絨毛染色體檢測應(yīng)用于稽留流產(chǎn)原因探討中的價值分析

陳雪芹，馮媛

云南省曲靖市第一人民醫(yī)院婦科，云南曲靖 655000

通常情況下，自然流產(chǎn)主要指妊娠＜28 周、胎兒體 重＜1 kg，妊娠存在流產(chǎn)情況；其中妊娠在12 周內(nèi)終止為早期流產(chǎn)[1]。 根據(jù)相關(guān)臨床統(tǒng)計顯示，自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～40%， 而其中80%以上為發(fā)生在12 周內(nèi)的早期流產(chǎn)[2]。 稽留流產(chǎn)的別名為過期流產(chǎn)，其主要指胚胎已死亡滯留在宮腔中，并且沒有有效排出，是自然流產(chǎn)的一種特殊類型。 引起稽留流產(chǎn)的因素繁多，主要因素包括遺傳因素、免疫相關(guān)因素、感染因素以及分娩環(huán)境和產(chǎn)婦心理因素等。 因此明確流產(chǎn)的具體原因并采取有效的干預(yù)措施具有重要意義，已有的研究表明，染色體異常是其中一個很重要的原因， 約有60%稽留流產(chǎn)為胚胎染色體異常引起， 而精確檢測流產(chǎn)組織核型，有利于尋找胚胎停育病因，從而將有助于尋找到流產(chǎn)發(fā)生的根源所在， 并通過對再次妊娠流產(chǎn)風(fēng)險的預(yù)測，為后續(xù)的干預(yù)和治療提供重要的參考依據(jù)[3]。 研究對象為2018 年10 月—2020 年2 月于該院住院行流產(chǎn)術(shù)的孕早期稽留流產(chǎn)患者154 例，收集相關(guān)研究數(shù)據(jù)，對稽留流產(chǎn)患者的絨毛染色體及其危險因素進(jìn)行了研究，為后續(xù)指導(dǎo)提供重要參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為方便選取于該院住院行流產(chǎn)術(shù)的孕早期稽留流產(chǎn)患者154 例，最低年齡16 歲，最高年齡43歲，胚胎停育孕周介于孕5～15 周之間。 納入標(biāo)準(zhǔn):①全部患者均為稽留流產(chǎn)；②均有停經(jīng)史或尿hCG 陽性,在流產(chǎn)前對產(chǎn)婦進(jìn)行相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn)胎兒已經(jīng)停止發(fā)育；③均為知情自愿參加該次研究。 該研究通過該院倫理委員會批準(zhǔn)。 排除標(biāo)準(zhǔn):①孕期存在感染患者；②具有激素類藥物使用史患者；③具有有害物質(zhì)接觸史患者；④具有內(nèi)分泌疾病史患者。

1.2 方法

首先需要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則， 對患者實施清宮術(shù)，術(shù)后收集絨毛組織，劑量為10～20 mg，對其進(jìn)行沖洗，共沖洗兩次，使用生理鹽水沖洗，連同母體血3 mL(EDTA 抗凝)，之后實施二代高通量測序。 基因組DNA提取使用德國QIA-GEN 公司生產(chǎn)的基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行。 使用高通量測序文庫進(jìn)行試劑盒完成CNV 文庫構(gòu)建， 構(gòu)建完成的文庫使用美國KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒對文庫進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 并且需要結(jié)合各個樣本文庫的濃度實施混合處理，將完場混合的文庫應(yīng)用于高通量測序儀平臺上，展開全面測序工作，同時需要合理設(shè)置參數(shù)，其中最小精度=100 Kb，測序深度=1 X。 對于需要進(jìn)行測定的相關(guān)序列，合理應(yīng)用RUPA 軟件，將其與人類基因組進(jìn)行高效匹配。 在這一環(huán)節(jié)，將人類基因組進(jìn)行合理劃分，為多個區(qū)域，統(tǒng)計各個區(qū)域內(nèi)樣本完全匹配的序列個數(shù)，結(jié)合研究所得結(jié)果對比值進(jìn)行合理計算， 并通過特定算法明確樣本的拷貝數(shù)變異(CNVs)區(qū)域，進(jìn)而明確待測定樣本染色體的實際情況。 之后需要對相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化Z值進(jìn)行全面分析， 通過Z 值對染色體異常情況加以明確。 之后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析工作， 需要搜索基因變異數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫等相關(guān)數(shù)據(jù)，明確CNV臨床價值。

1.3 觀察指標(biāo)

對染色體檢測異常情況進(jìn)行分析。將＜35 歲組和≥35 歲組絨毛染色體異常率進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 計量資料以（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用 χ2檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本獲取情況

共收集患者絨毛標(biāo)本154 例，對全部患者實施DNA提取，高通量測序得到全部結(jié)果，檢測成功率為100%。

2.2 染色體檢測異常情況

154 例稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中， 染色體異常89例，檢出率100%，其中60 例為數(shù)目異常，表現(xiàn)為非整倍體數(shù)目異常，3 例為雙色體，1 例為15 和18 三體異常共存。29 例為結(jié)構(gòu)異常。孕婦年齡≥35 歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為75.71%（53/70）和30.95%（26/84）,組間對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組絨毛染色體異常率比較[n(%)]

2.3 染色體微缺失、微重復(fù)分析

微重復(fù) 3 例，為 10.34%（3/29）；微缺失 2 例（6.89%）。

3 討論

稽留流產(chǎn)的原因具有一定的復(fù)雜性， 導(dǎo)致其發(fā)生的最主要因素便是染色體發(fā)生異常[4]，對染色體異常的進(jìn)行劃分， 主要分為數(shù)目方面的異常和結(jié)構(gòu)方面的異常， 數(shù)目異常的主要類型為整倍體的變化和非整倍體變化，其中后者十分常見，發(fā)生風(fēng)險較大[5]。 結(jié)構(gòu)異常的主要類型分為缺失、重復(fù)等。 上述變化都會引發(fā)一些遺傳性反應(yīng)，進(jìn)而致使變異個體表型出現(xiàn)明顯變化，嚴(yán)重可能引發(fā)死亡[6]。

常規(guī)G 顯帶核型正常細(xì)胞中也存在變異的情況，主要為亞顯微結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重變異， 其主要內(nèi)容為染色體的微缺失、微重復(fù)以及類型豐富的染色體DNA 拷貝數(shù)（Genomic copy number wariations, CNVs）[7]。 基因組中約有一部分變異為CNVs，絕大部分的CNVs 屬于良性，但是剩余的一小部分便是引發(fā)嚴(yán)重染色體病癥的重要因素。 CNVs 多因為干擾基因表達(dá)進(jìn)而對妊娠造成不良影響，流產(chǎn)的風(fēng)險非常高。 CNVs 的可能致病機(jī)制較多，主要為劑量效應(yīng)及位置效應(yīng)兩方面、 致使部分隱性致病基因暴露出來、形成新的融合基因，對妊娠造成嚴(yán)重的影響[8]。

稽留流產(chǎn)的主要原因是絨毛染色體異常， 兩者之間息息相關(guān)。 因此對臨床來說，全面檢測絨毛染色體具有重要的意義， 有助于臨床醫(yī)師及時了解流產(chǎn)的主要因素，有助于為后續(xù)妊娠提供重要的指導(dǎo)依據(jù)，價值明顯[9]。 下面該文對詳細(xì)方法進(jìn)行概述:①如果結(jié)果存在明顯異常， 下一次妊娠則需要明確科學(xué)合理的產(chǎn)前診斷方法。 ②如果結(jié)果顯示正?；蛘呷旧w具有多態(tài)性，需要實施其他檢測，急需查明原因。 ③如果檢測結(jié)果顯示致病性具有未執(zhí)行，需要對夫婦實施外周血檢測，明確其是否為遺傳因素影響所致。如果CNVs 通過健康父母遺傳，那么便不是染色體因素引發(fā)的流產(chǎn)，如果 CNVs 通過攜帶者雙親進(jìn)行遺傳， 可通過輔助生育技術(shù)進(jìn)行明確，如果為新發(fā)型，可能是主要致病因素，需要進(jìn)行詳細(xì)咨詢，通過專業(yè)臨床醫(yī)師對家族史、遺傳史進(jìn)行全面分析，了解CNVs 再發(fā)風(fēng)險，為下次妊娠作正確指導(dǎo)[10]。

該文研究了154 例流產(chǎn)樣本的拷貝數(shù)變異以非整倍體改變?yōu)橹鳌?根據(jù)該次研究結(jié)果可知，154 例稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，染色體異常89 例，檢出率100%，其中60 例為數(shù)目異常，表現(xiàn)為非整倍體數(shù)目異常，3 例為雙色體，一例為15 和18 三體異常共存。29 例為結(jié)構(gòu)異常。 孕婦年齡≥35 歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為 75.71%（53/70） 和 30.95%（26/84）（P＜0.05）。 宋杰[11]等對61 例孕早期稽留流產(chǎn)絨毛應(yīng)用高通量測序技術(shù)染色體檢測研究結(jié)果顯示， 孕婦年齡≥35歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為76.9%和51.4%，與該文研究結(jié)果一致。

基于對流產(chǎn)絨毛進(jìn)行核型的全面分析， 該方法有助于對染色體異常情況進(jìn)行檢測， 但是該方法對絨毛細(xì)胞的采樣具有較高的要求，培養(yǎng)成功率低，分辨率也低，難以得到滿意的結(jié)果[12]。近年來，臨床測序技術(shù)呈飛速發(fā)展的趨勢，進(jìn)步明顯，高通量的基因測序技術(shù)開始得到廣泛應(yīng)用，其處理數(shù)據(jù)量非常大，一次能夠?qū)资f到幾百萬個DNA 分子測定。 目前已從常規(guī)基礎(chǔ)科研實驗室的應(yīng)用轉(zhuǎn)入臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用， 該項目將高通量基因測序技術(shù)用于稽留流產(chǎn)婦女絨毛染色體檢測，為臨床提供大樣本量的研究， 旨在為稽留流產(chǎn)的病因?qū)W研究積累數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)婦女再生育提供遺傳學(xué)的依據(jù)。

綜上所述， 染色體異常是早期稽留流產(chǎn)的重要因素，高齡孕產(chǎn)會導(dǎo)致胚胎染色體異常發(fā)生率提高。 采取高通量測序技術(shù)效果確切， 有助于了解稽留流產(chǎn)的原因，為下一次良好妊娠提供有效指導(dǎo)。