度［17］。樣品k的Hotelling T2可由如下公式表示：

式中，λA表示數(shù)據(jù)矩陣前A個(gè)主成分對應(yīng)的特征值組成的對角矩陣，Tk是第k個(gè)主成分的得分向量。

計(jì)算Hotelling T2的控制限是構(gòu)建T2控制圖的重要環(huán)節(jié)，該值根據(jù)F分布計(jì)算得到，計(jì)算公式如下：

其中，I為訓(xùn)練集批次數(shù)，A為主成分?jǐn)?shù)。Fα（A，I-A）表示置信度為α，第一自由度為A，第二自由度為I-A時(shí)F的臨界值。

而DModX 統(tǒng)計(jì)量則主要用來監(jiān)測輸入的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，反映樣品偏離模型的絕對距離，是一種衡量模型外部數(shù)據(jù)變化程度的度量［18］。當(dāng)Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量不能監(jiān)測到樣品發(fā)生的異常變化時(shí)，常使用DModX統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行監(jiān)測。樣品k的DModX可由下式表示：

式中，en為變量xn初始值的殘差，Xnk是變量xn的估計(jì)值。DModX統(tǒng)計(jì)量的控制限可由（4）式計(jì)算：

需要注意的是，在評判待測樣品與A 公司樣品間的差異時(shí)，往往需將Hotelling T2與DModX 兩種統(tǒng)計(jì)量相互結(jié)合、綜合分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 近紅外光譜采集

每批樣品精密稱取8 g，過200 目標(biāo)準(zhǔn)藥篩（符合2020 版藥典標(biāo)準(zhǔn)）后，對細(xì)粉進(jìn)行NIR 光譜采集。NIR 光譜儀采用積分球漫反射采集模式，以空氣為背景，掃描范圍為4 000 ～10 000 cm-1，分辨率為16 cm-1，掃描次數(shù)為64次。共采集到72張NIR光譜，如圖1A所示。

2.2 拉曼光譜采集

將每批過篩后的細(xì)粉分別精密稱取0.1 g置于Raman光譜儀配備的載玻片上，進(jìn)行Raman光譜的采集。Raman 位移為50 ～3 500 cm-1，激光波長為532 nm，激光能量為10.0，分辨率為2.7 ～4.2 cm-1，樣品曝光時(shí)間為2 s。共采集到72張Raman光譜，如圖1B所示。

圖1 72批鹽酸青藤堿樣品的近紅外原始光譜圖（A）和拉曼原始光譜圖（B）Fig.1 The raw NIR spectra（A）and raw Raman spectra（B）of 72 batches of sinomenine hydrochloride samples

2.3 光譜預(yù)處理及多源數(shù)據(jù)融合

從圖1 中可以看出，NIR 光譜和Raman 光譜均存在明顯的基線漂移，推測可能是由儀器噪聲、環(huán)境變化等因素造成。為消除基線漂移對數(shù)據(jù)分析的干擾，采用Savitzky-Golay 卷積平滑和一階導(dǎo)數(shù)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，處理后的光譜如圖2 所示。經(jīng)過預(yù)處理之后，利用多源數(shù)據(jù)融合技術(shù)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行融合。分別考察了3 種不同水平的數(shù)據(jù)融合方式，第一種融合方式為低水平融合即像素級融合，指在未經(jīng)任何處理的情況下將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行首尾拼接；第二種融合方式為中水平融合即特征級融合，指在對各部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行特征提取后進(jìn)行的數(shù)據(jù)融合；第三種融合方式為高水平融合即決策級融合，指將各部分?jǐn)?shù)據(jù)分別處理并做出判斷，最后對所有決策進(jìn)行融合。對比每種數(shù)據(jù)融合方式下樣品質(zhì)量的差異，從而綜合評判經(jīng)不同溶劑制備的鹽酸青藤堿樣品的質(zhì)量差異，并探究不同水平的數(shù)據(jù)融合策略可能對分析結(jié)果產(chǎn)生的潛在影響。

圖2 經(jīng)Savitzky-Golay卷積平滑和一階導(dǎo)數(shù)處理后的樣品近紅外（A）和拉曼（B）光譜Fig.2 The NIR spectra（A）and Raman spectra（B）of samples pretreated with Savitzky-Golay smoothing combined with first derivative

2.4 基于低水平融合模式的樣品質(zhì)量判別研究

由于NIR 光譜與Raman 光譜的響應(yīng)值差異巨大，且不在一個(gè)度量之下，因此在進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)的首尾拼接之前，需要先進(jìn)行歸一化處理使響應(yīng)值處于同一度量。建立相似度匹配模型，模型對驗(yàn)證集（No. 17 ～32）SMV 的預(yù)測結(jié)果如表1 所示。對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得到P值為0.764，大于0.05，表明結(jié)果符合正態(tài)分布。根據(jù)3σ原則，計(jì)算得到閥值為94.21。利用相似度匹配模型對B 公司和C 公司共40 份樣品進(jìn)行SMV 預(yù)測，結(jié)果如圖3A 所示。從圖中可以看出，40 份樣品的SMV 均大于94.21，表明樣品質(zhì)量與A 公司樣品無明顯差異。然后，利用SIMCA 分析軟件（V14.1，Umetrics 公司，瑞典）建立A 公司樣品的PCA 模型，獲得Hotelling T2和DModX 統(tǒng)計(jì)量及其控制限。最后分別求得40 份樣品的兩種統(tǒng)計(jì)量值，結(jié)果如圖3B 和3C 所示。結(jié)果顯示，所有樣品的Hotelling T2都處于控制限以下。從DModX 控制圖中可以看出，A 公司的32 份樣品中有3份略超出控制限，另兩家公司提供的樣品中均有3份超出了控制限。推測原因在于：①將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行低水平融合可能會包含過多冗余信息，從而對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響；②9份樣品的質(zhì)量可能與A公司樣品存在一定差異。為探究是何種原因造成的這一結(jié)果，將進(jìn)行進(jìn)一步的中水平數(shù)據(jù)融合分析。

表1 相似度匹配模型驗(yàn)證集預(yù)測結(jié)果Table 1 Prediction results of the similarity match model on the validation set

圖3 基于低水平融合模式的鹽酸青藤堿樣品質(zhì)量評價(jià)控制圖Fig.3 The control charts of quality evaluation of sinomenine hydrochloride samples based on low level fusion mode

2.5 基于中水平融合模式的樣品質(zhì)量判別研究

由于算法可解釋性強(qiáng)、所建模型性能穩(wěn)健等優(yōu)勢，中水平融合模式是數(shù)據(jù)融合研究中使用最為頻繁的方式之一。在本研究中，為提取光譜信息中的特征信息，利用主成分分析法對NIR 和Raman光譜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行降維處理。結(jié)果顯示：針對NIR 光譜數(shù)據(jù)，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)設(shè)置為13 時(shí)，能解釋光譜變量間95%以上的差異；針對Raman 光譜數(shù)據(jù)，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)設(shè)置為22 時(shí)，能解釋變量間95%以上的差異。當(dāng)主成分能解釋原始數(shù)據(jù)95%以上的差異時(shí)，即具有良好的數(shù)據(jù)代表性。本研究將提取的主成分進(jìn)行融合，最終得到35 維的特征數(shù)據(jù)。利用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)建立相似度匹配模型后，對驗(yàn)證集SMV 進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表2 所示。對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得到P值為0.947，大于0.05，因此數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。根據(jù)3σ原則，計(jì)算得到SMV 閥值為93.23。利用相似度匹配模型對40 份樣品的SMV 進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第52 份樣品的SMV 低于控制限，其余樣品的SMV 均在控制限之上。另外，所有樣品的Hotelling T2和DModX 統(tǒng)計(jì)量數(shù)值均在控制限之下。與低水平融合模式結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)，通過提取數(shù)據(jù)特征的方式可以有效剔除冗余信息的干擾，40 份待測樣品中有39 份與A 公司樣品無明顯質(zhì)量差異。而第52 份樣品可能存在質(zhì)量問題，需要利用其它手段進(jìn)行單獨(dú)檢測。

表2 相似度匹配模型驗(yàn)證集預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results of the similarity match model on the validation set

2.6 基于高水平融合模式的樣品質(zhì)量判別研究

高水平融合又稱決策級融合，當(dāng)所檢產(chǎn)品附加值高，或會因質(zhì)量不合格而對人體健康、經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生重大影響時(shí)，往往使用高水平融合模式。首先，利用NIR 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量分析。建立基于NIR光譜的相似度匹配模型，模型對驗(yàn)證集的預(yù)測結(jié)果如表3所示。對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得到P值為0.550，大于0.05，因此數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。根據(jù)3σ原則，計(jì)算得到SMV閥值為93.64。由圖4的控制圖可以看出，第38 和第52 份的SMV 在控制限以下，第42 份的DModX 統(tǒng)計(jì)量超過控制限。因此，需要對這3份問題樣品進(jìn)行單獨(dú)質(zhì)量檢測。而在A 公司樣品中，第1 和第27 份樣品的DModX 統(tǒng)計(jì)量超出控制限，在低水平融合分析中同樣出現(xiàn)了A 公司樣品DModX 數(shù)值超出控制限的現(xiàn)象，而在中水平融合分析中則未出現(xiàn)該現(xiàn)象。推測原因可能是，在未進(jìn)行特征信息提取時(shí)冗余信息對數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生了影響。

表3 基于NIR光譜數(shù)據(jù)的相似度匹配模型驗(yàn)證集預(yù)測結(jié)果Table 3 Prediction results of the similarity match model on the validation set based on NIR spectral data

圖4 基于NIR光譜數(shù)據(jù)的鹽酸青藤堿樣品質(zhì)量評價(jià)控制Fig.4 The control charts of quality evaluation of sinomenine hydrochloride samples based on NIR spectral data

利用NIR 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量分析后，對樣品的Raman 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析。表4 中列出了基于拉曼光譜的相似度匹配模型對驗(yàn)證集SMV的預(yù)測結(jié)果，對結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得到P值為0.384，大于0.05，因此數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，最終求得A 公司樣品的SMV 閥值為94.24。計(jì)算所有樣品的3 種統(tǒng)計(jì)量，并描繪出控制圖。從圖5 中可以看出，第40份樣品的SMV處于控制限以下，第3和第17 份樣品的DModX 統(tǒng)計(jì)量值超出控制限。結(jié)合基于NIR 光譜數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，第1、3、17、27、38、40、42、52份樣品需要進(jìn)行仲裁分析來判斷是否為異常樣品。從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，由于兩種光譜信息所包含的樣品信息不同，當(dāng)單獨(dú)使用NIR光譜數(shù)據(jù)或Raman光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，判別出的問題樣品各不相同。此時(shí)，運(yùn)用決策級融合即可有效避免問題樣品的遺漏，為產(chǎn)品質(zhì)量一致性提供保證。

表4 基于拉曼光譜數(shù)據(jù)的相似度匹配模型驗(yàn)證集預(yù)測結(jié)果Table 4 Prediction results of the similarity match model on the validation set based on Raman spectral data

圖5 基于Raman光譜數(shù)據(jù)的鹽酸青藤堿樣品質(zhì)量評價(jià)控制Fig.5 The control charts of quality evaluation of sinomenine hydrochloride samples based on Raman spectral data

在本研究中，低水平融合方式和高水平融合方式所判斷出的問題樣品出入較大，而通過中水平融合方式判斷出的問題樣品被包含于高水平融合判別出的問題樣品中。實(shí)際上，在應(yīng)用數(shù)據(jù)融合技術(shù)時(shí)，需要根據(jù)數(shù)據(jù)特征合理選擇融合水平。低水平融合方式方便快捷，不需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行任何處理即可進(jìn)行融合分析，但當(dāng)數(shù)據(jù)維度高且可能包含一定量的冗余信息時(shí)，這種數(shù)據(jù)融合方式往往不適用。此時(shí)，中水平融合方式可以被考慮用于數(shù)據(jù)分析，其復(fù)雜程度雖然比低水平融合方式高，但能有效剔除冗余信息的干擾，提取出關(guān)鍵信息。高水平融合方式最為復(fù)雜，需要利用不同來源數(shù)據(jù)進(jìn)行單獨(dú)分析后產(chǎn)生統(tǒng)籌結(jié)果。在進(jìn)行高附加值樣品或毒副作用較強(qiáng)樣品的質(zhì)量控制時(shí)，一般使用高水平融合方式。

3 結(jié) 論

本研究利用NIR 光譜技術(shù)、Raman 光譜技術(shù)結(jié)合多源數(shù)據(jù)融合技術(shù)，提出了一種用于中藥產(chǎn)品制備工藝變更前后質(zhì)量一致性評價(jià)的新策略。研究發(fā)現(xiàn)，在低、中、高3 種數(shù)據(jù)融合模式下，除個(gè)別鹽酸青藤堿樣品需要仲裁分析進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn)外，苯提取和酸水滲漉-氯仿萃取后所制得的鹽酸青藤堿樣品的質(zhì)量無顯著差異。在鹽酸青藤堿生產(chǎn)過程中，酸水滲漉-氯仿萃取有望有效替代苯提取，對降低生產(chǎn)成本和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。