長期保存活力低下的大腸桿菌制備感受態(tài)細胞條件的優(yōu)化

晏國洪　姜山

摘要：研究了CaCl2，溶液處理方法、長期保存的原始菌種活化次數(shù)、離心條件對感受態(tài)細胞最終轉化效率的影響，并分析其最佳轉化效率參數(shù)、優(yōu)化感受態(tài)制備和轉化方法。結果發(fā)現(xiàn)：使用過濾處理的GaCl2比滅菌處理的CaCl2制備的感受態(tài)細胞轉化效率高。在其他條件相同的情況下，長期保存的大腸桿菌菌種活化3次以上的轉化率最高；制備感受態(tài)細胞第1次離心在4℃、4 000g條件下離心15min，第2次離心時在4℃、4000g條件下離心5min得到的感受態(tài)細胞轉化率最高。

關鍵詞：大腸桿菌；感受態(tài)細胞；轉化率；優(yōu)化

中圖分類號：Q813.1+1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0046-03

DH5α是一種常用于質?？寺〉木N。感受態(tài)細胞的制備和轉化是分子生物學實驗室頻繁使用的一項重要的常規(guī)操作。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α在使用含NPTⅡ質粒載體轉化時，可用卡那霉素鑒別重組菌株。重組DNA轉化細菌技術的關鍵是通過物理或者化學的方法，人工誘導細菌細胞成為敏感的感受態(tài)細胞，這種細胞易接受外源DNA，但由于轉化是一個很復雜的過程，具體的作用機理尚不明確。一些優(yōu)良的大腸桿菌菌種價格較貴或獲得途徑較難，而實驗室保存的大腸桿菌菌種一般時間較長（約5～10年），導致菌種部分死亡和活力降低，在實際操作中制得的感受態(tài)細胞轉化效率常常不能滿足試驗的要求。

對于大腸桿菌而言，外源DNA導入主要有電穿孔轉化法、MgCl2-DMSO法、Inoue法、CaCl2法等多種。電穿孔轉化法需要特殊的儀器設備，MgCl：-DMSO法和Inoue法操作比較復雜。而CaCl2轉化法操作相對簡單、方便，而且成本非常低廉，已成為實驗室進行基因克隆操作常用方法。CaCl2法制備感受態(tài)細胞的關鍵因素有CaCl2溶液的質量、大腸桿菌DH50z生理狀況、制備過程中的離心條件。本試驗用CaCl2法對保存了5.5年的菌種按以上3個關鍵因素設計試驗，優(yōu)化感受態(tài)細胞的制備條件。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質粒大腸桿菌DIlSa由貴陽醫(yī)學院寄生蟲實驗室贈送，pRll01-ON質粒購置于TaKaRa公司（圖1）。

1.1.2試劑LB培養(yǎng)基，卡那霉素素溶液，CaCl2溶液，均按文獻[10]的要求配制。

1.1.3儀器凝皎成像系統(tǒng)、電泳儀、超凈工作臺、冷凍離心機、搖床、紫外分光光度計。

1.2

方法

1.2.1提取pRll01-ON質粒按照質粒提取試劑盒說明書操作。

1.2.2活化菌種 （1）從一80 qC冰箱中取出長期保存的大腸桿菌，用無菌牙簽刮取固體（仔細操作不要讓其融化），然后在LB平板上劃線。

（2）取5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基加入支無菌試管中。

（3）用接種環(huán)挑1個單菌落，浸沒于培養(yǎng)液中并輕輕搖動接種環(huán)，使待接種的細菌分散于培養(yǎng)液中。

（4）蓋好試管，在搖床上以60r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和（新鮮培養(yǎng)至飽和期的培養(yǎng)細菌濃度約為10億～20億個/mL），一般須過夜培養(yǎng)。

（5）取出（4）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮lJH培養(yǎng)基試管中，在搖床上以220 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細胞。（活化1次）

（6）將活化過1次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（7）取出（6）中O.2 mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220 r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20MIN取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測定D600NM值，另一支制備感受態(tài)細胞。（活化2次）

（8）將活化過2次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（9）取出（8）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4 qC冰箱統(tǒng)一測定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細胞。（活化3次）

（10）將活化過3次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（11）取出（10）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細胞。（活化4次）

1.2.3制備感受態(tài)細胞 CaCl2法制備感受態(tài)細胞。搖好的菌液試管冰浴30min，分裝成2mL，在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加800uL冰預冷的0.1mo]/L CaCl：重懸浮，分別使用O.22汕m的濾菌器和高溫滅菌。再在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加100uL冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸浮，4℃保存12～24h。

1.2.4質粒轉化 把100uL的感受態(tài)細胞放置于冰上，加入轉化的10ng DNA，于冰中放置30min。42℃熱激90s，再在冰中放置2～3min，加入37℃條件下預熱好900uL的LB培養(yǎng)基，37℃條件下振蕩1h。取10uL菌液稀釋涂布平板（平板預熱），37℃條件下正向培養(yǎng)1h，再過夜培養(yǎng)。

1.2.5計算轉化子總數(shù)=該皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×（轉化反應原液總體積/稀釋倍數(shù)）；

轉化頻率=轉化子總數(shù)/質粒DNA加入量（ug）。2結果與分析