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    基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展及其在中藥研究中的前景展望

    2017-03-06 21:12:12馬琰巖
    中國(guó)中藥雜志 2017年1期

    馬琰巖

    [摘要]基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)對(duì)基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾的技術(shù),可對(duì)特定DNA片段進(jìn)行敲除、加入和替換等,從而在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯。其技術(shù)本質(zhì)均是利用非同源末端鏈接途徑修復(fù)和同源重組修復(fù),聯(lián)合特異性DNA靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變?;蚓庉嫾夹g(shù)在科研、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域都具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。在疾病基因治療領(lǐng)域,基因編輯技術(shù)在癌癥如白血病、遺傳性疾病如血友病、地中海貧血、多種肌肉營(yíng)養(yǎng)障礙癥和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)傳染病如艾滋病等疾病的治療方面取得許多堪稱(chēng)跨時(shí)代的佳績(jī):結(jié)合基因編輯技術(shù)開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)新方法學(xué)研究及動(dòng)物模型的制備工作也在迅猛地發(fā)展和完善;世界各地的實(shí)驗(yàn)室也已將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于預(yù)防瘧疾、器官移植、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種改良、滅絕物種復(fù)活等多個(gè)研究領(lǐng)域。該文就基因編輯技術(shù)在上述領(lǐng)域中的研究進(jìn)展進(jìn)行一些概括和總結(jié)。此外還歸納了一些當(dāng)前針對(duì)基因編輯技術(shù)存在的爭(zhēng)議和思考,并初步探討了該技術(shù)在中藥研究中的潛在應(yīng)用前景。

    [關(guān)鍵詞]基因編輯技術(shù); CRISPR/CAS9; ZFNs; TALENs

    基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)對(duì)基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾的技術(shù),可對(duì)特定DNA片段進(jìn)行敲除、加入和替換等,從而在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯。此過(guò)程模擬了基因的自然突變,修改并編輯了生物的基因組,使研究人員可以在極短時(shí)間內(nèi)模擬自然界漫長(zhǎng)時(shí)間的基因演變,甚至能夠完成自然進(jìn)化中無(wú)法完成的基因組改變。在科研領(lǐng)域,該技術(shù)可以快速構(gòu)建模式動(dòng)物,節(jié)約大量科研時(shí)間和經(jīng)費(fèi);在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,該技術(shù)可以人為改造基因序列,使之符合人們的要求,研制如改良水稻等糧食作物;在醫(yī)療領(lǐng)域,該技術(shù)可以更加準(zhǔn)確、深入地了解疾病發(fā)病機(jī)制和探究基因功能,以及改造人的基因,達(dá)到基因治療的目的等。因此,基因編輯技術(shù)具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。

    1基因編輯技術(shù)的基本原理

    鋅指核酸酶(zincfinger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcription activatorlike effector nucleases,TALENs)和成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是三大基因編輯技術(shù)。這3種技術(shù)皆是通過(guò)在特定的靶向序列處引入雙鏈斷裂缺口(doublestrand break,DSB),繼而通過(guò)NHEJ途徑(nonhomologous end joining,NHEJ)和HR(homologous recombination,HR)途徑這2種細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)。NHEJ途徑(nonhomologous endjoining,NHEJ)使基因組DNA缺口處有堿基的插入或者缺失,造成移碼突變,導(dǎo)致基因的敲除;HR(homologous recombination,HR)途徑在提供外源DNA模板的條件下使基因組DNA得到精確的基因修復(fù)或靶向基因的添加[1]。由此可見(jiàn),這3種基因編輯技術(shù)本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑修復(fù)和同源重組修復(fù),聯(lián)合特異性DNA靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。

    11ZFNs每個(gè)鋅指核酸酶單體都是由鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)與非特異核酸酶結(jié)合的人工合成酶。此酶的N端部分是能識(shí)別含有特定DNA序列的鋅指蛋白,C端部分則由非特異性切割結(jié)構(gòu)域Fok I以及連接DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)切酶的肽段組成[23]。ZFN的特異性取決于ZFP,因此篩選高質(zhì)量的ZFP是獲得高效、特異性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3~6個(gè)鋅指組成,每個(gè)鋅指識(shí)別基因組中連續(xù)的3個(gè)堿基。ZFP一旦與基因組中的特定序列結(jié)合,F(xiàn)ok I核酸內(nèi)切酶便會(huì)形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性,產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的缺口,繼而通過(guò)細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂部位的基因進(jìn)行修飾[811](圖1)。ZFN的基因打靶效率一般能夠達(dá)到30%,可以做到針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)ZFN來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的修飾。然而ZFN識(shí)別結(jié)構(gòu)域存在的上下文依賴(lài)效應(yīng)大大降低了ZFN設(shè)計(jì)和篩選效率。目前尚不能針對(duì)任意一段序列均可設(shè)計(jì)出滿(mǎn)足要求的ZFN,也不能在每一個(gè)功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點(diǎn)。在ZFN的篩選和設(shè)計(jì)方面存在較大的技術(shù)困難之外,其制備價(jià)格也比較昂貴。此外,ZFN的脫靶切割也往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。綜上這些因素使得ZFN在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的局限性。

    12TALENsTALEN是植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas sp.產(chǎn)生的TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組合而成的一類(lèi)重組核酸酶。TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域是該蛋白識(shí)別特異DNA序列的結(jié)構(gòu)域。它包含了155~195個(gè)蛋白單元模塊,每個(gè)模塊單元有34個(gè)氨基酸殘基,其中除第12和13位氨基酸可變外,其他氨基酸都是保守的。因此,這第12和13位氨基酸被稱(chēng)作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(repeat variable diresidues,RVDs) 位點(diǎn)[12],是靶向識(shí)別的關(guān)鍵。由于TALE存在多種變體,所以可以構(gòu)建出靶向基因組中預(yù)設(shè)DNA靶位點(diǎn)的多種TALEN。相比ZFN技術(shù),TALEN使用了TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域代替ZFP作為人工核酸酶的識(shí)別結(jié)構(gòu)域,更好地解決了DNA序列識(shí)別特異性低的問(wèn)題。TALE蛋白中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域?qū)A基的識(shí)別只由2個(gè)氨基酸殘基決定:組氨酸天冬氨酸特異識(shí)別堿基C,即HD(His Asp)C;天冬酰胺異亮氨酸識(shí)別堿基A,即NI(Asn Ile)A;天冬酰胺甘氨酸識(shí)別堿基T,即NG (AsnGly)T;天冬酰胺天冬酰胺識(shí)別堿基G或A,即NN(AsnAsn)G或A;天冬酰胺賴(lài)氨酸識(shí)別堿基G,即NK(Asn Lys)G;天冬酰胺絲氨酸可以識(shí)別A,T,G,C 中的任一種NS (AsnSer)A,T,C,G [1314](圖2)。這種與DNA堿基一一對(duì)應(yīng)的方式在設(shè)計(jì)上相對(duì)于ZFN要簡(jiǎn)單得多。然而,在實(shí)際構(gòu)建過(guò)程中,TALE分子的模塊組裝和篩選過(guò)程也比較繁雜,通常需要大量的測(cè)序工作。這使得該技術(shù)的使用成本較高,對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低。此外,TALEN分子比ZFN大得多,因而在不能高效導(dǎo)入細(xì)胞方面也限制了它的應(yīng)用。

    13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein)系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[15],由成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR與Cas蛋白組成,能特異性識(shí)別外源病毒或質(zhì)粒的核酸物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行剪切,起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成一段非編碼RNA,即CRISPR前體

    的靶標(biāo)可設(shè)計(jì)為針對(duì)一個(gè)基因,也為針對(duì)多個(gè)基因,都能達(dá)到有效的特異性位點(diǎn)編輯的效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被公認(rèn)為是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)”、“類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)”之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。ZNFs和TALENs作用時(shí)均是采用蛋白質(zhì)對(duì)DNA序列的識(shí)別,而CRISPR/Cas9對(duì)靶序列的識(shí)別是RNA與DNA的堿基配對(duì)過(guò)程。該識(shí)別方式使得CRISPR/Cas9與前二者相比更為精準(zhǔn),降低了脫靶切割的幾率,減低了細(xì)胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通過(guò)導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá),因此也省去了耗時(shí)耗力的蛋白質(zhì)工程過(guò)程。同時(shí),研究人員可以通過(guò)生物信息學(xué)分析,設(shè)計(jì)出針對(duì)絕大多數(shù)基因的特異性靶標(biāo)識(shí)別crRNA。因此,與前2代技術(shù)相比,CRISPR/Cas9成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效、脫靶率低的優(yōu)點(diǎn)使其迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室,成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具,逐漸成為當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的技術(shù)之一。然而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在著一些不完美之處:Cas9 蛋白對(duì)于目標(biāo)序列的識(shí)別除了依靠crRNA序列的匹配之外,目標(biāo)序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM),因此Cas9 蛋白對(duì)于設(shè)定序列的切割仍有局限性;另外和ZFNs及TALENs技術(shù)一樣,CRISPR/Cas9也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復(fù)可能會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問(wèn)題。

    14 NgAgoCRISPR是以RNA為向?qū)ふ野邢蛐蛄?,而NgAgo則是以DNA來(lái)?yè)?dān)任向?qū)Аmn春雨等的工作顯示,NgAgo可結(jié)合24個(gè)堿基的gDNA,比CRISPR結(jié)合19個(gè)堿基的gRNA要長(zhǎng)5個(gè)堿基,因此理論上精確性要高1 024倍,脫靶率也較低。然而,不同于CRISPR/Cas9技術(shù)大量運(yùn)用已獲得了實(shí)踐驗(yàn)證,NgAgo的作用效果還有待于今后工作的檢驗(yàn)。

    2基因編碼技術(shù)的應(yīng)用

    21在基因治療中的應(yīng)用隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和以DNA重組技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及人類(lèi)對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的不斷深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明,許多疾病都與基因突變、缺失或表達(dá)異常有關(guān),由此基因治療技術(shù)順勢(shì)而生?;蛑委熓侵笐?yīng)用基因工程技術(shù)將正常基因或有治療作用的基因引入患者細(xì)胞內(nèi),以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)基因修飾來(lái)治療疾病。近兩三年來(lái),基因編碼技術(shù)作為該策略的新生力量開(kāi)始活躍在基因治療的舞臺(tái)上,在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面取得許多堪稱(chēng)跨時(shí)代的佳績(jī)。

    癌癥治療方面:2015年11月英國(guó)倫敦大奧蒙德街醫(yī)院(Great Ormond Street Hospital)的醫(yī)生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的療法,成功地治愈了一名患有“無(wú)法治愈的”白血病的1歲女孩“萊拉”(Layla)。其治療方案是利用TALEN蛋白對(duì)異體T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯,去除內(nèi)源性TCR(提高腫瘤殺傷特異性)及CD52(避免藥物alemtuzumab的干擾),并命名為antiCD19 CART細(xì)胞,再將這些經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的“人工培育的免疫細(xì)胞”輸入患者體內(nèi)去捕捉和殺傷腫瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)1個(gè)月的治療,這名女孩目前擺脫了癌癥,身體狀況很不錯(cuò),成為世界上首次用基因編輯治愈的白血病女孩[18]。此外,科學(xué)家們?cè)谶^(guò)去的幾十年中已經(jīng)確定了許多腫瘤治療中相關(guān)的基因,包括原癌基因、抑癌基因、基因組修飾類(lèi)、基因抗藥性基因。近2年,研究者們已經(jīng)開(kāi)始利用基因編碼技術(shù)對(duì)上述基因開(kāi)展了大規(guī)模的基因編輯修飾研究,預(yù)計(jì)今后幾年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)多項(xiàng)癌癥治療方面的重大突破。

    遺傳性疾病治療方面:2015年底《Nature》雜志發(fā)表的對(duì)2016年熱點(diǎn)研究領(lǐng)域的展望(The science to look out for in 2016)中提到美國(guó)加利福尼亞州里士滿(mǎn)Sangamo生物科學(xué)公司將計(jì)劃開(kāi)展利用ZFN糾正導(dǎo)致血友病基因缺陷的人體試驗(yàn),并對(duì)其研究成果表示非常期待。另外該公司還與馬薩諸塞州劍橋市的Biogen公司合作開(kāi)始了另一項(xiàng)試驗(yàn),嘗試通過(guò)該技術(shù)提高β地中海貧血患者體內(nèi)一種血液球蛋白的功能[19]。已有研究證實(shí)人β珠蛋白(HBB)基因的突變可能導(dǎo)致地中海貧血癥。我國(guó)中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù),修改了人類(lèi)胚胎HBB基因的DNA,為治療地中海貧血癥提供了可能。該研究中一共使用了86個(gè)胚胎,48 h后有71個(gè)胚胎存活,其中在54個(gè)接受了基因測(cè)試的胚胎中僅有28個(gè)胚胎的基因被成功修改,但其中只有一小部分包含替代的遺傳物質(zhì)。該研究是史上第一例利用基因編輯技術(shù)改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的案例。盡管該研究使用的胚胎均為無(wú)法發(fā)育成嬰兒、不能正常出生的胚胎,該成果的倫理問(wèn)題在西方仍引發(fā)巨大爭(zhēng)議,由此《Nature》的記者和編輯們最終將黃軍就選入了年度十大人物之列[20]。多種肌肉營(yíng)養(yǎng)障礙癥(duchenne muscular dystrophy,DMD)是表達(dá)dystrophin蛋白的基因發(fā)生移碼突變,導(dǎo)致不能形成有功能的抗肌萎縮蛋白dystrophin所引發(fā)的一種遺傳性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技術(shù)成功修復(fù)了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年,西南醫(yī)學(xué)中心的Chengzu Long,杜克大學(xué)的Charles Gersbach,哈佛大學(xué)Amy Wagers 與MIT張鋒合作研究組這3個(gè)獨(dú)立的研究組又分別完成了小鼠成年體的基因修復(fù)。其中Chengzu Long研究組的研究方案為利用腺病毒將gRNA以及CRISPR/Cas9導(dǎo)入肌肉細(xì)胞,利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DNA片段,使小鼠能夠產(chǎn)生較短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

    逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)傳染病的治療方面:HIV病毒的基因會(huì)整合到病人的基因組上。利用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療僅能抑制HIV病毒的復(fù)制但對(duì)整合在細(xì)胞中的病毒DNA不起作用,一旦停止服用藥物這些病毒余孽就會(huì)起死回生,開(kāi)始產(chǎn)生艾滋病原體。因此只有清除整合在宿主靶細(xì)胞上的HIV病毒基因才能實(shí)現(xiàn)根治艾滋病的夢(mèng)想。2013 年,朱煥章等設(shè)計(jì)并獲得了一對(duì)能特異靶向多數(shù)HIV亞型基因保守區(qū)LTR (long terminal repeat) 的ZFN,并證實(shí)該ZFN能特異性靶向HIV感染及潛伏細(xì)胞系上的HIV1前病毒LTR,且介導(dǎo)了HIV1整合基因的高效切除,從而獲得了顯著抗HIV感染的效果[22]。今年,Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)使帶有HIV病毒的T細(xì)胞失去活性,同時(shí)病毒復(fù)制在受感染細(xì)胞中降低了90%。這一治療方案預(yù)計(jì)在兩三年后開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

    22在新方法學(xué)及動(dòng)物模型制備上的應(yīng)用當(dāng)前,各類(lèi)基因敲除(knockout)和基因嵌入/置換(knockin)基因工程動(dòng)物及細(xì)胞系已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律、研究疾病預(yù)防和治療的重要實(shí)驗(yàn)工具和手段。傳統(tǒng)的基因工程動(dòng)物制備工藝——基因打靶技術(shù)是基于胚胎干細(xì)胞的一種同源重組技術(shù)。利用該技術(shù)制備基因修飾動(dòng)物周期較長(zhǎng)且存在生殖系統(tǒng)傳遞失敗的風(fēng)險(xiǎn)。新型的基因編碼技術(shù)系統(tǒng)可在小鼠受精卵中直接進(jìn)行基因組編輯,因而快速、高效、低成本、無(wú)物種限制地一步生成基因工程動(dòng)物。復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,F(xiàn)Ⅸ)基因敲除,快速、高效地構(gòu)建血友病乙模型小鼠,以期為血友病乙的研究提供更加便捷的途徑[24]。Park 等[25]使用TALEN 技術(shù)將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中含有F8 基因的140 kb染色體片段倒置,建立了小鼠血友病A模型,并且再次通過(guò)TALEN基因編輯工具將其之前倒置的染色體片段再重新恢復(fù)到正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TALEN基因編輯工具既可以建立疾病模型,又可以介導(dǎo)疾病的再次糾正。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組,將有絲分裂降解結(jié)構(gòu)域MD(Mitosisspecial degradation domain,MD)插入到進(jìn)基因組表達(dá)框上游,以期周期性持續(xù)降解細(xì)胞內(nèi)CTCF(CCCTC binding factor,CTCF)蛋白,從而獲得CTCF蛋白特異性降解細(xì)胞系,為后續(xù)研究CTCF功能奠定基礎(chǔ)[26]。

    此外,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,基因編輯技術(shù)已經(jīng)變?yōu)榭蒲腥藛T的新寵,越來(lái)越多的科學(xué)家運(yùn)用其與其他技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行各種學(xué)術(shù)研究。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院和重慶大學(xué)的研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)方法,用GFP標(biāo)記HCC細(xì)胞中的內(nèi)源多功能性因子Nanog,證明雄激素/雄激素受體軸可以通過(guò)直接結(jié)合其啟動(dòng)子,增加Nanog的表達(dá),并促進(jìn)HCC細(xì)胞的干性和腫瘤發(fā)生[27],從而初步闡明了肝癌發(fā)生的性別差異的機(jī)制。CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟使得利用多重sgRNA載體高效、高通量編輯細(xì)胞內(nèi)基因成為可能,為新型功能遺傳篩選創(chuàng)造了條件。IAA2(indole acetic acid 2)是擬南芥Aux/IAA生長(zhǎng)素響應(yīng)基因大家族中的一員。由于沒(méi)有該基因的失去功能型突變體,其功能和作用機(jī)制的研究受到了阻礙。研究人員在GoldenGate克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上,將每3個(gè)sgRNA串聯(lián)到同一個(gè)入門(mén)載體中,再將入門(mén)載體與含Cas9表達(dá)框的目標(biāo)載體LR反應(yīng),獲得最終的表達(dá)載體。結(jié)果表明,設(shè)計(jì)的6個(gè)sgRNA有4個(gè)發(fā)揮了作用,產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變,所得到的突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

    23其他應(yīng)用前景目前,世界各地的實(shí)驗(yàn)室已將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

    預(yù)防瘧疾:利用CRISPR/Cas9對(duì)蚊子的基因進(jìn)行改造,使其攜帶一種抗瘧疾的基因,從而對(duì)瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生抑制,進(jìn)而遏制瘧疾的傳播[29]。另一種改造為導(dǎo)入不孕基因,使瘧蚊滅絕[30]。

    器官移植:利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),對(duì)豬胰島素基因進(jìn)行了無(wú)痕定點(diǎn)修飾,使豬胰島素基因編碼生產(chǎn)人胰島素,成功建立了完全分泌人胰島素的基因編輯豬。這為糖尿病人提供更為理想的臨床異種胰島移植供體。另外,有研究改造了豬肺基因以利于用于人體肺移植,以及去除了豬器官上的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)以防止移植器官帶來(lái)的病毒感染[31]。

    生物制藥:北京蛋白質(zhì)組研究中心張普民教授及其研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)豬受精卵的基因組進(jìn)行了基因編輯,在豬白蛋白的基因區(qū)域插入了人白蛋白的編碼DNA,使豬只產(chǎn)生人白蛋白而不產(chǎn)生豬白蛋白[32]。

    農(nóng)業(yè)育種改良:利用CRISPR/Cas9技術(shù)幾年內(nèi)可實(shí)現(xiàn)至少50~100年才能完成的育種改良工作。圣保羅Recombinetics公司利用該技術(shù)培育出不會(huì)長(zhǎng)角的牛,從而使牛無(wú)須經(jīng)歷被切去牛角的痛苦過(guò)程。目前該公司正致力于培育永遠(yuǎn)不需要被閹割的豬。

    滅絕物種復(fù)活:加州大學(xué)圣克魯斯分校Ben Novak將滅絕的候鴿的博物館標(biāo)本DNA與現(xiàn)存鴿子進(jìn)行序列比對(duì),并嘗試對(duì)現(xiàn)存鴿子進(jìn)行基因改造,使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿。

    3基因編碼技術(shù)的爭(zhēng)議與思考

    基因編輯技術(shù)可謂當(dāng)今生命科學(xué)界炙手可熱的前沿科技。顧名思義,該技術(shù)能夠?qū)ψ罨镜倪z傳單位——基因直接進(jìn)行設(shè)計(jì)和修改,其意義和價(jià)值可想而知。這使得各大公司迅速加入到基因編輯的產(chǎn)業(yè)之中。2015年8月,比爾及梅林達(dá)·蓋茨基金會(huì)和谷歌風(fēng)投基金投資Editas醫(yī)藥公司1.2億美元;2015年10月杜邦與Caribou生物科學(xué)公司達(dá)成了合作協(xié)議,使用CrisprCas9技術(shù)來(lái)改進(jìn)農(nóng)作物(http://wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869)。中國(guó)基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)已走在世界的前列:在CRISPR技術(shù)發(fā)表論文數(shù)上中國(guó)僅次于美國(guó),位居世界第2;目前50多家中國(guó)研究機(jī)構(gòu)已提交了基因編輯專(zhuān)利;勁嘉股份與黃軍就團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)展CRISPR技術(shù)治療地中海貧血在臨床應(yīng)用方面的研究。中泰證券的分析師認(rèn)為未來(lái)5年僅地中海貧血基因治療的國(guó)內(nèi)潛在市場(chǎng)空間超過(guò)500億元。與此同時(shí),隨著基因編碼技術(shù)的不斷發(fā)展,CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對(duì)前兩代技術(shù)效率提升了10倍以上,操作容易程度提升了100~1 000倍,構(gòu)建周期縮短至原來(lái)的1/12,成本由5 000美元降低至30美元,脫靶率依據(jù)最新技術(shù)已降低至目前檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)不到的水平。脫靶率、效率、便攜性及成本的極大改善,使得該技術(shù)更平民化,技術(shù)門(mén)檻越來(lái)越低。它已成為許多車(chē)庫(kù)生物學(xué)家/草根生物學(xué)家以及生物黑客的新寵。都柏林生物黑客和企業(yè)家Andreas Stürmer說(shuō),CRISPR是有史以來(lái)最了不起的工具,可以在自己的家里玩(http://wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236)。

    但任何事物都有其雙面性,基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)雖然能夠造福于人類(lèi),然而上面所述的巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)以及越來(lái)越低的技術(shù)門(mén)檻,再加上人類(lèi)對(duì)自身健康改良的迫切心態(tài)極可能導(dǎo)致對(duì)該技術(shù)的濫用,進(jìn)而對(duì)人類(lèi)和地球環(huán)境形成威脅,甚至造成意想不到的生態(tài)災(zāi)難。在美國(guó)國(guó)家情報(bào)總監(jiān)詹姆斯·克拉珀的威脅評(píng)估報(bào)告中,“基因編輯”已經(jīng)被列入“大規(guī)模毀滅性武器和武器的擴(kuò)散”威脅名單,與核武器并列(https://wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/)。因此,關(guān)于該技術(shù)運(yùn)用的爭(zhēng)議從其誕生之日就已出現(xiàn),并呈愈演愈烈之勢(shì)?,F(xiàn)有爭(zhēng)議最集中之處為關(guān)于人類(lèi)胚胎改造的倫理學(xué)爭(zhēng)議。史上第一、二例基因編輯技術(shù)改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的研究皆出現(xiàn)在中國(guó)。2015年4月,中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù),為治療地中海貧血癥修改了人類(lèi)胚胎基因組[33]。2016年4月29日廣州醫(yī)科大學(xué)范勇團(tuán)隊(duì)發(fā)表論文,宣布他們用基因編輯技術(shù)制造出一個(gè)能對(duì)艾滋病毒免疫的人類(lèi)胚胎[34]。盡管這2例基因編輯研究都使用的是人類(lèi)三核受精卵(不能正常發(fā)育的受精卵),但在國(guó)際上仍引起了廣泛的關(guān)注和全球科學(xué)家激烈的討論。討論的焦點(diǎn)不在于文章的學(xué)術(shù)價(jià)值,而在于改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的倫理問(wèn)題。由于基因編譯技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題迫在眉睫,2015年12月1日,由美國(guó)國(guó)家科學(xué)院、美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)院、中國(guó)科學(xué)院和英國(guó)皇家學(xué)會(huì)聯(lián)合組織召集的人類(lèi)基因組編輯國(guó)際峰會(huì)在華盛頓召開(kāi)。會(huì)議重點(diǎn)了解各方對(duì)基因編輯技術(shù)的倫理問(wèn)題的態(tài)度和想法。美國(guó)再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟主席蘭菲爾(Edward Lanphier)等在《Nature》雜志上發(fā)表評(píng)論文章稱(chēng),希望研究人員暫時(shí)不要對(duì)人類(lèi)生殖細(xì)胞進(jìn)行基因編輯,否則可能對(duì)后代產(chǎn)生無(wú)法預(yù)測(cè)的后果[35]。然而,人類(lèi)胚胎改造的研究終究為大勢(shì)所趨。2016年2月1日,英國(guó)政府批準(zhǔn)了倫敦弗朗西斯·克里克研究所 Kathy Niakan研究員對(duì)人類(lèi)胚胎進(jìn)行編輯的請(qǐng)求。這項(xiàng)研究成為世界首例獲國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的人類(lèi)胚胎編輯研究。

    綜上所述,日漸成熟的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為了強(qiáng)力的生物、醫(yī)學(xué)工具,在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面帶了巨大的突破,可以快速構(gòu)建實(shí)驗(yàn)新方法和動(dòng)物模型,推動(dòng)科研的發(fā)展,并在器官移植、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種改良、滅絕物種復(fù)活和中藥現(xiàn)代化等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。其價(jià)值甚至引起了普通民眾的廣泛關(guān)注。人類(lèi)暢想將來(lái)它不僅可去除遺傳缺陷、治療疾病,還可導(dǎo)入長(zhǎng)壽、健康、強(qiáng)力的基因,甚至制造完美人類(lèi)。當(dāng)然,任何事物都是一把雙刃劍,在樂(lè)觀(guān)暢想基因編輯技術(shù)可使人類(lèi)變得更加完美的同時(shí),也不要忘記濫用技術(shù)可能帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)災(zāi)難。建立針對(duì)基因編輯技術(shù)安全有效的檢測(cè)手段,制定合理健全的法律道德制度,才能使這項(xiàng)技術(shù)更好地應(yīng)用和造福人類(lèi)。

    4基因編輯在中藥發(fā)展中的潛在前景

    如何讓傳統(tǒng)中藥跟上生命科學(xué)現(xiàn)代化的步伐,使傳統(tǒng)中醫(yī)藥走出國(guó)門(mén),讓世界接受中草藥,是當(dāng)今中醫(yī)藥工作者面臨的難題。長(zhǎng)期以來(lái),由于中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)之間缺乏有效溝通的橋梁,有逐漸被邊緣化的趨勢(shì)。中藥基因組計(jì)劃將現(xiàn)代生命科學(xué)的最新技術(shù)和研究成果應(yīng)用于中藥研究,有望徹底改變中藥研究手段和方法的落后局面,架起傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代生命科學(xué)之間溝通的橋梁。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林團(tuán)隊(duì)在著名植物學(xué)雜志《Molecular Plant》發(fā)表丹參全基因組[36],標(biāo)志著作為常用中藥丹參的遺傳密碼被破譯,為揭示丹參主要藥理活性成分丹參酮和丹參酚酸生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制,促進(jìn)丹參優(yōu)良品種選育提供了重要的遺傳背景基礎(chǔ)。該工作構(gòu)建了世界上首個(gè)藥用植物基因組框架圖,標(biāo)志著我國(guó)中藥研究進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代。目前已有多個(gè)中草藥如印度大麻、赤靈芝、牛耳草、鐵皮石斛等完成了基因組測(cè)序。中草藥基因組研究的飛速發(fā)展為基因編輯技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用帶來(lái)了極佳的時(shí)機(jī)和廣闊的前景。今后研究者們可以以丹參研究為模板,借鑒國(guó)外的植物基因組研究計(jì)劃的經(jīng)驗(yàn),對(duì)中草藥在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)等方向展開(kāi)研究。在此基礎(chǔ)上,利用基因編輯技術(shù)開(kāi)展中藥藥效成分、藥材的生長(zhǎng)及抗性相關(guān)基因的研究和改造工作,結(jié)合先進(jìn)的育種方法,篩選出既保持“道地血統(tǒng)”,又優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的中藥材優(yōu)良品種。該工作既有利于實(shí)現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),使中藥質(zhì)量可控,又有利于解決當(dāng)前中藥材資源面臨的“斷糧”困境。

    中藥藥材是現(xiàn)代藥物研發(fā)最大的遺傳信息資源之一。我國(guó)在該方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)?!侗静菥V目》中記載了1 892種藥用植物,1995年出版的《中華本草》收集了8 000多種藥用植物,而且其中不乏很多名貴,稀缺的藥材如人參,蟲(chóng)草等。另有統(tǒng)計(jì)表明,我國(guó)中草藥已有12 000多種?;蚓庉嫾夹g(shù)的成熟也為開(kāi)發(fā)這個(gè)藥物基因資源帶來(lái)了良機(jī)?;蚓庉嫾夹g(shù)在中藥資源的引入和應(yīng)用,將會(huì)為解決這一問(wèn)題帶來(lái)新的前景。通過(guò)基因編輯技術(shù)可以快速獲得藥材靶基因的突變或是導(dǎo)入異源基因,從而快速鑒定出該基因產(chǎn)物與藥理活性成分的相關(guān)性和重要性,發(fā)掘出新的或更高效的藥物相關(guān)基因,并可更清晰地闡明藥理活性成分生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制。

    盡管將基因編碼技術(shù)引入中藥研究能為傳統(tǒng)中草藥帶來(lái)新發(fā)展和突破,但與當(dāng)今各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用基因編碼技術(shù)相比,其在中藥研究中的應(yīng)用還處于起步階段,還有許多基礎(chǔ)工作有待完善。比如這一技術(shù)的應(yīng)用必須以完善的中藥基因資源為基礎(chǔ),如果沒(méi)有對(duì)中藥特別是具有豐富藥理藥效學(xué)和臨床應(yīng)用價(jià)值的名貴中藥的基因資源的研究與開(kāi)發(fā),基因技術(shù)體系的應(yīng)用必然大打折扣。此外,也不能盲目的為了中藥的基因而基因,浪費(fèi)大量的人力物力資源,應(yīng)有的放矢的將目標(biāo)集中在既具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的名貴或?yàn)l臨滅絕的中藥基因資源的研究與應(yīng)用上,為中藥現(xiàn)代化搭建良好的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái),讓現(xiàn)代基因技術(shù)更好的為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展服務(wù)。

    [致謝]李連達(dá)院士對(duì)本文的選題、框架設(shè)計(jì)等給予了諸多寶貴意見(jiàn)。

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