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    雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆與表達(dá)分析

    2017-03-06 21:25張逸風(fēng)蘇平胡添源周家偉關(guān)紅雨
    中國(guó)中藥雜志 2017年1期
    關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析表達(dá)分析雷公藤

    張逸風(fēng)+蘇平+胡添源+周家偉+關(guān)紅雨+高偉+黃璐琦

    [摘要]貝殼杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途徑上的關(guān)鍵酶,參與植物生長(zhǎng)發(fā)育等重要生物學(xué)過(guò)程。該文根據(jù)雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR技術(shù)克隆得到貝殼杉烯酸氧化酶全長(zhǎng)cDNA序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;使用實(shí)時(shí)定量PCR(qRTPCR)研究基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平??寺〉玫絋wKAO長(zhǎng)度為1 874 bp,編碼487個(gè)氨基酸,蛋白相對(duì)分子質(zhì)量5602 kDa,理論等電點(diǎn)889;經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)后,TwKAO基因相對(duì)表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值;經(jīng)植株組織表達(dá)分析證實(shí),TwKAO基因在雷公藤的葉中表達(dá)量最高,根中最低。該研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表達(dá)特征,為深入研究雷公藤生長(zhǎng)發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝研究奠定基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞]雷公藤; 貝殼杉烯酸氧化酶(KAO); 克??; 生物信息學(xué)分析; 表達(dá)分析

    藥用植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f系衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物,臨床中多使用其根或根的木質(zhì)部入藥,具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性,可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫疾病。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),雷公藤中重要的二萜類成分雷公藤甲素在抗腫瘤尤其是治療胰腺癌[12]方面具有顯著療效。由于其廣泛的藥理活性,對(duì)雷公藤有效成分藥理作用、生物合成等方面的研究得到越來(lái)越多的關(guān)注[35]。

    赤霉素是植物生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少的激素,參與植物生長(zhǎng)包括種子萌發(fā),莖伸長(zhǎng)以及開花等過(guò)程。而赤霉素的生物合成過(guò)程中,從ent貝殼杉烯、ent貝殼杉醇、ent貝殼杉醛到ent貝殼杉酸,再到ent7過(guò)羥基貝殼杉烯酸等連續(xù)反應(yīng)都是由 CYP450催化而成[6]。貝殼杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase,KAO)參與從貝殼杉烯酸到GA12的反應(yīng)過(guò)程[7],其屬于細(xì)胞色素P450中CYP88A亞家族,參與赤霉素生物合成途徑中3步連續(xù)的催化反應(yīng)[8]。目前,KAO基因已從小麥[910],豌豆[11],梨[12]等植物中克隆得到,并研究其缺失對(duì)向日葵矮小突變體的影響[13]。

    雷公藤中KAO基因尚未克隆得到,因此本研究以雷公藤懸浮細(xì)胞為研究材料,克隆得到長(zhǎng)度為1 874 bp的TwKAO基因,研究其在茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)后240 h內(nèi)基因的表達(dá)水平,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供寶貴的基因資源。

    1材料

    11植物雷公藤懸浮細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)中藥資源與分子生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室繼代保存。培養(yǎng)條件:05 mg·L-1 2,4D + 01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液體培養(yǎng)基,25 ℃,120 r·min-1避光培養(yǎng)。

    12菌株及載體Escherichia coli Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASYT3 vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    13儀器與試劑VeritiTM 96孔梯度PCR儀,TF 7500 型Real Time PCR System為美國(guó) Applied Biosystems 公司,318k型高速冷凍離心機(jī)為SIGMA公司;PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer購(gòu)自美國(guó)NEB公司;Fast Quant RT Kit (With gDNase)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,EastepSuper總RNA提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,測(cè)序服務(wù)由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

    2方法

    21RNA提取與純化使用CTAB法提取雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA并依據(jù)RNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行純化,通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

    22全長(zhǎng)cDNA克隆與測(cè)序使用Fast Quant RT Kit將雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物

    24TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析于雷公藤懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)12 d后,使用茉莉酸甲酯(50 μmol·L-1)誘導(dǎo),設(shè)置對(duì)照組。于誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)(0,12,24,48,72,240 h)取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置4個(gè)平行樣品。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因,根據(jù)所得TwKAO序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量特異性引物。提取雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系:10 μL 2×SYBR green Mix,04 μL ROXHigh、正反引物(10 μmol·L-1)各 04 μL,78 μL ddH2O和1 μL cDNA 。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3次,用 2-ΔΔCt法分析其mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    25TwKAO基因的組織表達(dá)分析使用EastepSuper總RNA提取試劑盒,分別提取3株生長(zhǎng)年限相近的雷公藤植株根、莖、葉RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因,進(jìn)行TwKAO基因的組織表達(dá)分析。方法同誘導(dǎo)表達(dá)分析方法。

    3結(jié)果與分析

    31TwKAO基因全長(zhǎng)cDNA獲得對(duì)雷公藤轉(zhuǎn)錄組設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行全長(zhǎng)PCR,克隆獲得長(zhǎng)度為1 874 bp的TwKAO全長(zhǎng)序列,見(jiàn)圖1。

    32TwKAO基因序列分析TwKAO全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1 874 bp,在152~1 615 bp位置具有完整的開放閱讀框(ORF),推測(cè)編碼487個(gè)氨基酸,序列的1~151 bp為5′UTR,1 616~1 874 bp為3′UTR。BLAST結(jié)果顯示,其與板栗Castanea mollissima相似度76%,與可可樹Theobroma cacao相似度76%,與川桑Morus notabilis相似度74%,與蘋果Malus domestica相似度74%,與西洋梨Pyrus communis相似度73%。使用DNAMAN軟件將TwKAO與板栗(AEF32085),川桑(XP_0100977241),蘋果(AGI656301),西洋梨(AGF252661),木豆(KYP520511),毛國(guó)楊(XP_0023194471)KAO氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì),結(jié)果表明相似度高達(dá)8220%。結(jié)合Interpro Scan結(jié)構(gòu)域分析,TwKAO存在高度保守區(qū)Cytochrome P450 cysteine hemeiron ligand signature(427~436 aa位):[FW][SGNH]x{F}[RKHPT]{P}C[LIVMFAP][GAD],見(jiàn)圖2,亞鐵血紅素活性位點(diǎn)見(jiàn)圖中標(biāo)注。

    33TwKAO氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析將TwKAO與GenBank下載的其他物種 KAO氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,利用 MEGA 60軟件采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,見(jiàn)圖3。選取15種植物(包括13種雙子葉植物,1種單子葉植物,1種蕨類植物)和2種真菌的KAO氨基酸序列,從進(jìn)化樹中可以看出:雙子葉植物、單子葉植物、蕨類植物、真菌聚成單獨(dú)的分支,其中TwKAO歸為雙子葉植物分支。

    34TwKAO理化性質(zhì)及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用ExPASy在線軟件ProtParamtool預(yù)測(cè)TwKAO蛋白得到其相對(duì)分子質(zhì)量5602 kDa,理論等電點(diǎn)889;帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)52,帶正電荷的殘基(Arg+Lys)60;不穩(wěn)定系數(shù)3892,蛋白分類屬于穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)8969,該蛋白為親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明TwKAO為非分泌蛋白,不具有信號(hào)肽;亞細(xì)胞定位分析顯示其可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng);同時(shí)跨膜域分析顯示,TwKAO位于膜外,為非膜蛋白。三維同源模型見(jiàn)圖4,以2ve31A蛋白為模板,用于建立模型的氨基酸殘基為36~482位,序列同源性2827%。

    35TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MeJA處理后不同時(shí)期雷公藤懸浮細(xì)胞中TwKAOmRNA表達(dá)情況,采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析,見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示,雷公藤懸浮細(xì)胞在受到MeJA刺激后12 h,TwKAO的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,為同時(shí)期對(duì)照組的242倍,后相對(duì)表達(dá)量迅速降低回復(fù)至正常水平。

    36TwKAO基因的組織表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3株生長(zhǎng)年限相近的雷公藤植株不同組織部位(根、莖、葉)TwKAO基因表達(dá)情況,見(jiàn)圖6。TwKAO基因的表達(dá)量在根、莖、葉中依次升高。葉中表達(dá)量最高,是莖表達(dá)量的149倍,是根中表達(dá)量的396倍。

    4討論

    植物赤霉素作為重要調(diào)節(jié)激素參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育,而赤霉素缺乏易引起植物發(fā)育不良,出現(xiàn)異于正常生長(zhǎng)的矮小突變株。因此,對(duì)植物赤霉素生物合成途徑的解析及其關(guān)鍵酶的挖掘顯得尤為重要。本研究首次從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因,經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域分析顯示其含有細(xì)胞色素P450的亞鐵血紅素活性位點(diǎn),同時(shí)與其他已知物種KAO氨基酸序列相似度較高,因此命名為TwKAO。

    KAO基因在不同品種及不同組織部位表達(dá)水平各不相同,在種子、葉等赤霉素合成較為旺盛的組織中表達(dá)量較高[12]。MeJA作為一種常用的誘導(dǎo)子,對(duì)種子萌發(fā),根生長(zhǎng),果實(shí)成熟及衰老均有調(diào)節(jié)作用[14]。另外,茉莉酸類成分促使植物防御反應(yīng)以應(yīng)對(duì)蟲害、各種病原體及環(huán)境脅迫,如干旱、低溫和鹽脅迫等。Sophie等[15]通過(guò)MeJA處理擬南芥葉和根,發(fā)現(xiàn)氫過(guò)氧化物含量提高,表明體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。他們選擇擬南芥氧化還原反應(yīng)蛋白作為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)比熒光標(biāo)記和蛋白膠,確定大量氧化還原應(yīng)答,MeJA處理后蛋白大量變化以應(yīng)對(duì),同時(shí),壓力和防御蛋白也大量表達(dá)。此外,那些參與茉莉酸生物合成、次生代謝反應(yīng)、細(xì)胞壁合成、編碼壓力保護(hù)和防御的基因都可被MeJA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[16]。本研究選擇雷公藤懸浮細(xì)胞繼代后12 d作為誘導(dǎo)初始時(shí)間,排除了細(xì)胞生長(zhǎng)及逆境等因素造成植物基因表達(dá)的干擾,細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,對(duì)照組可見(jiàn)基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。經(jīng)過(guò)MeJA誘導(dǎo)后,TwKAO相對(duì)表達(dá)量?jī)H在12 h達(dá)到峰值,為同時(shí)期對(duì)照組的242倍,后迅速下降至正常水平,符合MeJA對(duì)于植物誘導(dǎo)引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)規(guī)律。后期可以進(jìn)一步分析赤霉素作為促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素與同樣對(duì)萜類次生代謝具有調(diào)節(jié)作用的MeJA二者生物合成途徑的關(guān)聯(lián)性。本研究成功克隆獲得雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因,為深入研究雷公藤生長(zhǎng)發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝提供寶貴的基因資源。

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