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    三色堇DFR基因的克隆及表達分析

    2016-01-27 14:30孫海燕安澤偉李琴等
    江蘇農業(yè)科學 2015年11期
    關鍵詞:表達分析三色堇基因克隆

    孫海燕++安澤偉++李琴等

    摘要:從三色堇花瓣中克隆了1個花色素合成結構基因的全長cDNA,命名為VwDFR。VwDFR cDNA全長為1 340 bp,編碼347個氨基酸組成的蛋白,與胡楊的DFR序列具有較高的序列一致性。VwDFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能結構域,屬于SDR超基因蛋白家族成員。VwDFR基因在三色堇不同組織中的表達存在明顯差異,在初花期的花瓣中表達量最高,且色斑區(qū)高于非色斑區(qū)。結果說明,VwDFR可能與三色堇花色形成有關。此結果為深入研究三色堇花色形成奠定了基礎。

    關鍵詞:三色堇;DFR;基因克?。槐磉_分析;花色素合成

    中圖分類號: Q785文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2015)11-0034-04

    收稿日期:2015-05-19

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31060265、31260488);海南大學中西部計劃學科建設(編號:ZXBJH-XK008)。

    作者簡介:孫海燕(1986—),女,重慶開縣人,碩士,從事園林植物資源與遺傳改良。E-mail:shy0228@sina.com。

    通信作者:王健,男,湖北宜昌人,博士,教授,碩士生導師,從事園林植物分子生物學。Tel:0898-66267907;E-mail:wjhnau@163.com?;ㄐ螒B(tài)的多樣性是大自然最美麗的禮物之一,總是令生物學家著迷。生物學家對產(chǎn)生花卉多樣性的發(fā)育遺傳機制進行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)金魚草和矮牽牛是探索花對稱性[1]、花色[2-4]、花瓣紋理[5]的優(yōu)秀模式植物。隨著研究的深入,花斑的形成逐漸被學者關注。植物花斑是指在其花瓣大小、形態(tài)和位置上基本固定的色斑[6],主要是由于花色素在特定區(qū)域積累形成的,如三色堇黃底紫斑品種Rhinegold和白底紫斑品種Mont Blanc的花斑部分的組成色素是飛燕草素和矢車菊素[7-8]。因而,花色素在花瓣上積累的分子機理是花斑形成原因的研究重點。

    花青素又稱花色素,屬類黃酮化合物,是一類植物次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于植物細胞液泡中。自然界中主要有6類花色素,即天竺葵色素(pelargonidin)、芍藥花色素(peonidin)、矢車菊素(cyanidin)、牽牛花色素(petunidin)、飛燕草色素(delphinidin)和錦葵花色素(malvidin),其生物合成和調控已有較深入的研究?;ㄇ嗨厣锖铣赏緩降那绑w物質是 4-香豆酰CoA與3-丙二酰CoA,最后形成花的顏色涉及的一系列酶有:查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI),黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、花色素合成酶(ANS)和UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶(UFGT)等[9-10]。

    二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是花青素生物合成中類黃酮途徑的第一個酶,負責將3種二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)還原為無色花色素苷,缺失DFR活性的突變體會產(chǎn)生白色。在一些植物中,DFR有嚴格的底物特異性,不能利用二氫堪非醇(DHK)生產(chǎn)天竺葵素,因而缺乏橙/磚紅色。Johnson等將蘭屬DFR基因轉入矮牽牛后,不能有效合成天竺葵素,而將非洲菊中能有效還原DHK的DFR導入到白色矮牽牛中,得到了磚紅色花朵[11]。可見,圍繞DFR基因進行基因操作也可以改造花色。

    三色堇(Viola×wittrockiana Gams)是堇菜科堇菜屬的一種多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色豐富、明艷,花期長,是花壇、花境、盆花等常用早春花卉,有“花壇皇后”之美譽,在園林綠化方面有很高的應用價值。鑒于DFR基因對植物色彩的形成非常關鍵,分離三色堇花瓣中DFR基因并研究其表達調控特點,將有助于闡明DFR基因在三色堇花斑形成過程中的作用。本研究擬從三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全長序列,進一步對VwDFR進行生物信息學及系統(tǒng)進化分析,并采用實時熒光定量PCR技術研究VwDFR在三色堇不同組織中的表達情況。

    1材料與方法

    1.1植物材料

    本試驗材料為花色黃底黑斑的三色堇(Viola × wittrockiana Gams)品種,種植于海南大學園藝園林學院基地。

    1.2菌株與試劑

    大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株購自天根生化科技有限公司;反轉錄試劑盒(K1642)購自Fementas公司;DNA凝膠回收試劑盒購自Sigma公司;LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體和實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ購自大連寶生物公司;引物合成和測序由上海英俊生物技術有限公司完成。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

    1.3方法

    1.3.1總RNA的提取與cDNA第一鏈合成三色堇花瓣總RNA的提取采用改良Trizol法[12],其他組織的RNA提取方法按照常規(guī)方法進行。cDNA第一鏈合成使用Fementas公司逆轉錄試劑盒,操作步驟參照產(chǎn)品說明書。

    1.3.2三色堇ANS、DFR基因全長cDNA克隆比對 GenBank 上登錄的不同物種的DFR基因,依據(jù)其保守區(qū)域序列設計特異性引物,擴增得到其保守區(qū)片段,然后根據(jù)擴增得到的序列分別設計3′-RACE和5′-RACE引物(表1)擴增3′和5′端片段,具體方法參照文獻[13]。根據(jù)測序所得DFR基因的3′和5′端序列,利用DNAMAN軟件進行序列拼接,獲得其全長cDNA拼接序列。根據(jù)所得的全長拼接序列設計特異性引物(表1),使用Taq plus DNA polymerase進行全長cDNA擴增,引物終濃度為0.5 μmol/L,擴增程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共32個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化目的條帶,克隆至pMD8-T載體上,測序確認。

    1.3.3生物信息學分析利用NCBI在線Blast工具和DNAMAN軟件對全長cDNA序列進行比對分析和開放閱讀框預測;利用在線軟件Expasy進行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析;利用MEGA 5.10軟件,以鄰近法構建系統(tǒng)進化樹。

    1.3.4實時熒光定量PCR分析(qRT-PCR)采用羅氏公司的LightCycler 2.0系統(tǒng)進行熒光定量PCR,分析VwDFR基因在初花期根、莖、葉、花不同組織中的表達情況。以actin基因作為內參基因同時進行定量分析,對樣品進行均一化。反應總體系為20 μL,包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和上下游混合引物0.6 μL及ddH2O 7.4 μL;反應程序95 ℃預變性30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共45個循環(huán)。靶基因和內參基因的引物設計見表1,數(shù)據(jù)處理采用系統(tǒng)自帶軟件。

    2結果與分析

    2.1VwDFR的克隆

    搜索比對其他植物DFR基因序列并找出保守區(qū)域,利用PCR擴增得到這個基因片段的特異性條帶,長度為241 bp(圖1-A)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)它們均缺失5′和3′端,利用5′和3′RACE技術分別經(jīng)過2輪擴增,得到DFR的3′末端片段約793 bp(圖1-B)及5′末端序列約246 bp(圖1-C)。上述片段進行Blast分析,確認與其他植物DFR同源。根據(jù)測序結果拼接后,設計引物擴增得到1 340 bp全長cDNA片段(圖1-D)。

    2.2序列分析

    序列分析發(fā)現(xiàn),三色堇VwDFR基因含有1個完整的開放閱讀框,起始密碼子在85位,終止密碼子在1 128位。其開放閱讀框為1 044 bp,編碼347個氨基酸(圖2)。經(jīng)氨基酸序列保守結構域分析發(fā)現(xiàn)該基因蛋白屬于SDR蛋白家族,是SDR superfamily超基因家族中的一個,該基因家族有2個高度保守功能結構域,NADP 的結合功能域和底物特異結合功能域。如圖3所示,VwDFR基因在這2個功能域上是高度保守的。利用在線軟件Expasy分析該基因所編碼蛋白的理化性質,結果表明,VwDFR蛋白的分子量為8.61 ku,等電點為5.08,不穩(wěn)定系數(shù)為40.29,平均親水系數(shù)為0.731,屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。此外,跨膜結構區(qū)預測結果表明,VwDFR是跨膜蛋白。

    2.3系統(tǒng)進化分析

    利用DNAman軟件,根據(jù)VwDFR基因編碼的氨基酸序列,在NCBI蛋白序列庫中進行同源檢索和比較得知,該蛋白與胡楊(Populus euphratica)、可可(Theobroma cacao)、甜橙(Citrus sinensis)、蘋果(Malus domestica)等15種其他植物DFR蛋白有73%~83%的同源性,其中與胡楊DFR蛋白同源性最高,為83%。將VwDFR與這15條DFR蛋白序列進行多重比對并利用Mega 5.10構建系統(tǒng)進化樹(圖4),發(fā)現(xiàn)VwDFR 與楊柳科胡楊的 DFR 親緣關系最近。從進化樹還可

    以看出,16條DFR蛋白序列明顯地聚為2個類簇,其中 VwDFR 與甜橙、可可、胡楊等雙子葉植物的DFR聚為一支,而其他單子葉植物的DFR聚為一支??偟膩砜?,同為雙子葉的三色堇DFR基因,與雙子葉植物的親緣關系更近一些,因此DFR蛋白序列的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律。

    2.4三色堇VwDFR基因熒光定量表達分析

    在三色堇開花期進行取樣,從同一株植株的根、莖、葉、花中分別提取總RNA,反轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR分析三色堇DFR基因在根、莖、葉、花中的表達情況。結果(圖5)表明,VwDFR在三色堇的根、莖、葉和花中均有表達,但表達水平具有明顯差異。其中,在花色素大量積累的初花期花瓣中表達量最高,在莖中的表達量最低,說明VwDFR主要在花瓣中表達,且色斑區(qū)的表達水平高于非色斑區(qū)。

    3討論與結論

    本研究中利用RT-PCR同源克隆和RACE技術相結合的方法,從三色堇的花瓣中克隆得到花青素合成結構基因VwDFR全長cDNA序列。通過對其編碼的氨基酸序列保守結構域分析表明,三色堇VwDFR編碼蛋白N端存在2個高度保守功能結構域-NADP 的結合功能域和底物特異結合功能域,是植物SDR superfamily超基因家族蛋白的典型特征。本研究得到的VwDFR基因與其他植物DFR氨基酸序列的一致性較高,其中與楊柳科的胡楊DFR氨基酸序列一致性最高,為83%。且系統(tǒng)進化分析表明,VwDFR和胡楊的DFR親緣關系較近,而與單子葉植物的鳶尾、百合和小麥等的親緣關系較遠,表明VwDFR基因的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律。

    本研究中對三色堇不同組織器官的VwDFR熒光定量檢測發(fā)現(xiàn),在初花期的花瓣中表達量最高,這與李琴等的研究結果[14]一致,說明VwDFR是三色堇花色素合成的關鍵基因。此外,VwDFR在根中的表達量也較高,這可能與DFR基因的表達存在組織特異性有關[15]。

    花色素結構基因是花色素生物合成的基礎,現(xiàn)有的研究表明,植物花瓣上的花斑是由于花色素基因的差異性表達而形成的[16]。DFR基因首次從玉米(Zea mays)和金魚草(Antirrhinum majus)中分離得到,后來相繼從其他多種植物(如擬南芥、三葉草、玫瑰、蘭花、非洲菊等)中克隆出DFR[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)一些植物花瓣上花斑的形成與DFR基因的差異性表達相關,如蝴蝶蘭小丑型品種中其花瓣上大塊的紫色色斑,主要由于是DFR基因在色斑區(qū)特異性表達導致[20];在文心蘭的花瓣和萼片中,其色斑形成的基礎是因為OgCHI 和OgDFR基因表達被遏制[21];而在百合品種Sorbonne中,LhDFR在無色斑的邊緣區(qū)域表達水平很低,但在花被片的色點部位以及有色斑的中心部位高度表達[22]。

    綜上所述,筆者初步推測本試驗所克隆得到的VwDFR基因可能在三色堇花瓣中存在差異性表達,三色堇花瓣花色及色斑的形成可能與VwDFR的表達有關。本研究結果為深入揭示三色堇花色及色斑形成奠定了基礎,進而為創(chuàng)新花色奠定基礎。

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