雙光束光解離在牛泛素蛋白離子的自頂向下質(zhì)譜分析中的應(yīng)用研究

焦魯楊，張凱林，杜夢(mèng)穎，許一澄，李樹(shù)奇，孔祥蕾，3*

（1.南開(kāi)大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 元素有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；2.天津理工大學(xué) 生命健康智能檢測(cè)研究院，天津 300384；3.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071）

基于質(zhì)譜的“自頂向下”（Top-down）分析方法在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的興起，為完整蛋白質(zhì)序列鑒定、翻譯后修飾、可變剪接及其關(guān)聯(lián)性研究提供了新的方法［1-2］。蛋白質(zhì)離子的有效裂解是自頂向下質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)。隨著高分辨率、高質(zhì)量精度質(zhì)譜技術(shù)的廣泛使用以及激光技術(shù)的快速發(fā)展，基于光解離的離子活化已逐漸發(fā)展成為研究多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)的重要方法之一［3-4］。在光解離活化中，氣相離子吸收某一特定波長(zhǎng)的光子后引發(fā)裂解［5-6］。激光器輸出能量和波長(zhǎng)的變化則為光解離活化提供了選擇性和可調(diào)諧性。其中紅外多光子解離（IRMPD）方法已被廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)離子的光解離活化［7-9］。與IRMPD 相比，紫外光解離（UVPD）的解離機(jī)理更為復(fù)雜，并能夠產(chǎn)生不同種類(lèi)的碎片離子［10-13］。2013 年，Brodbelt 課題組［12］把一臺(tái)準(zhǔn)分子激光器與軌道阱質(zhì)譜儀相結(jié)合，將193 nm UVPD 應(yīng)用于自頂向下質(zhì)譜分析，結(jié)果表明該過(guò)程中同時(shí)存在能量分配前直接解離與重新分配后解離兩種裂解模式。目前，UVPD 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于自頂向下質(zhì)譜分析，如蛋白質(zhì)的剪接及翻譯后修飾［14-16］，突變［17］以及交聯(lián)位點(diǎn)［18］的詳細(xì)研究［19-20］。

考慮到不同活化方式的解離通道和產(chǎn)生的碎片之間的差異，將不同的離子活化方式相結(jié)合進(jìn)行質(zhì)譜分析以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多的關(guān)注［21-24］。2014 年，Brodbelt［21］將193 nm UVPD 和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）同時(shí)引入軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜儀碰撞池中，這種新的組合活化方法使互補(bǔ)離子對(duì)的類(lèi)型趨于平衡。2018 年，Shaw［22］通過(guò)對(duì)四極桿軌道阱質(zhì)譜儀進(jìn)行改裝，離子可以選擇性地進(jìn)行電子捕獲解離（ECD）、UVPD 或直接引入碰撞池中，實(shí)現(xiàn)多種活化方式相結(jié)合。雖然大多數(shù)完整蛋白的紫外光解離均使用193 nm 光子，但213 nm 或266 nm 光子也被較多地應(yīng)用于自頂向下的質(zhì)譜分析中。2015 年，Loo等［23］采用UVPD 預(yù)活化核糖核酸酶，發(fā)現(xiàn)266 nm 紫外光子可以裂解蛋白質(zhì)中的多個(gè)二硫鍵，結(jié)合ECD 則可進(jìn)一步提高含二硫鍵的蛋白質(zhì)序列覆蓋率。作者還發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)UV 和IR 激光脈沖之間的時(shí)間有利于近距離二硫鍵重組，表明帶有自由基硫醇的二硫鍵重組發(fā)生在10～100 ms 之間。Philippe 等［24］則通過(guò)對(duì)Orbitrap 質(zhì)譜儀進(jìn)行改造，將波長(zhǎng)為213 nm 的紫外激光和10.6 μm 的二氧化碳激光同時(shí)引入，提高了牛泛素蛋白解離碎片的覆蓋率，其中+13 價(jià)離子的碎片覆蓋率從單一UVPD 方法的76%提高到組合方法的83%。本文首次將210 nm紫外和3 μm紅外激光相結(jié)合，通過(guò)傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（FT-ICR MS）實(shí)現(xiàn)了基于雙光束的離子活化和蛋白質(zhì)自頂向下質(zhì)譜研究，并在優(yōu)化條件下研究了不同價(jià)態(tài)牛泛素蛋白離子的光解離質(zhì)譜。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與樣品制備

牛泛素蛋白（Ubi，純度98%，Sigma-Aldrich公司），未經(jīng)純化直接使用；異丙醇（色譜純，安耐吉科技）；乙酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；Mill-Q 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

以水為溶劑制備20 mmol/L Ubi溶液，進(jìn)一步稀釋為1 μmol/L，稀釋后溶液的體積比為水∶異丙醇∶乙酸=49∶49∶2，溶液直接使用。

1.2 儀器條件及實(shí)驗(yàn)方法

所有實(shí)驗(yàn)均在自行搭建的基于FT-ICR MS的共聚焦雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)［25］中開(kāi)展。如圖1所示，該系統(tǒng)結(jié)合一臺(tái)7.0 T FT-ICR MS（IonSpec，Varian Inc.，Lake Forest，CA，USA），兩臺(tái)可調(diào)諧光學(xué)參量振蕩（Optical parametric oscillator，OPO）激光器：紫外-可見(jiàn)可調(diào)諧激光器（NT-342C，EKSPLA，Lithuania）和紅外激光器（Firefly-IR，M Squared，UK）。激光照射時(shí)間由一臺(tái)程序控制的SSH-R 型機(jī)械快門(mén)（SSH-C4RA，Sigma-Koki，Tokyo，Japan）來(lái)完成。在光解離質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，3 μm紅外激光和210 nm 紫外激光經(jīng)光學(xué)準(zhǔn)直系統(tǒng)調(diào)節(jié)后在空間上共同聚焦于ICR 分析池，通過(guò)控制時(shí)間序列，分別實(shí)現(xiàn)兩束激光對(duì)離子云的同時(shí)、分步和交替照射。

圖1 雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the double-beam photodissociation mass spectrometry-spectroscopy system

所有離子均通過(guò)電噴霧電離源（ESI）電離產(chǎn)生，其中ESI源預(yù)熱溫度設(shè)置在80 ℃。質(zhì)譜檢測(cè)均采用正離子模式，質(zhì)荷比（m/z）的探測(cè)范圍為220～2 000。使用注射泵（Pump 11 Elite，Harvard Apparatus，USA）將稀釋后的牛泛素蛋白樣品溶液以120 μL/h的速度注入，經(jīng)電噴霧電離后，通過(guò)離子導(dǎo)引系統(tǒng)進(jìn)入分析池。進(jìn)一步的光解離質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)存儲(chǔ)波逆傅里葉變換［26］的方法在離子回旋共振分析池中選出不同電荷態(tài)的牛泛素蛋白離子，隨后引入相應(yīng)的激光，最后對(duì)產(chǎn)物離子進(jìn)行探測(cè)和數(shù)據(jù)分析。每張光解離質(zhì)譜圖通過(guò)50次累加后獲得。

1.3 光譜數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析由實(shí)驗(yàn)室自行開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)分析軟件NKTD 完成［27］。通過(guò)采用“由一到多”的方式尋找同位素峰簇的方法，完成對(duì)“自頂向下”蛋白質(zhì)組學(xué)中重疊譜峰的自動(dòng)解析，減少人工干預(yù)。蛋白質(zhì)碎裂產(chǎn)生的所有可能的a，b，c，x，y，z，a-1，b-1，c-1，x-1，y-1，z-1 以及相應(yīng)脫水、脫氨峰均可被識(shí)別。通過(guò)將程序運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行人工對(duì)比發(fā)現(xiàn)，信噪比（S/N）取2.5時(shí)可獲得最好的譜峰識(shí)別效果，即能夠盡可能地獲得更多的碎片離子信號(hào)，同時(shí)也避免了對(duì)噪聲信號(hào)的誤讀。

2 結(jié)果與討論

2.1 +11電荷態(tài)牛泛素蛋白的IRMPD、UVPD和雙光束光解離質(zhì)譜分析

基于本課題組自行搭建的雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)［25］，兩束光可以分別或通過(guò)重疊、分步或交替的方式共同被引入離子回旋共振分析池中。不同電荷態(tài)前體離子以存儲(chǔ)波逆傅里葉變換的方式選出并存儲(chǔ)在分析池進(jìn)行光解離質(zhì)譜分析。以+11 電荷態(tài)牛泛素蛋白離子為例，實(shí)驗(yàn)中分別采集其IRMPD、UVPD 與雙光束條件下的光解離質(zhì)譜圖。雙光束實(shí)驗(yàn)中，對(duì)兩束激光的時(shí)間序列進(jìn)行了優(yōu)化研究，分別探究了兩束激光同時(shí)照射的不同時(shí)間序列組合方式，以及紅外激光和紫外激光分段引入的時(shí)間序列組合方式（圖2A～C）。

圖2所示，IRMPD 與傳統(tǒng)的碰撞活化解離（CAD）方法類(lèi)似，通過(guò)斷裂不穩(wěn)定的酰胺鍵（C—N 鍵）產(chǎn)生b、y 類(lèi)型的離子，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致［28-29］；對(duì)于［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）前體離子，IRMPD可以觀(guān)察到來(lái)自b 離子及其相應(yīng)的丟失H2O 碎片離子，但碎片覆蓋率非常有限，僅為8%（圖2A）。UVPD 與IRMPD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不同，UVPD 產(chǎn)生了93 個(gè)碎片離子。［Ubi+11H］+11的UVPD 碎片包括各種類(lèi)型的離子，其中最重要的碎片離子為a、y、z 離子碎片（圖3）。UVPD 使整體蛋白的覆蓋率提高到65%（圖2B）。對(duì)于同一母體離子，采用IR 和UV 雙光束光解離的方法產(chǎn)生的碎片種類(lèi)則更多，雙光束光解離產(chǎn)生98個(gè)碎片離子，碎片覆蓋率達(dá)73%。與UVPD相比，a、b、c、x離子的數(shù)目均有所增加（圖3）。此結(jié)果與Philippe 等［24］在Orbitrap 質(zhì)譜儀的結(jié)果有所不同。在該研究中，雙光束方法產(chǎn)生的a 類(lèi)型離子比UVPD 顯著減少。這差異也反映出復(fù)雜蛋白質(zhì)離子的能量分配以及解離通道對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的敏感性。除a/x、b/y、c/z離子外，本實(shí)驗(yàn)還觀(guān)測(cè)到相應(yīng)離子H2O 和NH3的中性丟失峰，其中中性丟失H2O 比NH3更普遍，這可能是由于質(zhì)子化的酸性基團(tuán)有利于H2O的丟失［30］。

圖3 IRMPD、UVPD以及雙光束光解離產(chǎn)生的不同種類(lèi)離子分布Fig.3 Distributions of different types of ions，produced by IRMPD，UVPD and the double-beam photodissociation method

上述研究表明，通過(guò)先后引入紅外和紫外兩束激光，并保持4 s的共同照射為最佳方案（圖2C）。

圖2 在不同光照射模式下，［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）產(chǎn)生的光解離質(zhì)譜圖Fig.2 Photodissociation mass spectra of［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）generated under different modes

圖4為［Ubi+11H］+11的IRMPD、UVPD 以及雙光束光解離序列圖。雙光束方法使蛋白離子碎片覆蓋率更高，離子分布更加廣泛。相對(duì)于單一的紫外光解離，中部和N 端斷裂產(chǎn)生的碎片離子更多。值得注意的是：UVPD 和雙光束光解離產(chǎn)生的解離位點(diǎn)仍有所不同，且具有一定的互補(bǔ)性，兩者數(shù)據(jù)疊加覆蓋率達(dá)83%，這些結(jié)果優(yōu)于CAD 與UVPD 相結(jié)合所得的結(jié)果，其原因可能是紅外和紫外交替照射可產(chǎn)生具有不同電子和振動(dòng)激發(fā)態(tài)的蛋白離子并對(duì)應(yīng)了不同的解離通道，以及紅外解離的碎片離子會(huì)進(jìn)一步被紫外光解離產(chǎn)生新的碎片，從而獲得蛋白質(zhì)離子更高的碎片覆蓋率。

圖4 ［Ubi+11H］+11對(duì)應(yīng)的IRMPD，UVPD以及雙光束光解離序列圖Fig.4 Sequence maps of［Ubi+11H］+11 by IRMPD，UVPD and the double-beam photodissociation methods

2.2 其他電荷態(tài)雙光束光解離質(zhì)譜分析

圖5 和圖6 給出了［Ubi+12H］+12（m/z=714.7）和［Ubi+10H］+10（m/z=857.5）兩種離子的雙光束光解離質(zhì)譜圖及序列圖。不同電荷態(tài)離子的碎片覆蓋率有所不同，但與IRMPD、UVPD 相比，雙光束光解離均產(chǎn)生更多的碎片離子，且均以發(fā)生a/x、b/y 斷裂為主，c/z 離子則相對(duì)較少。對(duì)于［Ubi+12H］+12前體離子，雙光束光解離共產(chǎn)生123個(gè)碎片離子，其中包括30個(gè)a離子，27個(gè)b離子，10個(gè)c離子，17個(gè)x 離子，27 個(gè)y 離子以及15 個(gè)z 離子，碎片覆蓋率為68%。［Ubi+10H］+10離子雙光束光解離碎片覆蓋率為47%，其中N 端斷裂和C 端斷裂幾乎產(chǎn)生相同數(shù)目的碎片離子（分別為31 和32）。［Ubi +12H］+12，［Ubi+10H］+10前體離子發(fā)生C—N 鍵斷裂，產(chǎn)生b、y 離子數(shù)目顯著多于其他離子，斷裂主要發(fā)生在中間位點(diǎn)，末端斷裂則相對(duì)較少。不同電荷態(tài)的牛泛素蛋白通常能觀(guān)察到同一碎片離子，例如在m/z682.632 8、795.650 5處分別觀(guān)察到和類(lèi)型的碎片離子。

圖5 ［Ubi+12H］+12和［Ubi+10H］+10的雙光束光解離質(zhì)譜圖Fig.5 Double-beam photodissociation mass spectra of［Ubi+12H］+12 and［Ubi+10H］+10

圖6 ［Ubi+12H］+12和［Ubi+10H］+10對(duì)應(yīng)的雙光束光解離序列圖Fig.6 Sequence maps of［Ubi+12H］+12 and［Ubi+10H］+10，generated by the double-beam photodissociation method

2.3 討 論

通過(guò)以上的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，將IRMPD 與UVPD 相結(jié)合，可進(jìn)一步豐富蛋白質(zhì)離子自頂向下質(zhì)譜中的碎片離子的種類(lèi)，提高碎片分布的序列覆蓋率。此結(jié)果與已有的相關(guān)研究相一致［24］。從實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)來(lái)看，除選擇的質(zhì)譜儀和激發(fā)激光波長(zhǎng)不同之外，本方案中紅外和紫外激光在時(shí)間序列上以部分重疊的方式引入回旋共振池，與Philippe 等［24］采用的雙光束同步照射方案有所不同。另一方面，此實(shí)驗(yàn)中高價(jià)態(tài)離子（+11、+12）產(chǎn)生的各種類(lèi)型離子數(shù)目高于低價(jià)態(tài)離子（+10）（圖7），碎片覆蓋率與離子價(jià)態(tài)相關(guān)，這與Simon 等［31］基于213 nm UVPD 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。但本實(shí)驗(yàn)仍有許多待改進(jìn)之處，如對(duì)經(jīng)由a、x、z離子二次裂解產(chǎn)生的d、v、w離子未進(jìn)行識(shí)別、歸屬和研究。同時(shí)，由于雙光束方法的靈活性，面向不同價(jià)態(tài)離子的結(jié)構(gòu)差異的實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化也需進(jìn)一步研究?？傊?，本文提出的基于FT-ICR MS的雙光束光解離方法能夠提供更有效的裂解方式，但在優(yōu)化光解離組合、有效的數(shù)據(jù)分析以及更多自頂向下蛋白質(zhì)質(zhì)譜的具體應(yīng)用上仍需改進(jìn)和更多實(shí)踐。

圖7 不同價(jià)態(tài)離子產(chǎn)生的碎片離子分布Fig.7 Distributions of fragment ions with different types generated by different precursor ions

3 結(jié) 論

本文通過(guò)結(jié)合3 μm IRMPD 和210 nm UVPD 技術(shù)，將兩束激光在時(shí)間序列上以部分重疊的方式引入傅里葉變換離子回旋共振分析池，并研究了不同電荷態(tài)牛泛素蛋白離子的雙光束光解離質(zhì)譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙光束方法能促進(jìn)牛泛素蛋白序列中部和N端斷裂，產(chǎn)生更加豐富的碎片離子。與IRMPD、UVPD 相比，雙光束光解離除了產(chǎn)生更高的碎片離子產(chǎn)率外，還擴(kuò)展了碎片離子在質(zhì)譜低質(zhì)荷比和高質(zhì)荷比區(qū)的分布范圍。進(jìn)一步將雙光束方法和UVPD 方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，可以更好地提高蛋白序列的覆蓋率。從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)看，此方法在優(yōu)化組合和數(shù)據(jù)分析方面仍有較大的提升空間，需進(jìn)一步深入研究。