基于樹枝狀分子及功能化金納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)污泥中大腸桿菌

魯文杰+張新愛+李昌烽+申建忠+蔣玉香+黃陳勇

摘要 利用樹枝狀分子-金納米粒子復(fù)合物修飾電極和金納米粒子標(biāo)記物構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，用于污泥中大腸桿菌的檢測(cè)。首先在玻碳電極表面電聚合對(duì)氨基苯甲酸，通過共價(jià)作用結(jié)合第Ⅳ代氨基末端的樹枝狀分子（G4-PAMAM），并在其內(nèi)部載入金納米粒子，制備修飾電極（GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）），用于固定大腸桿菌。采用硫堇作為電活性物質(zhì)包被金納米粒子，用于標(biāo)記二抗制備金納米粒子標(biāo)記物（Ab2-Au-Th）。通過抗原-抗體之間的特異性識(shí)別作用，將一抗、金納米粒子標(biāo)記物依次修飾在電極表面，用差分脈沖伏安法測(cè)定硫堇產(chǎn)生的電流信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為70 cfu/mL（S/N=3）。利用本方法檢測(cè)污水處理廠的不同污泥樣品中的大腸桿菌，回收率為89.4%～105.8%。

關(guān)鍵詞 城市污泥； 大腸桿菌； 樹枝狀分子； 功能化金納米粒子； 電化學(xué)免疫傳感

2016-01-10收稿；2016-04-11接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos. 21205051， 11072091）和教育部科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（No.210078）資助

E-mail： zhangxinai@mail.ujs.edu.cn； cfli@ujs.edu.cn

1 引 言

隨著我國城市污水處理進(jìn)程的全面推進(jìn)，污泥的產(chǎn)量與日俱增，給自然環(huán)境帶來了沉重負(fù)擔(dān)。因此，污泥的合理回收利用顯得尤為重要[1，2]。然而，城市污泥成分復(fù)雜、微生物含量高，如果處置不當(dāng)極易造成二次污染，特別是含有的病源微生物嚴(yán)重制約了污泥的有效利用[3～5]。污泥中病源微生物的危害與大腸桿菌（E. coli）的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[6]，因此大腸桿菌已經(jīng)成為評(píng)估污泥回收利用可行性的重要指標(biāo)，并被列為污泥微生物標(biāo)準(zhǔn)的必檢項(xiàng)目。目前，大腸桿菌的常規(guī)檢測(cè)方法主要有多管發(fā)酵法、濾膜法、稀釋平板計(jì)數(shù)法等[7～9]，但存在著耗時(shí)長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)，不能滿足大腸桿菌快速檢測(cè)的需求。因此，建立污泥中大腸桿菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法， 對(duì)評(píng)估污泥綜合利用的可行性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)速度快和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在大腸桿菌檢測(cè)中呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[10，11]。在電化學(xué)傳感器制備中，如何提高電極的導(dǎo)電性能和增大電活性物質(zhì)的固載量，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大是關(guān)鍵[12～16]。樹枝狀分子由于其特殊的結(jié)構(gòu)能夠封裝金屬絡(luò)合物、金屬納米粒子或有機(jī)和無機(jī)的客體分子而備受關(guān)注[17～20]。其中，樹枝狀分子-金納米粒子復(fù)合物兼具樹枝狀分子的表面活性和金納米粒子獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，既能增強(qiáng)樹枝狀分子的導(dǎo)電性，又能有效控制金納米粒子的尺寸。本研究基于雙重信號(hào)放大策略，利用樹枝狀分子-金納米粒子復(fù)合物修飾電極和硫堇包被金納米粒子標(biāo)記二抗構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，用于污泥中大腸桿菌的測(cè)定，為污泥中大腸桿菌的檢測(cè)研究提供了新思路。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI 660d 型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），采用三電極體系：以玻碳電極（GCE，Φ=3 mm）為基底的免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極； JEM-2100透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）； Cary 500紫外-可見分光光度計(jì)（美國Agilent公司）； Nicolet Nexus 670傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）。

G4-PAMAM樹枝狀分子、硫堇（Th）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）購于Sigma-Aldrich 公司； 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、硼氫化鈉（NaBH4）、對(duì)氨基苯甲酸（p-ABA）、戊二醛（GA）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。兔抗大腸桿菌（DH5α）多克隆抗體（一抗，Ab1）、羊抗兔IgG（二抗，Ab2）由北京寶賽生物科技有限公司提供。10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液（PBS，pH 7.4），含136.7 mmol/L NaCl，2.70 mmol/L KCl。大腸桿菌菌種（DH5α）由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水（>18.2 MΩ·cm）。所有玻璃容器在使用前均高壓滅菌消毒。污泥實(shí)際樣品取自于鎮(zhèn)江市某污水處理廠。

2.2 Ab2-Au-Th標(biāo)記物的制備

采用檸檬酸鈉還原氯金酸制備金納米粒子（AuNPs）[21，22]。將30 mL金納米粒子溶液與6.0 mL飽和硫堇水溶液混勻，室溫下攪拌24 h， 15000 r/min離心10 min，得到硫堇包被金納米粒子沉淀（Au-Th）[23]； 用超純水清洗沉淀，分散于4 mL PBS中。加入50 μL 二抗，在攪拌條件下孵育4 h，制得Ab2-Au-Th標(biāo)記物。5000 r/min離心12 min，棄去未結(jié)合的檢測(cè)抗體和副產(chǎn)物，用PBS重懸Ab2-Au-Th，于4℃保存?zhèn)溆?。Ab2-Au-Th標(biāo)記物的制備過程如圖1（底部）所示。

2.3 免疫傳感器的制備以及大腸桿菌的固定

玻碳電極用Al2O3拋光至鏡面，依次用丙酮、1.0 mol/L HNO3、1.0 mol/L NaOH及超純水超聲清洗5 min。將電極用氮?dú)獯蹈?，放? mmol/L p-ABA溶液中，以50 mV/s掃速，在0～1.0 V間循環(huán)伏安掃描15圈，使電極表面羧基化，得到修飾電極（GCE/p-ABA）。清洗電極后，滴加10 μL含有EDC/NHS（400 mmol/L/100 mmol/L）的PBS溶液活化電極表面60 min。然后，在電極表面滴加10 μL PAMAM，使其氨基與電極表面的羧基反應(yīng)60 min，制得GCE/p-ABA/PAMAM。將電極用二次蒸餾水清洗并吹干后，插入100 μL 0.1 mmol/L HAuCl4溶液中靜置60 min后，取出并用二次蒸餾水清洗除去多余的HAuCl4。將修飾電極浸入新配制的1.0 mol/L NaBH4溶液中放置30 min，取出用二次蒸餾水清洗，制得GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）。滴加10 μL 0.25%GA溶液活化電極表面60 min，然后將修飾電極插入一定濃度的大腸桿菌溶液，37℃培養(yǎng)60 min，制備GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）/E. coli。在電極表面滴加10 μL 1% BSA孵育30 min用于封閉活性位點(diǎn)。將修飾電極用PBS清洗并吹干后，滴涂10 μL Ab1，37℃條件下孵育60 min。然后將10 μL Ab2-Au-Th滴涂于電極表面，孵育60 min，用PBS清洗后，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

2.4 電化學(xué)檢測(cè)

修飾電極的制備過程采用電化學(xué)交流阻抗（EIS）進(jìn)行表征：應(yīng)用電位0.20 V，振幅0.05 V，頻率為0.10～100 kHz，靜置時(shí)間2 s。

大腸桿菌的測(cè)定采用差分脈沖伏安（DPV）法，在乙酸緩沖液中進(jìn)行，電位掃描范圍為0～ 0.70 V，掃描速度50 mV/s，振幅0.05 V。通過測(cè)定電極表面固定的硫堇的響應(yīng)電流實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。所有測(cè)定均在室溫下進(jìn)行。免疫傳感器的制備及大腸桿菌的檢測(cè)過程如圖1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 Ab2-Au-Th標(biāo)記物的表征

金納米粒子從透射電鏡（TEM）可見，金納米粒子（圖2A）呈球形，大小均勻，平均粒徑為20 nm。包被硫堇后，金納米粒子的粒徑變大， 且呈現(xiàn)小的團(tuán)簇（圖2B），這是由硫堇的正電荷和金納米粒子表面的負(fù)電荷相互作用引起的。從圖2C的紫外-可見吸收光譜可見，金納米粒子在520 nm處呈現(xiàn)明顯的吸收峰（曲線a），硫堇在598和565 nm處有兩個(gè)吸收峰，分別是硫堇單聚體和二聚體的特征峰（曲線b

）。當(dāng)硫堇包被金納米粒子后，由于硫堇分子之間強(qiáng)的電子耦合效應(yīng)，565 nm處的吸收峰略微藍(lán)移（曲線c）。當(dāng)硫堇包被金納米粒子并固載抗體后， 283 nm處的吸收峰發(fā)生紅移（曲線d），這是由于硫堇的吸收峰與抗體的吸收峰相互重疊造成的。

3.2 樹枝狀分子固載金納米粒子前后的紅外光譜表征

圖3是樹枝狀分子和樹枝狀分子固載金納米粒子的紅外光譜圖。由譜線a可見，樹枝狀分子紅外吸收中有明顯的酰胺I帶和酰胺II帶，分別位于1640 和 1558 cm1處。譜線b與譜線a相比，酰胺I帶和酰胺II帶均分裂成雙譜帶，表明金納米粒子的存在對(duì)酰胺鍵有明顯干擾，證明金納米粒子已成功載入樹枝狀分子 [24～27]。

3.3 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗行為

以Fe（CN）3 6為氧化還原探針，采用交流阻抗法（EIS）考察工作電極界面的變化，如圖4所示，其中高頻部分的半圓直徑對(duì)應(yīng)于電子傳遞阻抗（Rct）。裸玻碳電極的Rct值約為180 Ω（曲線a）； 電聚合對(duì)氨基苯甲酸后， Rct值變大，表明對(duì)氨基苯甲酸成功修飾到電極表面并阻礙電子傳遞（曲線b）； 從曲線c可以看出，樹枝狀分子修飾電極后，電極Rct值明顯下降，這可能是由于修飾在電極表面的氨基對(duì)溶液中Fe（CN）3 6產(chǎn)生一定的靜電吸附，加快了電子轉(zhuǎn)移速度所致； 當(dāng)金納米粒子載入樹枝狀分子形成GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）后， Rct值進(jìn)一步降低，這是由于金納米粒子大大增加了電極的導(dǎo)電性（曲線d）； 當(dāng)大腸桿菌結(jié)合在電極表面后，由于大腸桿菌作為非導(dǎo)電性物質(zhì)阻礙了電子的傳遞，Rct值明顯增大（曲線e）； 依次修飾一抗與Ab2-Au-Th，Rct值逐步增大（曲線f和g）。

3.4 大腸桿菌測(cè)定條件的優(yōu)化

考察了免疫反應(yīng)時(shí)間對(duì)電流信號(hào)的影響，結(jié)果表明，隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的增加，電流信號(hào)逐漸增強(qiáng)，60 min時(shí)趨于穩(wěn)定，因此選擇60 min作為免疫反應(yīng)時(shí)間。考察了免疫反應(yīng)溫度在20～45℃范圍高于37℃，信號(hào)開始下降，這可能是因?yàn)樵诟邷貢r(shí)生物分子的活性降低，因此選擇37℃作為免疫反應(yīng)的溫度。

3.5 免疫傳感器的性能比較

分別采用GCE/p-ABA/PAMAM和GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）為基底的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)大腸桿菌（1.0×106 cfu/mL）。從圖5可見，GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）為基底的免疫傳感器的檢測(cè)電流信號(hào)（曲線b）明顯高于GCE/p-ABA/PAMAM為基底的免疫傳感器的電流信號(hào)（曲線a），這是因?yàn)镚CE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）具有較大的比表面積和優(yōu)良的電化學(xué)性能，既增加了大腸桿菌的固載量，又提高了電子的轉(zhuǎn)移速度。

3.6 傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法檢測(cè)不同濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖6是DPV響應(yīng)電流隨大腸桿菌濃度的變化圖。響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)在1.0×102～1.0×106 cfu/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖6插圖），線性回歸方程為Y（μA）= 0.1022+0.6144lgX（cfu/mL）（R2=0.9860， n=5），檢出限為70 cfu/mL（S/N=3）。

3.7 傳感器的特異性和重現(xiàn)性研究

污泥中其它微生物，如枯草桿菌、放線菌和酵母菌等， 對(duì)大腸桿菌的測(cè)定可能產(chǎn)生影響。1.0×104 cfu/mL大腸桿菌產(chǎn)生的響應(yīng)電流信號(hào)為2.45 μA； 在該大腸桿菌溶液中分別加入1.0×104 cfu/mL枯草桿菌、放線菌和酵母菌，檢測(cè)大腸桿菌產(chǎn)生的響應(yīng)電流信號(hào)分別為2.38， 2.52 和2.49 μA，電流的偏差分別為2.68%， 2.68%， 1.63%，表明其它微生物的存在對(duì)大腸桿菌的測(cè)定無明顯影響，證明傳感器具有較高的特異性。

對(duì)4個(gè)濃度的大腸桿菌（1.0×102，5.0×102，1.0×103和5.0×103 cfu/mL）分別測(cè)定5次，所測(cè)得濃度的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.2%，5.8%，7.0%和6.5%，批間RSD為4.9%，6.8%，5.4%和7.2%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

3.8 樣品分析

對(duì)污水處理廠3個(gè)不同工序的污泥進(jìn)行取樣，采用本方法進(jìn)行大腸桿菌檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。本方法與平板計(jì)數(shù)法[28]的相對(duì)誤差在±8%以內(nèi)，回收率為89.4%～105.8%，表明建立的電化學(xué)免疫分析方法用于污水處理廠實(shí)際樣品中大腸桿菌的檢測(cè)具有可靠性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。與文獻(xiàn)[2，8～11]相比，本方法采用樹枝狀分子-金納米粒子復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，為污泥中大腸桿菌的檢測(cè)提供了新的思路。

4 結(jié) 論

利用樹枝狀分子-金納米粒子復(fù)合物修飾電極和硫堇包被金納米粒子標(biāo)記抗體構(gòu)建了一種用于污泥中大腸桿菌檢測(cè)的電化學(xué)免疫傳感器。樹枝狀分子和金納米粒子提高了電極的導(dǎo)電性能，增大了電活性物質(zhì)的固載量，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。與常規(guī)的大腸桿菌檢測(cè)方法相比，本傳感器具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)。污水處理廠實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有較好的應(yīng)用前景。

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Abstract A novel electrochemical immunosensor was developed for detection of E. coli in urban sludge based on dendrimer-encapsulated Au and enhanced gold nanoparticle labels. p-Aminobenzoic acid （p-ABA） was electropolymerized on glassy carbon electrode （GCE） surface to introduce abundant carboxyl groups. G4-polyamidoamine dendrimers （PAMAM） were covalently attached onto electrode surface through the formation of amide bonds between amino groups of dendrimer and carboxyl groups of poly-p-ABA. Subsequently， Au ions were coordinated in the interior of dendrimer and then reduced to form gold nanoparticles （AuNPs）. The resulting electrode （GCE/p-ABA/PAMAM（AuNPs）） provided numerous amino groups to allow highly dense immobilization of E. coli， and facilitated the improvement of electrochemical responses. The rabbit anti-E. coli polyclonal antibody （Ab1） was captured by the electrode surface-confined E. coli， followed by the attachment of the enhanced gold nanoparticle labels （Ab2-Au-Th） featuring thionine （Th） as signal-generating molecule. The analysis of E. coli was performed by electrochemical detection of Th in the bound labels on the electrode surface. Under the optimal experimental conditions， a linear relationship between the peak current of Th and the logarithmic value of E. coli concentration ranging from 1.0×102 cfu/mL to 1.0×106 cfu/mL was obtained with a detection limit of 70 cfu/mL （S/N=3）. The proposed strategy was also used to determine E. coli in samples obtained from waste water treatment plant， and the recoveries of standard additions were in the range of 89.4% to 105.8%. The results confirmed that the electrochemical immunoassay gave a useful protocol for E. coli analysis with high sensitivity， specificity and acceptable accuracy， and thus could potentially become a promising technique for estimating the feasibility of sludge recycling.

Keywords Urban sludge； E. coli； Dendrimer； Functionalized gold nanoparticle labels； Electrochemical immunosensing