雞蛋中泰妙菌素化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法研究

李 露，楊金易，王 宇，張 政，苑婷婷，肖毅美，徐振林，沈玉棟*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510410；3.深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測認(rèn)證有限公司，廣東 深圳 518000）

泰妙菌素（Tiamulin，TML，圖1）又名泰妙靈，是一種截短側(cè)耳素類抗生素［1-2］，具有和大環(huán)內(nèi)酯類相似的抗菌能力，對細(xì)菌、支原體、螺旋體和霉形體等均有良好的抑菌效果［3-4］，常用于治療雞的慢性呼吸道疾病、豬的瘧疾和支原體引起的各種畜禽疾?。?］。然而，泰妙菌素通過食物鏈富集于人體內(nèi)可能會增加患癌風(fēng)險，導(dǎo)致胚胎畸性或突變的情況發(fā)生，對人類健康造成潛在危害［6-7］。我國2019 年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定泰妙菌素在雞蛋中的殘留限量為1 mg/kg［8］。蛋類是非常優(yōu)質(zhì)的、人們?nèi)粘４罅肯M(fèi)的高營養(yǎng)食品，不少商家為提高養(yǎng)殖收益，過量、頻繁或不遵守休藥期違規(guī)使用泰妙菌素進(jìn)行養(yǎng)殖，造成殘留超標(biāo)問題突出［9］，威脅著人們的身體健康。因此，開發(fā)靈敏、準(zhǔn)確且快速的篩查方法對監(jiān)管雞蛋中泰妙菌素的殘留至關(guān)重要。

圖1 泰妙菌素及其半抗原泰妙菌素肟（TMLO）結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of tiamulin and hapten TMLO

目前，針對泰妙菌素殘留的檢測方法以色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器確證技術(shù)為主［10-12］，這些方法可準(zhǔn)確地對藥物進(jìn)行定量檢測，靈敏度高、檢測結(jié)果可靠，但是前處理復(fù)雜，耗時耗力，操作專業(yè)性強(qiáng)，難以實現(xiàn)高通量現(xiàn)場篩查。免疫分析方法相比于儀器法具有前處理過程簡單、檢測時間短、成本低、樣品通量高等優(yōu)點，與大型儀器確證方法優(yōu)勢互補(bǔ)，可顯著提高畜禽產(chǎn)品及飼料獸藥殘留的檢測效率［13-15］?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析方法（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA），是以魯米諾等化學(xué)發(fā)光底物為信號探針模式發(fā)展起來的超靈敏免疫分析技術(shù)［16］，其原理主要是通過辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）催化H2O2釋放出活性氧，氧化誘導(dǎo)底物魯米諾為激發(fā)態(tài)，當(dāng)其電子從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時，釋放出光子信號進(jìn)行檢測。該法具有靈敏度高、無背景化學(xué)發(fā)光信號干擾等突出優(yōu)勢［17］，已在醫(yī)療診斷、環(huán)境與食品安全檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用與發(fā)展［18-19］。目前，針對食品中泰妙菌素殘留的CLEIA 方法未見報道。因此，本研究擬通過半抗原設(shè)計合成、動物免疫與細(xì)胞融合技術(shù)制備高質(zhì)量抗泰妙菌素單克隆抗體，并結(jié)合魯米諾底物化學(xué)發(fā)光信號探針建立快速檢測泰妙菌素的CLEIA方法，旨在為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SpectraMax I3x連續(xù)波長多功能微孔板檢測儀（美國Molecular Devices 公司）；AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；U3010 微量紫外可見分光光度儀（美國Thermo 公司）；超低溫高速離心機(jī)（美國Eppenndorf 公司）；DEM-3 型自動洗板機(jī)（北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司）；82-5 控溫磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；TC-2323 CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；CHA倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

泰妙菌素、羅紅霉素、卡那霉素、恩諾沙星等標(biāo)準(zhǔn)品及N，N-二甲基甲酰胺（上海阿拉丁試劑公司）；乳鐵蛋白（LF）、雞卵清白蛋白（OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二環(huán)己基碳亞二胺（DCC）、Freund完全佐劑與不完全佐劑、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（美國Sigma公司）；化學(xué)發(fā)光底物液、化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液（廣州萬聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小鼠骨髓瘤SP2/0（本實驗室保存）；SPF級Balb/c雌性小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原的制備與鑒定 參考文獻(xiàn)［20］，利用TML 分子中的羰基與NHS 縮合形成羧甲基羥肟手臂的半抗原泰妙菌素肟（TMLO）（圖1）。然后，采用活潑酯法［21］將半抗原TMLO 與OVA 載體蛋白偶聯(lián)為包被原TMLO-OVA，與LF 偶聯(lián)為免疫原TMLO-LF，并用紫外吸收光譜掃描載體蛋白、半抗原和人工抗原，以鑒定人工抗原是否合成成功［22］。

1.2.2 單克隆抗體的制備與評價 參考文獻(xiàn)［23］，使用免疫原TMLO-LF 平行免疫3 只健康適齡（6～8周齡左右）的Balb/c雌性小鼠，3次免疫后一周對小鼠尾靜脈采血，取抗血清上清進(jìn)行效價和抑制檢測，選用免疫應(yīng)答最好的小鼠進(jìn)行融合［24-25］，通過亞克隆篩選獲得單克隆細(xì)胞株，并經(jīng)小鼠腹腔注射培養(yǎng)獲得腹水，最后采用蛋白G（Protein G）親和層析純化后保存至-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 CLEIA 方法的建立 參考文獻(xiàn)方法［26］，采用棋盤法選擇合適的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)組合進(jìn)行抑制曲線繪制，并根據(jù)IC50確定最佳包被原質(zhì)量濃度與抗體質(zhì)量濃度；然后，采用單因素實驗優(yōu)化藥物和抗體稀釋液（含吐溫-20 的磷酸緩沖液（PBST）、磷酸緩沖液（PBS）、一級水）、反應(yīng)緩沖溶液PBS離子濃度（0.005、0.01、0.02 mol/L）、酶標(biāo)二抗稀釋液（PBS、PBST、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液Tris-HCl）、酶標(biāo)二抗質(zhì)量濃度（3.33、2.50、2、1.67 μg/mL）及反應(yīng)時間（20、30、40、50 min）等影響因素。最佳反應(yīng)條件應(yīng)具備適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光值（RLU0）、較低的IC50和較高的RLU0/IC50比值。RLU0/IC50越高，IC50越低，則靈敏度越高，綜合最佳反應(yīng)條件建立泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，縱坐標(biāo)B表示添加泰妙菌素時的化學(xué)發(fā)光值、B0表示未添加泰妙菌素時的化學(xué)發(fā)光值，橫坐標(biāo)為靶標(biāo)藥物質(zhì)量濃度。

1.2.4 抗體的特異性 選取泰妙菌素常見結(jié)構(gòu)或功能類似物氧氟沙星、氟羅沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、羅紅霉素、卡那霉素和克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品測定IC50，按以下公式計算交叉反應(yīng)率（CRs）：CRs（%）=［IC50（泰妙菌素）/IC50（類似物）］×100。

1.2.5 加標(biāo)回收實驗 雞蛋樣品前處理步驟：稱取2.0 g 均質(zhì)后的空白樣品置于離心管中，加入2 mL 提取液（pH 7.4 的PBS 與甲醇等體積混合液），渦旋混合5 min 后振蕩30 min。以10 000 r/min 離心10 min，取上層清液稀釋。

采用上述樣品前處理方法處理并消除基質(zhì)干擾后進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，向陰性的實際樣品中添加高、中、低3種濃度的待測藥物，每個濃度做3組平行，計算加標(biāo)回收率。

1.2.6 儀器確證方法比對 參考我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4584-2016［27］的樣品前處理方法進(jìn)行處理，測定實際雞蛋樣品，將測定結(jié)果與所建立的CLEIA方法結(jié)果進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工抗原的制備與鑒定

分子的組成與空間構(gòu)型不同，在紫外區(qū)的光譜也不同。半抗原成功偶聯(lián)載體蛋白后，分子間通過共價鍵產(chǎn)生共軛與電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致峰形或位置發(fā)生一定變化，可根據(jù)該原則判斷人工抗原是否偶聯(lián)成功。UV-Vis 圖譜顯示（圖2），在200～400 nm 的紫外波長范圍內(nèi)，載體蛋白LF 和OVA 在218 nm 和280 nm 左右分別有強(qiáng)弱兩個特征吸收峰，偶聯(lián)半抗原TMLO 后的抗原TMLO-LF和TMLO-OVA 在250～300 nm 之間的峰形與載體蛋白LF 和OVA 顯著不同，說明人工抗原合成成功。另外，“2.2”部分的免疫抗血清評價產(chǎn)生的泰妙菌素的特異性抑制與識別也間接證明抗原合成成功。

圖2 泰妙菌素半抗原、載體蛋白和人工抗原的紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet scanning of haptens，carrier protein and synthesized antigens

2.2 抗血清評價與單克隆抗體制備

抗血清評價結(jié)果顯示，藥物質(zhì)量濃度為1 μg/mL、包被原質(zhì)量濃度為1 μg/mL 時，TMLO-LF 免疫原免疫的2號小鼠抗血清效價為8 k，抑制率為88.3%，效價和抑制率最高，說明該抗血清的親和力好、識別泰妙菌素的能力高，可用于后續(xù)單克隆抗體的制備。小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合后，經(jīng)有限稀釋得到細(xì)胞上清效價/抑制率為10/95.8%的陽性株，通過細(xì)胞體外培養(yǎng)制備腹水，再純化后得到抗體。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過優(yōu)化實驗得到CLEIA 方法的最佳實驗條件為：包被原質(zhì)量濃度0.26 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為0.94 μg/mL，反應(yīng)緩沖體系為0.02 mol/L的PBS（pH 7.4），酶標(biāo)二抗稀釋液為PBST，酶標(biāo)二抗質(zhì)量濃度為2 μg/mL，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為40 min。在該條件下，建立了泰妙菌素的CLEIA 方法，檢出限（LOD，IC10）為0.03 ng/mL，IC50為0.54 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.17～1.74 ng/mL（圖3）。另外，與酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金免疫層析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）相比，本方法具有更高的靈敏度（表1）。

圖3 CLEIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）Fig.3 Dose-response curve for tiamulin by CLEIA（n=3）

表1 泰妙菌素檢測方法比較Table 1 Comparation of the determination methods for tiamulin

2.4 特異性分析

以交叉反應(yīng)（CR）為指標(biāo)，考察了泰妙菌素與其結(jié)構(gòu)功能類似物的特異性，發(fā)現(xiàn)其與類似物不存在明顯交叉反應(yīng)（表2），說明本研究建立的CLEIA方法對泰妙菌素具有良好特異性。

表2 與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)(n=3)Table 2 Cross reactions with tiamulin analogues（n=3）

（續(xù)表2）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)消除

雞蛋樣品經(jīng)“1.2.5”方法前處理后，以PBS稀釋25倍的提取液所繪制的CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線與用PBS所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本吻合，說明基本消除了基質(zhì)對CLEIA 的干擾。因此，在加標(biāo)回收實驗中，雞蛋樣品經(jīng)前處理后以PBS稀釋25倍用于CLEIA檢測。

2.6 樣品加標(biāo)回收實驗及方法比對

選擇雞蛋陰性空白樣品，添加低、中、高3 個濃度水平的泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)相應(yīng)的樣品前處理后分別用CLEIA 方法和HPLC-MS/MS方法［27］檢測，并計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。每個樣品測定3 次，取平均值，結(jié)果如表3 所示。CLEIA 方法的平均加標(biāo)回收率為100%～118%。RSD 均小于10%。與HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果的相關(guān)性良好，回歸方程為y=0.91x+3.68，r2為0.998 7。說明方法準(zhǔn)確度良好，適用于雞蛋樣品中泰妙菌素的檢測。

表3 泰妙菌素樣品加標(biāo)回收實驗（n=3）Table 3 Spiked recoveries of tiamulin in blank samples（n=3）

3 結(jié) 論

本研究基于羧甲基羥肟為偶聯(lián)手臂的半抗原TMLO，通過動物免疫、細(xì)胞融合篩選等獲得了泰妙菌素特異性單克隆抗體，并建立了雞蛋中泰妙菌素殘留的CLEIA 檢測方法。該方法對泰妙菌素的LOD 為0.03 ng/mL，IC50為0.54 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.17～1.74 ng/mL。與其功能結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)，特異性良好。實際樣本加標(biāo)回收率為100%～118%，RSD 小于10%，與HPLC-MS/MS 方法的檢測結(jié)果相關(guān)性良好（r2= 0.998 7），適用于雞蛋樣品中泰妙菌素殘留的快速篩查檢測。