SUMO化蛋白質(zhì)組的富集策略研究進展

李 洋，單亦初，梁 振*，張麗華，張玉奎

（1.中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.寧波大學(xué) 新藥技術(shù)研究院，浙江 寧波 315211）

小泛素相關(guān)修飾物（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）是一類分子量約為11 kDa，高度保守的類泛素蛋白［1-3］。在哺乳動物中，SUMO 存在5 種旁系同源物［4-6］，研究較多的是SUMO1、SUMO2 和SUMO3。其中，SUMO2 與SUMO3 的氨基酸序列有97%的相似性，而與SUMO1 只有50%的相似性，因此通常將其合并為SUMO2/3來進行研究［7］。SUMO與底物蛋白的結(jié)合依賴于E1活化酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶的多步催化反應(yīng)，而生物體內(nèi)多種SUMO特異性蛋白酶（SUMO/sentrin-specific proteases，SENPs）的存在使SUMO化修飾處于高度動態(tài)變化的可逆過程［8-10］。許多被SUMO修飾的底物蛋白都具有一致性序列（Consensus motif）ΨKxD/E（Ψ 代表疏水性氨基酸，K 代表賴氨酸，D/E 代表天冬氨酸/谷氨酸，x 代表任何氨基酸）［11］，還有些修飾位點遵循反向的motif（E/D-x-K）［12］。蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾影響了諸多生理和病理過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)、自身免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等［13-16］，因此，參與SUMO化過程的相關(guān)底物和蛋白酶是臨床治療疾病和癌癥的重要藥物靶標［17-19］。

為了更全面地揭示SUMO 化修飾發(fā)揮的生理和病理功能，在蛋白質(zhì)組水平對SUMO 化蛋白及其位點進行深度覆蓋分析至關(guān)重要［20］。然而，規(guī)?；治霾溉閯游锛毎械腟UMO化位點仍存在巨大挑戰(zhàn)。一方面是由于SUMO 化蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的存在豐度較低，且高活性的去SUMO 化酶使SUMO 化修飾極不穩(wěn)定；另一方面是在采用自下而上（Bottom-up）的蛋白質(zhì)組策略時，SUMO1 和SUMO2/3 的C 端由于缺少精氨酸和賴氨酸，當被胰蛋白酶酶切后，殘留在底物肽段上的SUMO1和SUMO2/3修飾分別含有19和32個氨基酸，如此冗長的序列會導(dǎo)致其修飾位點難以被質(zhì)譜檢測分析，從而影響SUMO 化蛋白質(zhì)組的分析覆蓋度。因此，發(fā)展高效的富集方法對SUMO 化蛋白質(zhì)組的深度覆蓋分析至關(guān)重要。本文針對外源性和內(nèi)源性的SUMO化蛋白質(zhì)組富集方法的原理、特點及最新進展進行了綜述。

1 外源性SUMO化蛋白質(zhì)組的富集方法

為了提高對低豐度SUMO 化蛋白質(zhì)的富集效率，最有效的方法是發(fā)展針對外源性SUMO 化蛋白質(zhì)組的富集方法，即構(gòu)建可以穩(wěn)定表達帶親和富集標簽的外源性SUMO 蛋白的細胞系。常用的富集標簽有組氨酸（His）［12，21-24］、血球凝集素（HA）［25］和Flag 標簽［26］。其中，His 標簽因為分子量小，在SUMO 上表達幾乎不影響SUMO與底物蛋白的結(jié)合特異性，且在變性環(huán)境下，攜帶His標簽的SUMO化蛋白仍能被Ni2+親和材料高效捕獲，因而被廣泛使用。

1.1 蛋白質(zhì)水平的富集

Galisson 等［21］利用Ni2+親和色譜富集HEK293 細胞中表達的外源性His6-SUMO1/2/3 修飾的底物蛋白。同時，為了使胰蛋白酶酶解后SUMO 化肽段的長度更利于質(zhì)譜檢測，分別對His6-SUMO1Q92R、His6-SUMO2Q88R和His6-SUMO3Q87R/Q88N的特定位點進行突變，使酶解后殘留在底物肽段上的氨基酸分別減少為EQTGG-、QQTGG-、NQTGG-，再結(jié)合無標定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，在經(jīng)As2O3處理的細胞中共鑒定到17個精確的SUMO化位點，對應(yīng)于12個SUMO修飾的底物蛋白質(zhì)。

為了避免對氨基酸進行突變，Hendriks等［27］發(fā)展了一種基于去SUMO化酶的外源性SUMO化位點鑒定方法（簡稱PRISM）。該方法在封閉其余非SUMO 化賴氨酸側(cè)鏈氨基的前提下，利用去SUMO 化酶（SENP2）選擇性切除底物蛋白質(zhì)上的SUMO 修飾，使去SUMO 化的賴氨酸位點暴露特征性的氨基基團，實現(xiàn)對SUMO 化位點的準確鑒定。作者首先在蛋白質(zhì)水平利用Ni2+親和色譜對His10-SUMO2 修飾的蛋白質(zhì)進行純化，再對富集所得蛋白質(zhì)進行乙?；忾]、去SUMO 化、胰蛋白酶酶解和質(zhì)譜鑒定，最終從HeLa 細胞中鑒定到751 個SUMO 化位點。該方法避免了冗長的SUMO 修飾給質(zhì)譜鑒定造成的困難，但被乙酰化封閉后的賴氨酸無法被胰蛋白酶酶切將導(dǎo)致肽段最終長度較長，并且需要嚴格控制蛋白質(zhì)水平的乙?；磻?yīng)不完全給SUMO位點鑒定帶來的假陽性。

1.2 肽段水平的富集

在蛋白質(zhì)水平進行富集，當?shù)鞍踪|(zhì)被酶解成肽段后會產(chǎn)生大量非SUMO 化肽段，對SUMO 化肽段的分析造成干擾，從而影響SUMO 化位點的鑒定覆蓋度。因此，研究人員進一步開發(fā)了可以特異性識別酶切后留在底物肽段上的SUMO 殘基序列的抗體，以實現(xiàn)對SUMO 化位點在肽段水平的二次富集。例如，Impensa 等［28］將SUMO1 和SUMO2 的基因分別改造為His6-SUMO1T95R和His6-SUMO2T91R，先在蛋白水平富集His6-SUMO 修飾底物，再使胰蛋白酶酶切后的SUMO 位點產(chǎn)生雙甘氨酸殘基GG-，接著利用泛素化抗體（antiK-ε-GG）對其進行特異性富集，最終鑒定到295 個SUMO1位點和167 個SUMO2位點。但是胰蛋白酶酶切后的泛素化位點也有GG-修飾，給鑒定結(jié)果帶來了假陽性。Lamoliatte 等［22］開發(fā)了一種可以特異性識別His6-SUMO3Q87R/Q88N被胰蛋白酶酶切后留在底物肽段上的氨基酸殘基（NQTGG-）的抗體，通過蛋白和肽段水平的兩次富集在HEK293 細胞中鑒定到了954 個SUMO3 位點，有效避免了泛素化位點帶來的假陽性問題。隨后作者在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化了免疫沉淀的孵育和洗脫條件，采用更靈敏的高分辨率質(zhì)譜并優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)合SCX/RP二維色譜分級策略，從HEK293細胞中鑒定到一萬個SUMO3 位點［29］。類似的方法還有將SUMO2 基因改造為His6-SUMO2T90K，分別利用Ni-NTA 和K-ε-GG 抗體對Lys-C或Lys-C+Glu-C酶切前后的SUMO 修飾底物進行兩次富集，鑒定到1 000 個SUMO 位點［24］，該方法用Glu-C 取代胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶酶切后泛素化位點造成的假陽性。

除了上述方法，Vertegaal 課題組還開發(fā)了基于K0 方法的His-SUMO2 位點富集方法，主要原理是將SUMO 分子上的所有賴氨酸（K）突變?yōu)榫彼幔≧），由此經(jīng)過Lys-C酶切后的SUMO分子依然具有完整序列且攜帶His 標簽，利用Ni 柱分別在蛋白和肽段水平對His-SUMO2 修飾底物進行兩次富集，即可提高對SUMO 位點的富集效率。該課題組最初將SUMO2 基因改造為His6-SUMO2K0T90R，利用Ni 柱對Lys-C 酶切前后的SUMO 化蛋白/肽段進行二次富集，再用胰蛋白酶將SUMO 從底物肽段上切除，只留下GG-殘基，質(zhì)譜分析后共鑒定到103 個SUMO2 位點［12］。然而，該方法同樣存在泛素化位點造成的假陽性問題。因此，該課題組進一步將SUMO2基因改造為His10-SUMO2K0Q87R，同樣利用Ni柱對Lys-C酶切前后的His10-SUMO 修飾底物進行兩次富集，再利用胰蛋白酶酶切后留在底物肽段上的SUMO 殘基序列（QQTGG-）對SUMO位點進行質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索，從人源細胞中鑒定到了4 300個SUMO化位點［23］，優(yōu)化后的方法不僅避免了泛素化位點帶來的假陽性干擾，而且表達的His10-標簽進一步提高了富集效率。在此之后，該課題組進一步將K0方法用于對多種人源細胞系多個細胞刺激條件下His10-SUMO2K0Q87R修飾位點的大規(guī)模富集，并結(jié)合高pH C18反相分級策略，共鑒定到40 765 個SUMO2 位點，對應(yīng)6 747 個蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了對人源細胞中外源性SUMO2 位點的深度覆蓋和全面分析［30］。但是，基于K0的富集方法也存在弊端，將SUMO2上的所有K突變?yōu)镽后，突變前K位點上的各種翻譯后修飾信息將被丟失，包括重要的多聚SUMO化鏈的形成。

2 內(nèi)源性SUMO化蛋白質(zhì)組的富集方法

盡管針對外源性SUMO 化蛋白質(zhì)組目前已經(jīng)報道了上萬個SUMO 化位點，但是將含有富集標簽且氨基酸突變的外源性SUMO 引入生物體內(nèi)，不僅無法準確反映SUMO 化修飾在生物體內(nèi)的真實表達水平，而且不能用于實際的臨床和組織樣品的分析。因此，發(fā)展可以特異性富集內(nèi)源性SUMO 化修飾底物并對內(nèi)源性SUMO化肽段進行有效鑒定的蛋白質(zhì)組樣品預(yù)處理方法是當前該領(lǐng)域的研究熱點和難點。

2.1 蛋白質(zhì)水平的富集

受限于抗體技術(shù)的發(fā)展，研究人員最初僅針對SUMO 蛋白研發(fā)相應(yīng)的抗體，并在蛋白質(zhì)水平對SUMO 修飾底物進行富集。Matafora 等［31］將經(jīng)過蛋白酶抑制劑MG132 處理的HeLa 細胞進行細胞核蛋白提取，再利用SUMO1抗體對其進行免疫共沉淀（IP），酶解后進行質(zhì)譜分析，從中鑒定到193個SUMO1化蛋白質(zhì)。此后，Becker 等［32］利用兩個已知的SUMO1 和SUMO2/3 的單克隆抗體（SUMO1 21C7 和SUMO2 8A2），在對IP 的洗脫條件進行優(yōu)化后，將富集的蛋白進行胰蛋白酶酶解和質(zhì)譜鑒定，從HeLa細胞中共富集到1 000多個蛋白質(zhì)，通過嚴格的數(shù)據(jù)篩選去除其中的非特異吸附蛋白，最終得到232個高可信的SUMO候選蛋白。然而以上研究均未對富集到的SUMO化蛋白的具體位點信息進行報道。

2.2 肽段水平的富集

僅在蛋白質(zhì)水平富集內(nèi)源性SUMO 化修飾底物無法對內(nèi)源性SUMO 位點進行深度覆蓋，一方面，抗體富集后的蛋白樣品中仍然存在很多非特異性吸附蛋白的干擾，另一方面，酶解后產(chǎn)生的大量非SUMO化肽段會顯著抑制SUMO化肽段的質(zhì)譜響應(yīng)。基于此，針對內(nèi)源性SUMO化肽段的抗體富集策略在最近幾年受到廣泛關(guān)注。

2017 年，Lumpkin 等［33］利用α-溶菌酶（WaLP）能夠特異性酶切蘇氨酸（T）殘基［34］，使經(jīng)過WaLP 酶切后留在底物肽段上的SUMO1/2/3 修飾只有GG-，并利用泛素化抗體（anti K-ε-GG）實現(xiàn)了對內(nèi)源性SUMO1/2/3化肽段的同時富集，從人源細胞中鑒定到1 209個內(nèi)源性SUMO 化位點。然而，該方法也存在一些不足，如WaLP 的酶切特異性不高，泛素化位點上的精氨酸被WaLP 酶切后產(chǎn)生的GG-殘基將對鑒定結(jié)果產(chǎn)生假陽性干擾；且該方法無法區(qū)分鑒定到的SUMO化修飾的類別。同年，Cai等［35］開發(fā)了一種特異性識別SUMO1 被胰蛋白酶酶切后留在底物肽段上的氨基酸殘基的泛-SUMO1 抗體，并在肽段水平對SUMO1 修飾底物進行富集，再利用Glu-C 對SUMO1 化肽段進行二次酶切以降低肽段長度，最后從小鼠睪丸中鑒定到了53個高可信的SUMO1位點。2018年，Hendriks等［36］發(fā)展了利用抗體在肽段水平富集內(nèi)源性SUMO2/3 修飾位點的策略。他們利用可以特異性識別SUMO2/3 被Lys-C 酶切后留在底物肽段上的氨基酸殘基的SUMO2/3 抗體（SUMO2/3 8A2）富集SUMO2/3 化肽段，并進一步采用Asp-N二次酶切和高pH C18反相分級策略提高內(nèi)源性SUMO2/3位點的鑒定覆蓋度，從正常生長、熱休克和MG132 刺激的人源HEK293 細胞中鑒定到14 869 個SUMO2/3 位點和3 870 個內(nèi)源性SUMO 化蛋白，是目前報道的內(nèi)源性SUMO2/3化位點的最大數(shù)據(jù)集。

目前采用免疫沉淀的抗體富集策略已覆蓋到哺乳動物中一萬多個SUMO 化位點，3 000多個底物蛋白。然而，抗體方法由于自身特性往往只局限于一類SUMO 化修飾的富集，難以實現(xiàn)樣品中所有SUMO 化修飾的同時富集和分析。針對上述問題，本課題組［37］利用胰蛋白酶酶切后的SUMO 化肽段與非SUMO 化肽段在堿性條件下帶電性質(zhì)的差異，發(fā)展了一種基于強陰離子交換（SAX）色譜分離的內(nèi)源性SUMO 化肽段富集方法，實現(xiàn)了對人源細胞中多種類型SUMO 化修飾的同時富集。此外，還通過采用Asp-N/Glu-C 二次酶切降低SUMO 化肽段長度，提高了質(zhì)譜對SUMO 化肽段的鑒定效率；進一步結(jié)合二維高低pH RPLC-ESI-MS/MS 分析技術(shù)，從HeLa 細胞的酶解產(chǎn)物中富集到了177 個內(nèi)源性SUMO1位點和74個內(nèi)源性SUMO2/3位點。

3 展 望

隨著基因工程和抗體等富集技術(shù)的不斷發(fā)展，針對外源性SUMO 化修飾位點的規(guī)?；b定已經(jīng)日趨完善。然而，只有內(nèi)源性的SUMO 化修飾才能真實反映實際細胞/組織樣品中SUMO 的表達水平和動態(tài)變化。相比于其他翻譯后修飾，內(nèi)源性SUMO 化修飾的覆蓋深度遠未達到研究的需要。因此，發(fā)展針對內(nèi)源性SUMO 化位點的高通量富集方法仍是當前SUMO 化蛋白質(zhì)組學(xué)的首要任務(wù)。此外，目前亟需開發(fā)專門針對SUMO 化位點鑒定的數(shù)據(jù)庫檢索軟件。隨著富集方法的不斷創(chuàng)新、高靈敏質(zhì)譜和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對SUMO 化修飾的認識會更加深入，SUMO 化蛋白質(zhì)組學(xué)也將會為發(fā)現(xiàn)更多關(guān)鍵的疾病標志物和新的治療靶標提供新的方向。