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    玉米紋枯病病菌y—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因克隆與表達分析

    2015-10-20 21:08:26劉博孔婷婷劉限高增貴姚遠唐琳
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:表達分析基因克隆

    劉博 孔婷婷 劉限 高增貴 姚遠 唐琳 何世道

    摘要:前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米紋枯病菌WF-9菌株的全長cDNA文庫,并進行EST分析。筆者在此基礎(chǔ)上,將EST片段進行聚類拼接,得到一個長944 bp的序列,根據(jù)所得序列開放閱讀框設(shè)計引物,克隆得到玉米紋枯病病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(GGT)cDNA序列,以生物信息學(xué)方法對其序列進行預(yù)測分析,并利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片不同時期的表達特性。結(jié)果表明,克隆所得617bp序列與EST序列完全相同,在GenBank進行Blastx同源比對,與gamma—glutamyhranspeptidase(Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。實時熒光定量PCR表明,GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時期均有表達,并存在明顯差異,其中在病菌侵染玉米葉片24 h時表達量最高。

    關(guān)鍵詞:立枯絲核菌;GGT;基因克隆;表達分析

    中圖分類號:S435.131.4+9 文獻標(biāo)志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0039-03

    玉米紋枯病是世界玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴重的世界性病害之一。近年來,隨著玉米栽培密度的提高,氮肥用量增加,形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件,該病在某些地區(qū)危害日益嚴重,有逐年加重的趨勢。玉米紋枯病現(xiàn)已成為制約我國玉米持續(xù)增產(chǎn)的主要病害。

    目前,關(guān)于真菌病害相關(guān)基因研究較多,杜欣可克隆了玉米紋枯病菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的基因,用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株,接種玉米葉片出現(xiàn)水浸狀病斑。崔福浩成功克隆了β-1,4-內(nèi)切纖維素酶基因,用該基因構(gòu)建了酵母工程菌株,接種試驗表明,該基因可以殺死植物細胞。還有一些與代謝有關(guān)的基因已被克隆,Bowyer等發(fā)現(xiàn)引起禾谷類全蝕病的禾頂囊殼菌(Gaeuman-nomyces gramins)產(chǎn)生燕麥素酶分解燕麥根表皮細胞內(nèi)的皂角苷燕麥素,編碼該酶的基因突變后禾頂囊殼菌也就失去了對燕麥的致病力。關(guān)于玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(Gamma一對utamyltranspeptida-se,GGT)未見報道,y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是一種催化肽基轉(zhuǎn)移作用的酶,在H pylori誘導(dǎo)的線粒體介導(dǎo)的程序性細胞死亡中,主要是通過誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素c進入細胞質(zhì)和激活Caspase家族成員起作用,H pylori y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(y—glutamyl transpeptidase,GGT)在分泌和成熟后通過離子鍵與細胞膜結(jié)合,將細菌和宿主細胞直接連接起來。y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶廣泛存在于原核和真核細胞中,在動物體內(nèi)主要存在于腎、肝、胰等臟器,在谷胱苷肽的新陳代謝中起到了重要作用。

    筆者所在實驗室構(gòu)建了立枯絲核菌cDNA文庫,獲得了329個高質(zhì)量ESTs序列。為了明確GGT在病菌侵染過程中的表達情況,通過對EST數(shù)據(jù)進行分析,根據(jù)所得序列設(shè)計引物,克隆了立枯絲核菌GGT,驗證了前期EST序列測序結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,通過測定該基因在病原菌侵染過程中的表達量,探明該病原菌與寄主互作過程中的基因表達規(guī)律,為下一步研究侵染機制奠定基礎(chǔ)。

    1.材料與方法

    1.1材料

    玉米立枯絲核菌(Rhizoctonia solani AG-IlA)菌株WF-9,沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所保存。立枯絲核菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3d,刮取菌絲50~100mg,用于RNA提取、克隆。用離體葉片接種法,將培養(yǎng)3d的立枯絲核菌菌餅,放在玉米3葉1心期苗的葉片上進行接菌,分別取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片(水漬狀發(fā)病處)100mg,用于各個侵染時期基因表達量分析。所有樣品經(jīng)液氮速凍,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

    提取菌株WF-9生長第3天樣品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片總RNA,參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明提取,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量,使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度計測定濃度,使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

    1.3立枯絲核菌GGT的克隆

    筆者所在實驗室已經(jīng)構(gòu)建了玉米立枯絲核菌AG-1-IA的全長cDNA文庫,并進行了全長cDNA的隨機測序。在隨機測序中,分離出GGT EST片段,通過軟件拼接,得到長944 bp的基因,包含完整開放閱讀框。本試驗根據(jù)所得序列開放閱讀框,利用軟件primer premier 5.0設(shè)計特異性引物c06-f:5'-CACGCATACTCCCGACTACT-3和c06-r:5-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA為模板進行PCR擴增,程序為95℃ 4min;95℃45s,54℃ 45s,72℃ 1min,35個循環(huán);72℃ 10min,4℃永久保存。PCR產(chǎn)物用天根切膠回收試劑盒回收,并與pMDl9-T載體(TaKaRa,日本)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

    1.4GGT序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

    利用軟件包DNASTAR識別可讀框、推測氨基酸序列、預(yù)測等電點和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的網(wǎng)頁(http://www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/)上完成,用Mega 4.0軟件構(gòu)建GGT氨基酸系統(tǒng)進化樹。

    1.5GGT表達分析

    根據(jù)獲得的GGT核酸序列設(shè)計熒光定量PCR引物C060fr-F:5'-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3',C060fr-R:5'-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3';以立枯絲核菌GAPDH(基因登錄號AF339928)為內(nèi)參基因,設(shè)計內(nèi)參引物GAPDH—F:5'-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3',GAPDH-R:5'-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3'。反應(yīng)在BIO-RADCFX96熒光定量PCR儀(BIO—RAD,美國)上進行,反應(yīng)體系為cDNA模板(50mg/uL)2.0uL、上下游引物(10umol/L)各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL,每個樣品3個重復(fù)。反應(yīng)程序為95℃ 30s;95 qC 5 s,60 qC 30 s(single),共40個循環(huán);95℃ 1s,65℃15s,95℃(continuous),溶解曲線測定;40℃ 30s。

    2.結(jié)果與分析

    2.1GGT的cDNA克隆

    根據(jù)cDNA文庫所獲得序列開放閱讀框設(shè)計特異性引物,以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,通過PCR擴增到600bp左右GGT的cDNA(圖1)。經(jīng)測序驗證與EST片段序列一致,說明EST拼接序列結(jié)果正確。EST拼接測序得到一個長944 bp的序列,在NCBI進行BLASTx對測序結(jié)果進行同源性分析,與ganlnla-glutanlyhranspeptidase(Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP)有85%的同源性。利用NCBI站點的ORF finder進行6種可能的框架分析,發(fā)現(xiàn)該cDNA片段有一個完整的開放閱讀框,最長的閱讀框為110-802,長度為693bp,編碼230個氨基酸(圖2)。

    2.2同源性分析

    根據(jù)GGT氨基酸序列,采用BLASTX在NCBI上進行比對,下載了17條GGT同源序列,運用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示克隆GGT與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近(圖3)。

    2.3GGT在侵染各個時期表達差異分析

    利用實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù),以立枯絲核菌GAPDH為內(nèi)參,分析了GGT在立枯絲核菌不同侵染時間點(O、12、18、24、30、42、54、72 h)的表達情況。結(jié)果表明,GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達,但表達量存在明顯差異,在侵染12、18h時可能由于玉米自身防衛(wèi)反應(yīng),GGT表達量明顯下調(diào);而在24 h,GGT的表達量達到最高,可能是立枯絲核菌在寄主組織內(nèi)迅速擴展,導(dǎo)致玉米葉片細胞開始程序性死亡,GGT的表達量達到最大;侵染54、72h表達量下降到相對平穩(wěn)狀態(tài),可能是由于寄主大面積凋亡,病原與寄主互作概率減少造成的(圖4)。

    3.討論

    GGT是谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,可特異性催化y-谷氨?;霓D(zhuǎn)移反應(yīng)。GGT具有誘導(dǎo)細胞凋亡的活性,目前被廣泛接受的觀點是線粒體在凋亡的調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵的作用。GGT對細胞的基本功能是線粒體結(jié)構(gòu)的維護,對膜的完整性及細胞分化和發(fā)育具有影響。GGT在真菌、植物細胞中代謝作用一直被忽略。在哺乳動物系統(tǒng)中,該酶已被反復(fù)使用,涉及谷胱甘肽重要的抗氧化響應(yīng)功能,并與半胱氨酸輸送到組織中。敲除GGT活性基因的小鼠有異常發(fā)育和早期死亡。為了進一步弄清Rhizoctonia solani GGT在細胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染機制。本試驗采用RT—PCR、基因克隆和核酸測序技術(shù)首次獲得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列,驗證了前期EST序列測序的結(jié)果,EST拼接測序得到一個長944bp的序列,開放閱讀框為110~802,長度為693 bp,編碼230個氨基酸。相對分子量24.7ku,理論等電點4.68。為后續(xù)的功能研究、蛋白制備及其抗體研制提供了良好的試驗材料。

    經(jīng)序列比對結(jié)果顯示,本研究克隆得到的GGT與Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高,達到85%;系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果顯示與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時間點的表達特性,表明GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達,但表達量存在明顯差異,其中在病菌侵染玉米葉片24h時表達量最高。本研究只對玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(GGT)進行了克隆,對病菌侵染玉米葉片不同時期的表達量進行了分析。GGT是否參與致病,還需進一步研究。

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