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    芪參益氣滴丸對肺心病大鼠心肌腺苷酸含量的影響

    2017-03-06 21:42耿詩涵單秋月許夢習張譯丹宋麗麗
    中國中藥雜志 2017年1期
    關(guān)鍵詞:含量測定肺心病

    耿詩涵+單秋月+許夢習+張譯丹++宋麗麗++侯寧+張聞+張密霞+莊朋偉+張艷軍

    [摘要]采用單次腹腔注射野百合堿(MCT)的方法復制大鼠肺心病模型,芪參益氣滴丸浸膏灌胃給藥6周后,通過HPLC檢測大鼠右心肌組織中的腺苷酸(ATP,ADP,AMP)的含量,進而考察芪參益氣滴丸對肺心病大鼠心肌能量代謝的影響。結(jié)果顯示ATP,ADP,AMP達到良好分離;ATP,ADP,AMP在考察的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;加樣回收率均在90%~108%;與模型組相比,高劑量給藥組大鼠心肌中ATP的含量顯著性升高,ADP的含量有升高趨勢,AMP含量有下降趨勢。提示芪參益氣滴丸能夠改善心肌組織能量代謝系統(tǒng)。通過HPLC,為測定心肌組織中ATP,ADP,AMP含量提供了一種快速、高效的定性定量分析方法,為生物樣品中能量代謝相關(guān)含量的測定研究提供了參考。

    [關(guān)鍵詞]芪參益氣滴丸; 肺心??; 能量代謝; HPLC; 含量測定

    慢性肺源性心臟病(簡稱肺心病,PHD),屬于中醫(yī)學 “肺脹”、“喘病”、“水腫”等范疇,病機多為肺、脾、心、腎虧虛,進而引起痰、瘀、水潴留。益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)是其基本治法[12]。芪參益氣滴丸(QS)具有益氣通脈、活血止痛的作用,在臨床上主要用于冠心病和心力衰竭,且對肺心病也有一定的療效,但對肺心病的治療機制尚不明確[3]。肺心病后期可出現(xiàn)全心衰,心肌能量代謝底物利用變化,能量消耗增加,游離脂肪酸堆積,抑制糖酵解,使心肌能量代謝進一步惡化[45]。有研究表明,QS能通過增加心肌組織中ATP的含量來改善心肌能量代謝[6]。作者推測QS可能通過改善心肌能量代謝的途徑從而對肺心病起到治療作用,本實驗對此進行了研究。

    1材料

    島津高效液相色譜儀(日本島津公司);電子分析天平(BT125D,賽多利斯科學儀器有限公司);超聲破碎儀[Biosafer250up,賽飛(中國)有限公司];超速離心機(sigma3k15,北京五洲東方科技發(fā)展有限公司);超聲清洗儀(KQ500E,昆山市超聲儀器有限公司)。

    QS浸膏(黃芪、丹參、三七、降香,天士力制藥集團股份有限公司);野百合堿(MCT,GR132140225,南京廣潤生物制品有限公司);色譜純乙腈(500 mL,天津市康科德科技有限公司);三磷酸腺苷二鈉,二磷酸腺苷二鈉,5′腺嘌呤核苷酸二鈉鹽(批號20151104,北京索萊寶科技有限公司);氫氧化鈉,磷酸二氫鉀,氫氧化鉀(500 g,分析純,天津市化學試劑供銷公司);高氯酸(天津市化學試劑供銷公司)。

    40只雄性Wistar大鼠,180~200 g,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)20120001。

    2方法

    21實驗動物飼養(yǎng)

    飼養(yǎng)于天津市放射醫(yī)學研究所,溫度(22±2) ℃,濕度(60±5)%。飼料為標準鼠糧,自由攝食飲水。

    22實驗動物分組

    將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為4組:對照組(C,n=10),模型組(M,n=10),QS低劑量組(L,n=10),QS高劑量組(H,n=10)。

    23肺心病模型的復制

    無水乙醇和生理鹽水(2∶8)混合液將MCT配成1%的溶液備用。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,M,L,H組單次腹腔注射MCT(60 mg·kg-1),C組腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水。

    24給藥方法

    造模次日起,L組灌服2倍臨床等效劑量的QS浸膏(945 mg·kg-1),H組灌服4倍臨床等效劑量的QS浸膏(189 mg·kg-1),C和M組灌服相應(yīng)體積生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥6周后進行藥效學研究。

    25大鼠心肌組織中ATP,ADP,AMP的測定

    251對照品的制備

    稱取ATP對照品111 mg,ADP對照品096 mg,AMP對照品119 mg,分別加蒸餾水定容至1 mL,各取3種儲備液一定量混合后得混標溶液,4 ℃避光保存,備用。

    252樣品的制備

    取大鼠右心肌組織約200 mg,按心肌組織質(zhì)量高氯酸溶液(042 mol·L-1)體積 1∶5加高氯酸溶液,在溶液中剪碎心肌組織,于4 ℃,3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,加入KOH溶液(05 mol·L-1)調(diào)節(jié)pH在60左右,靜置5 min,同條件下離心10 min,取上清液,過022 μm微孔濾膜,得到樣品溶液[78]。

    253色譜條件

    Venusil MP C18色譜柱(46 mm×150 mm,5 μm);流動相乙腈(A)磷酸鹽緩沖液(B,pH 61),梯度洗脫,0~20 min,0% A,20~30 min,0%~60%A,30~45 min,60%~0%A;柱溫為室溫;流速1 mL·min-1;檢測波長254 nm;進樣量20 μL。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。

    26統(tǒng)計分析

    實驗數(shù)據(jù)均以±s表示,應(yīng)用SPSS 170統(tǒng)計軟件進行分析,ANOVA做不同組之間差異比較,P<005時為顯著差異。

    3結(jié)果

    31高效液相色譜法方法學考察[9]

    311專屬性

    ATP,ADP,AMP對照品進樣后保留時間分別為74,92,178 min。

    312線性關(guān)系考察

    分別將儲備液稀釋2,4,8,16,32,76,900倍,制成系列對照品溶液。測定峰面積,以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸,結(jié)果見表1。

    313檢測限與定量限

    將對照品儲備液用蒸餾水逐級稀釋,進樣測定,4討論

    本實驗通過改變不同的色譜條件,以及樣品處理過程中的變量因素,篩選并建立了一種快速測定大鼠心肌組織中ATP,ADP,AMP含量的高效液相色譜方法,并且在此色譜條件下對ATP,ADP,AMP的檢測進行了全面的方法學考察。

    參照文獻[1012],采用磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀,氫氧化鈉,蒸餾水)為水相,比較有機相甲醇和乙腈,使用乙腈時柱壓相對平穩(wěn),減少磷酸鹽緩沖液對高效液相色譜儀的損傷;通過改變兩相的比例,找出樣品出峰的最佳條件??瞻讟悠分械姆鍨榱鲃酉嗵荻雀淖兂潭却笏拢珹TP,ADP,AMP在這個峰之前出峰,對樣品分析沒有干擾。比較水相pH為56,61,66時樣品的色譜圖,發(fā)現(xiàn)pH為61時,ATP,ADP,AMP出峰時間合理且分離度較好,故調(diào)整水相的pH為61。最佳色譜條件為有機相采用乙腈;流動相梯度0~20 min,0%乙腈;20~30 min,0~60%乙腈;30~45 min,0%乙腈;調(diào)節(jié)水相pH為61。

    樣品處理過程中,比較剪心肌組織次數(shù)的不同(200,300,400,500,600次)對3種成分含量多少的影響,發(fā)現(xiàn)隨著剪切次數(shù)的增加,3種成分的含量逐漸增加,剪心肌500與600次3種成分的含量接近,故處理樣品時剪切次數(shù)為500;使用超聲勻漿破碎儀將剪碎的心肌組織制成勻漿液,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與不使用勻漿破碎儀的相同樣品比較,ATP含量減少,AMP含量增加,提示ATP發(fā)生分解,故不使用超聲破碎勻漿的方法;用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)樣品的pH,比較不同的pH(40,60,83)對樣品出峰的影響,結(jié)果表明:3種不同pH樣品的出峰時間與峰面積相似,pH越小,分離度越好,但溶液pH過低會對色譜柱造成一定的損害。故最后選用與流動相接近的pH 60。

    肺心病是由支氣管肺組織或肺動脈血管病變,肺血管阻力增加,血管內(nèi)皮細胞增殖,肺動脈高壓,使右心室負荷增加,長期慢性缺氧,呼吸系統(tǒng)反復感染,細菌毒素的作用,逐漸導致右心功能不全,繼而發(fā)展成全心功能衰竭[1314]。心肌能量代謝障礙是肺心病的主要癥狀之一,目前主要通過西藥的支氣管擴張劑、抗生素、呼吸興奮劑和抗心力衰竭的藥物聯(lián)合應(yīng)用為主要的緩解辦法,但不能從根本上治療該疾病且具有一定的副作用[15]。芪參益氣滴丸主要由黃芪、丹參、三七、降香4味中藥組成[3]。臨床上主要用于冠心病、心力衰竭、肺心病[16]、擴張性心臟病、慢性乙型肝炎、特發(fā)性肺纖維化、化療引起心臟病并發(fā)癥和糖尿病微血管病發(fā)癥等[4]。本研究結(jié)果顯示,通過野百合堿復制的大鼠肺心病模型,其心肌組織中ATP含量和EC下降,AMP含量升高,提示肺心病大鼠心肌能量代謝障礙;給予芪參益氣滴丸治療可以顯著增加心肌組織ATP含量和EC,降低AMP含量,提示QS可能改變腺苷酸含量,通過改善心肌能量代謝的途徑來治療肺心病。

    肺心病是一種常見的的呼吸系統(tǒng)疾病,嚴重者病情發(fā)展至右心衰甚至全心衰,且目前的西醫(yī)臨床治療方法較難治愈。本研究表明心肌能量代謝的改善可能是QS治療肺心病的關(guān)鍵途徑之一,拓寬了QS的治療與臨床應(yīng)用范圍[1718]。同時本研究建立了一種高效液相色譜方法,可以快速、準確測定大鼠心肌組織中ATP,ADP,AMP的含量,為生物樣品中能量代謝相關(guān)含量的測定研究提供了參考。

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    [18]Lin S Q,Wei X H,Huang P,et al.QiShenYiQi Pills prevents cardiac ischemiareperfusion injury via energy modulation[J]Int J Cardiol,2013,168(2):967[責任編輯曹陽陽]2017年1月 第42卷第1期Vol42, No 1January, 2017

    [收稿日期]20160815

    [基金項目]國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2015ZX09501004001002);國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201507003);北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展專項(JJ201453)

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