魚腥草可溶性粉的抗菌試驗探究

吳長屏 顧麗群

【摘要】目的：探究新劑型魚腥草可溶性粉的抗菌作用。方法：抗菌試驗采用體外最小抑菌濃度法和牛津杯法，測定魚腥草可溶性粉的最小抑菌濃度和抑菌圈直徑。結果：魚腥草可溶性粉對大腸桿菌的抑菌圈直徑為14.58±0.15mm，其MIC值為125mg/mL;魚腥草可溶性粉對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16.42±0.15mm，其MIC值為62mg/mL。結論：說明魚腥草可溶性粉對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較好。

【關鍵詞】可溶性粉;金黃色葡萄球菌;大腸桿菌

如今，畜牧業(yè)集約化養(yǎng)殖模式不斷發(fā)展，各種傳染性疾病越來越嚴重影響到畜牧業(yè)的健康發(fā)展，一般治療藥物主要是抗生素，抗生素以高效率為特征，被廣泛用于預防和治療畜禽疾病，然而長期使用抗生素會導致細菌耐藥性的產(chǎn)生、藥物毒副作用的累積、藥物殘留所致的畜產(chǎn)品等安全問題。中藥治療效果很少出現(xiàn)類似抗生素所致的毒副作用，中藥屬于天然藥物，來源多、分布廣、價格低廉、無毒副作用，具有廣闊的發(fā)展空間。為實現(xiàn)中藥為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)服務的目的，加強中藥的現(xiàn)代化研究，開發(fā)新劑型中藥的應用成為發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

本試驗旨在研究魚腥草可溶性粉的抗菌作用，為此，在體外進行試管二倍稀釋法、牛津杯法的試驗，確定其量效關系，為魚腥草可溶性粉應用于臨床抗菌方面提供理論支撐。

1、材料

1.1菌種

大腸桿菌ATCC25922（購于重慶市中檢所）;金黃色葡萄球菌CUCC1822（購于重慶市中檢所）

1.2主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;SW-OJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;YP1200型電子天平（上海精科試驗儀器有限公司）BS-1E數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）;微孔濾膜（上海市新亞凈化器件廠）;濾頭（上海市新亞凈化器廠）;81M270129麥氏比濁管（珠海貝索技術有限公司）;10uL至1000uL移液槍（Eppendorf Ltd.Co）

1.3試劑

營養(yǎng)肉湯（青島高科園海博生物技術有限公司，批號：20140312）;營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋科技有限公司，批號：20120330）

2、方法

2.1生理鹽水的制備。稱取0.9gNacl加入100mL的蒸餾水中攪勻即得。

2.2中藥藥液的制備。稱取4.29g的魚腥草可溶性粉，用10mL的蒸餾水溶解攪勻，置于121℃高壓滅菌鍋內滅菌30分鐘即可。

2.3營養(yǎng)肉湯的制備。稱取營養(yǎng)肉湯粉1.8g，加熱溶解于100mL蒸餾水中，分裝三角瓶內，121℃高壓滅菌20分鐘，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜觀察有無污染，選取無污染的的肉湯于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4培養(yǎng)基的制備。稱取營養(yǎng)瓊脂33g加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌鍋內滅菌20分鐘，在冷卻至40～50℃時倒入平皿中，每個平皿約15mL，紫外照射5min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜觀察有無菌落，選取無菌落的培養(yǎng)基于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5菌液制備?；罨瘶藴示N大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，首先將供試菌種接種在適于生長的培養(yǎng)基內，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待菌種復壯后使用。再取復壯的菌種，接種到營養(yǎng)肉湯中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h備用。采用麥氏比濁法測大腸桿菌濃度、金黃色葡萄球菌濃度，分別為8×108CFU、7×108CFU，用滅菌生理鹽水稀釋菌液，將其稀釋至108/mL的含菌量 。

2.6試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度。取無菌試管10只按順序編號，1-8管各加1mL營養(yǎng)肉湯，以無菌操作在第1管內加入含1g/mL生藥的中藥藥液1mL，用移液槍混勻后吸取1mL加入到第2管中，混勻，再取1mL至第3管，依次倍比稀釋至第7管，混勻后自第7管棄去1mL，第8管不加藥液作為對照管，第9管為藥液對照管，第10管為藥液加肉湯的對照管，然后1到7管每管加入0.1mL目標菌液，在無菌環(huán)境中操作結束后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結果。試驗重復進行三次，操作如表1：

結果判定：以能抑制細菌生長的中草藥最高稀釋度作為中草藥的最低抑菌濃度。

2.7牛津杯法測魚腥草可溶性粉敏感性試驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上，用L型玻璃棒蘸取目標菌液在瓊脂表面均勻涂布，以無菌操作將滅菌的不銹鋼牛津杯，放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。平板上均勻放4支小管。待1min后，分別向各小管中滴加1g/mL生藥的中藥藥液200μL的藥液，勿使其外溢。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察結果。結果判定：抑菌圈直徑>20mm為極敏，抑菌圈直徑15～20mm為高敏，抑菌圈直徑10～15mm為中敏，抑菌圈直徑<10mm為低敏，無抑菌圈為不敏感。試驗重復進行三次，求出抑菌圈直徑的平均值。

3、試驗觀察記錄 觀察記錄混濁和未混濁的試管數(shù);測量抑菌圈的大小，每個抑菌圈測量三次計算平均數(shù)并記錄。

4、數(shù)據(jù)處理 采用Excel進行數(shù)據(jù)收集與處理，再用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗和方差分析，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示。

5、試驗結果

5.1最小抑菌濃度測定結果

在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出試管，肉眼觀察藥物抑菌效果，判斷細菌生長情況，對于大腸桿菌，從第4管開始變渾濁，最小抑菌濃度（MIC）為1/8，對于金黃色葡萄球菌，從第5管開始變渾濁，最小抑菌濃度（MIC）為1/16，結果顯示如表2

5.2牛津杯法測魚腥草可溶性粉敏感性試驗結果

在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出瓊脂平板，肉眼觀察各種藥物的抑菌效果，并測量各抑菌圈的直徑大小。魚腥草可溶性粉對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為14.58mm，呈中度敏感，魚腥草可溶性粉對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為16.42mm，呈高度敏感。結果顯示如表3

6、分析討論

一般而言，清熱藥為中草藥中抑菌的首選藥物，魚腥草具有清熱解毒的功效，中藥抑菌試驗方法有兩種，一種是定性分析法，一種是定量分析法。定性分析法一般采用管碟法、藥敏紙片法和平皿稀釋法。定量分析法有試管二倍稀釋法、平皿打洞法、杯管法等。這些方法都可以作為體外抗菌作用的研究方法。本試驗從定性、定量分析兩個方面出發(fā)，再根據(jù)實驗室已有資源的可操作性，因此選擇了試管二倍稀釋法、管碟法對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行了抑菌試驗。試驗過程中難免受到來自細菌接種量、培養(yǎng)基等的影響。因此，應盡量統(tǒng)一標準、材料、可控的實驗條件，進行多次的重復，才能使結果更客觀可靠。

本試驗從以上結果可看出， 魚腥草可溶性粉對大腸桿菌為中敏，對金黃色葡萄球菌為高敏，魚腥草可溶性粉對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌有高度抑制作用，對痢疾桿菌、大腸桿菌有中度抑制作用。

結論：通過試管二倍稀釋法和牛津杯法試驗，結果表明魚腥草可溶性粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，尤其對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好。

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