青蒿素生物合成分子機制及調(diào)控研究進展

譚何新+肖玲+周正張磊+陳萬生

[摘要]以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥是瘧疾特別是惡性瘧現(xiàn)有的首選、最佳療法，青蒿素類藥物需求巨大。青蒿素原料藥依舊主要依賴于從藥用植物黃花蒿（中藥青蒿）提取、分離、純化，但其在黃花蒿中的含量較低，且含量變異大。黃花蒿分泌型腺毛是合成、分泌、積累及儲存青蒿素的場所，腺毛的正常發(fā)育直接關(guān)系到青蒿素的產(chǎn)量。提高青蒿素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本有重大意義，也是當前國際研究熱點。該文介紹了青蒿素體內(nèi)生物合成的分子機制和代謝調(diào)控，以及青蒿素合成器腺毛的研究進展，這些將為開拓新的方法來提高植物來源青蒿素的產(chǎn)量提供幫助。

[關(guān)鍵詞]青蒿素； 黃花蒿； 腺毛； 分子機制； 遺傳調(diào)控

瘧疾流行于97個國家和地區(qū)，威脅著32億人口的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，2015年約有214億人感染瘧疾，并有約438萬人死于瘧疾[1]。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥（artemisininbased combination therapies，ACTs）是治療瘧疾特別是惡性瘧現(xiàn)有的首選、最佳方法[12]。屠呦呦先生也因其在青蒿素的發(fā)現(xiàn)及青蒿素在瘧疾治療方面的巨大貢獻獲得了2015年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。青蒿素是一種含過氧橋基團結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，其每年需求量巨大，但是供應量卻相對緊缺[3]，這直接導致了ACTs制劑成本的增加。此外，青蒿素及其衍生物的藥理作用還表現(xiàn)在抗腫瘤、抗寄生蟲、抗纖維化、抗心律失常、免疫等多方面[45]，隨著青蒿素及其衍生物應用的開發(fā)，其需求將進一步增大。

青蒿素來源于菊科蒿屬藥用植物黃花蒿Artemisia annua L，其干燥地上部分被稱為中藥青蒿[67]。黃花蒿是青蒿素的唯一天然來源，但是其含量卻相對較低，只占干重的01%～08%[89]。如何提高青蒿素產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，是當前國內(nèi)外黃花蒿育種研究的熱點。已有許多科學家正在嘗試用不同的方法來增加青蒿素的產(chǎn)量，合成生物學及化學合成在青蒿素生物半合成上取得了較大進展[10]。由于酵母無法像黃花蒿腺毛一樣提供青蒿素合成所需的特殊油性氧化環(huán)境，所以目前還無法實現(xiàn)青蒿素的體外生物全合成，因此目前青蒿素的市場供應仍然依賴于植物提取[10]。未來青蒿素的市場可能是植物來源和生物半合成的協(xié)調(diào)平衡[11]。

為了提高青蒿素產(chǎn)量，在青蒿素生物合成途徑代謝酶的調(diào)控方面已有較多研究。在黃花蒿中過表達青蒿素生物合成的關(guān)鍵酶基因或抑制與青蒿素生物合成競爭相同底物的酶基因的表達，通過轉(zhuǎn)錄因子或植物激素來直接或間接地提高青蒿素的含量[1213]。這些方法都在一定程度上提高了黃花蒿中青蒿素的含量[12]，如果要進一步提高青蒿素的產(chǎn)量，還需開發(fā)新的方法。前期研究表明，青蒿素在黃花蒿地上部分表面的一種突起結(jié)構(gòu)——腺毛中合成、積累和分泌[1415]。作為青蒿素生物合成的“化學工廠”，調(diào)控腺毛發(fā)育有可能實現(xiàn)青蒿素含量大幅提高。

1青蒿素合成于黃花蒿腺毛

腺毛是毛狀體（trichome）的一種，毛狀體是許多植物葉片和其他器官表面的小突起結(jié)構(gòu)，它們的最大特征就是能夠合成，儲存，有時候還能分泌大量特定的代謝產(chǎn)物[16]，包含多種類型的萜烯，苯丙烷衍生物，?；?，甲基酮和類黃酮。許多毛狀體產(chǎn)生的化合物具有重要的醫(yī)藥，香料，食品添加劑，天然殺蟲劑等商業(yè)價值。近年來將腺毛開發(fā)成“化學工廠”來生產(chǎn)高價值的植物產(chǎn)物引起了植物生物技術(shù)專家的關(guān)注[17]。

腺毛通過表皮細胞分化而形成，以各種各樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在于不同植物表面[18]。腺毛形態(tài)的多樣性不僅因物種不同而異，同一物種、同一株植物中腺毛的形態(tài)也會表現(xiàn)出多樣性。通常來說，腺毛可以根據(jù)形態(tài)和功能被分為分泌型腺毛和非分泌型腺毛兩大類。分泌型腺毛具有多個細胞，能合成、分泌和貯存多種植物次生代謝產(chǎn)物，并廣泛分布在唇形科植物如薄荷[19]，茄科植物如番茄[20]，菊科植物如黃花蒿[18]和大麻科植物如大麻[21]中。非分泌型腺毛基本為單細胞，主要作為物理防御器官。有些也能合成次生代謝產(chǎn)物，如三萜類物質(zhì)[22]。非分泌型腺毛廣泛分布在錦葵科植物如棉花[23]和十字花科植物如擬南芥[24]中。

腺毛是植物對抗外界脅迫的第一道屏障，可以保護植物本身免受外界昆蟲、細菌、紫外輻射以及干旱等的影響[25]。特別是分泌型腺毛，可以通過釋放一些對昆蟲和動物有害的化學物質(zhì)（通常為一些次生代謝產(chǎn)物），從而阻擋它們對植物體的進一步侵害。此外，青蒿素和一些其他生物活性物質(zhì)對植物本身有很高的毒性[26]，所以將其扣留在或者分泌出合成部位就顯得非常重要。腺毛的表皮下空間很可能就是黃花蒿扣留青蒿素和其他植物毒性物質(zhì)的場所[14]。

與自然界中腺毛的分類相同，黃花蒿中腺毛也可以分為2類，即分泌型腺毛（AaGSTs）（圖1綠色箭頭）和非分泌型腺毛（又稱T型腺毛，AaTNGs）（圖1藍色箭頭）。它們都起源于表皮細胞[14，27]。其中AaGSTs 由2列5對、10個細胞組成，包含2個基細胞（basal cells，Ba），2個柄細胞（stalk cells，St），4個下頂細胞（subapical cells，Suc）和2個頂細胞（apical cells，Ac），以及1個皮下腔空間（subcuticular space，SS）（圖1）。2個頂細胞和4個下頂細胞又稱為分泌細胞[14]。AaTNGs 由5個纖維狀細胞組成，頭部還有1個特別細長的細胞，最終形成一個類似于英文字母大寫“T”的結(jié)構(gòu)[28]。

葉細胞分化成腺毛細胞起始于最早的葉原基時期，當10個細胞形成后，6個分泌細胞的角質(zhì)層從細胞壁分離形成1個2列的囊腔，并最終裂開釋放內(nèi)含物[14]。在整個發(fā)育時期，腺毛細胞都含有很少的液泡，分泌細胞含有較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，每一對細胞的質(zhì)體都是不一樣的[14]。在成熟期，頂細胞含有前質(zhì)體和白色體，只有少量的類囊體。而下頂細胞含有大量的葉綠體，不具有淀粉粒?；毎星百|(zhì)體或者白色體，柄細胞有葉綠體[14]。

Duke等通過5 s的氯仿浸泡，可以提取黃花蒿葉片中97%的青蒿素和全部的青蒿烯，同時發(fā)現(xiàn)除了分泌型腺毛的皮下腔空間（SS）塌陷了，葉片表面并沒有其他破壞，因此認為青蒿素和青蒿烯全部儲存在分泌型腺毛的皮下腔空間[15]。而且青蒿素只存在于含有腺毛的種中[15]，因此腺毛也被認為是青蒿素體內(nèi)合成、分泌、積累及儲存的場所，但是青蒿素如何在腺毛內(nèi)合成不清楚。由于下頂細胞與頂細胞的結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物不同，關(guān)于青蒿素是只在頂細胞中合成，還是在6個分泌細胞中都合成一直存在較大爭議。Olsson等[17]因在4個下頂細胞中沒有檢測到青蒿素生物合成關(guān)鍵基因ADS，CYP71AV1和DBR2的表達，認為下頂細胞不能合成青蒿素，可能具有與頂細胞不同的功能，比如合成單萜類化合物。2012年Olofsson等[29]通過激光顯微切割和qRTPCR提出頂細胞和下頂細胞都能合成青蒿素。腺毛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示下頂細胞中存在所有青蒿素生物合成途徑基因的表達[22]。因此，青蒿素是否由分泌型腺毛的下頂細胞和頂細胞共同產(chǎn)生，還需要細胞化學的研究證據(jù)來進一步確證。此外，黃花蒿腺毛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)非分泌型腺毛中也存在倍半萜和三萜類生物合成特異性基因的表達，這暗示非分泌型腺毛——T型腺毛，也可能具有與分泌型腺毛相似的功能。

2青蒿素生物合成途徑

青蒿素的生物合成途徑屬于類異戊二烯代謝合成途徑，起源于異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。

高等植物中，這種5C骨架的化合物有2條獨立的生物合成途徑，分別為位于胞質(zhì)的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和位于質(zhì)體的甲基赤蘚醇4磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑（圖2）。文獻報道已經(jīng)確定MVA途徑和MEP途徑對最后生成青蒿素的貢獻度是不同的[30]。法呢基焦磷酸（famesyi diphosphate，F(xiàn)PP）的形成是青蒿素生物合成的第一個特異性步驟，2010年Schramek等[30]通過13CO2 同位素標記證明，F(xiàn)PP由2份來源于MVA途徑的異戊二烯和1份來源于MEP途徑的異戊二烯形成（圖2 不同粗細的線條示不同貢獻），因此MVA途徑在青蒿素生物合成中起主要作用。

以FPP為分界線，F(xiàn)PP之前的步驟被認為是青蒿素生物合成的上游步驟，F(xiàn)PP之后的步驟被認為是青蒿素生物合成的下游步驟。青蒿素上游合成途徑已經(jīng)比較清楚，且有公認的酶及催化步驟[3132]，但下游步驟仍存有爭議。青蒿素生物合成的上游及下游路徑由圖2所示，黑色字體為青蒿素合成代謝路徑中的化合物，藍色字體所示為參與這一過程的

基因。青蒿素由MVA途徑和MEP途徑提供IPP，經(jīng)催化后形成FPP。FPP經(jīng)紫穗槐二烯合成酶（amorpha4，11diene synthase，ADS）催化生成紫穗槐二烯[33]。紫穗槐二烯經(jīng)過三步由細胞色素P450單氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）催化的反應，分別形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸[3436]。其中青蒿醇可以被催化形成二氫青蒿醇[37]。青蒿醛可以被青蒿醛雙鍵還原酶[artemisinic aldehyde delta11（13） reductase，DBR2]催化形成二氫青蒿醛[37]。二氫青蒿醛可以被醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）[38]催化形成青蒿酸的直接前體二氫青蒿酸，也可以被二氫青蒿醛還原酶（dihydroartemisinic aldehyde reductase，RED1）催化形成上一步的產(chǎn)物二氫青蒿醇[39]。二氫青蒿醇可以被CYP71AV1和ALDH1催化形成二氫青蒿醛，最后經(jīng)二氫青蒿酸形成青蒿素。

青蒿素合成下游途徑還存在一些爭議，AlejosGonzalez 等[40]2011年提出青蒿酸可轉(zhuǎn)化為青蒿素B和青蒿烯，進而形成青蒿素。但是通過青蒿酸和二氫青蒿酸前體飼喂實驗證明二氫青蒿酸才是青蒿素的直接前體[37]，青蒿素B和青蒿素可能是青蒿素生物合成途徑上的2個不同分支的終產(chǎn)物[34]。在釋喂實驗中沒有提及青蒿烯，可能由于青蒿素B和青蒿烯不穩(wěn)定，不易檢測到。因此青蒿酸是否能通過青蒿烯進而轉(zhuǎn)化成青蒿素還未知。此外，二氫青蒿酸與青蒿素之間是否真的僅需要腺毛提供的特殊油性環(huán)境加上光照條件就能順利轉(zhuǎn)化，是否存在未知的氧化步驟和酶也是未知的。青蒿素下游合成途徑在青蒿素生物合成中具有十分重要的作用，正確解析青蒿素生物合成下游途徑對于有效開展代謝工程，進而提高青蒿素含量意義重大。腺毛包含了青蒿素生物合成所需要的全部因素，對腺毛進行調(diào)控可以避開青蒿素生物合成途徑上存在的暗箱，從宏觀上調(diào)控青蒿素的生物合成。

3青蒿素含量的代謝調(diào)控

目前針對于青蒿素的代謝調(diào)控研究策略主要分為3大類。一是過表達青蒿素合成路徑中的關(guān)鍵酶基因或阻斷青蒿素合成競爭性支路上的關(guān)鍵酶基因；二是通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控青蒿素生物合成途徑；三是通過植物激素等間接調(diào)控青蒿素的合成。

31生物合成途徑關(guān)鍵酶基因調(diào)控

311通過單基因的過表達已經(jīng)進行單基因過表達的青蒿素生物合成途經(jīng)基因有HMGR，F(xiàn)PS，DXR，DBR2，ALDH1，ADS，這些基因在青蒿素的生物合成途徑上的位置顯示（圖2）。HMGR是3羥基3甲基戊二酰輔酶A合成酶，能夠?qū)MGCoA分流到IPP途徑來，從而促進青蒿素的合成。Aquil等[4142]在2009年將長春花中的HMGR基因過表達在青蒿中后，能將青蒿素的產(chǎn)量提高225%～389%。此外，HMGR也能促進青蒿酸的合成，酵母表達體系中，3個拷貝的HMGR基因比單拷貝的更能提高青蒿酸的產(chǎn)量[10，43]。FPS是法呢基焦磷酸合成酶，能夠?qū)脚夯姿幔℅PP）轉(zhuǎn)化成法呢基焦磷酸（FPP）。FPP是一個重要的分支點，也被認為是青蒿素合成下游途徑的起點。過表達木本棉FPS 基因可以提高青蒿素產(chǎn)量到2～3倍[44]。過表達黃花蒿內(nèi)源FPS 基因也能將青蒿素含量提高到2～25倍。但是轉(zhuǎn)入2個拷貝的FPS 基因反而會降低轉(zhuǎn)基因材料中青蒿素的產(chǎn)量[4546]。DXR基因是1脫氧D木酮糖5磷酸還原異構(gòu)酶[47]，是質(zhì)體中合成IPP的MEP途徑第二步（圖2），DXR基因過表達能將青蒿素的產(chǎn)量提高到121～235倍[48]。此外，膦胺霉素能夠阻斷DXR催化的這一步反應，即阻斷DXP轉(zhuǎn)化成MEP[49]，100 μmol·L-1的膦胺霉素處理14 d，能將青蒿素的產(chǎn)量降低25%[50]。ADS是紫穗槐4，11二烯合成酶，能夠催化青蒿素合成下游途徑的起始步驟（圖2），將FPP轉(zhuǎn)化成紫穗槐4，11二烯[5152]。而且通過對啟動子的研究發(fā)現(xiàn)ADS基因特異地表達在腺毛中[5354]，而腺毛是青蒿素產(chǎn)生和儲存的地方，因此ADS基因是調(diào)控青蒿素合成的重要靶標。將青蒿酸噴涂到黃花蒿上可使ADS基因的表達降低10倍，說明在青蒿素的合成、積累中存在負反饋抑制[55]。ADS基因的過表達，可將青蒿素、青蒿酸、二氫青蒿酸的含量分別提高82%，65%和59%[56]，但是ADS的直接產(chǎn)物紫穗槐4，11二烯并沒有明顯增多，應該是快速被下游反應消耗了[51]。DBR2是青蒿醛Δ11（13）還原酶，能夠?qū)⑶噍锶┻€原成二氫青蒿醛，在DBR2過表達的轉(zhuǎn)基因植株中，青蒿素的含量顯著提高，最高達到非轉(zhuǎn)化對照植株的283倍[57]。ALDH1是乙醛脫氫酶，能夠催化青蒿醛轉(zhuǎn)化成青蒿酸。黃花蒿內(nèi)源的ALDH1基因過表達可將青蒿素含量最高提高到干重的256 mg·g-1，是非轉(zhuǎn)化對照（8 mg·g-1干重）的32倍[58]。

312通過多基因的過表達將代謝途徑中多基因過表達可以同時打破多個瓶頸步驟，往往比單個基因的過表達更能提高青蒿素含量。已經(jīng)進行組合的青蒿素生物合成途徑基因為CYP71AV1/CPR，HMGR/ADS，HMGR/FPS，ADS/CYP71AV1/CPR和FPS/CYP71AV1/CPR。CYP71AV1是細胞色素P450單加氧酶，是一種多功能的倍半萜氧化酶在青蒿素的合成中起關(guān)鍵作用，它能通過3步將紫穗槐4，11二烯轉(zhuǎn)化成青蒿醇、青蒿醛并最終生成青蒿酸[36]。CPR是細胞色素P450氧化還原酶，它可以和CYP71AV1一起作用，幫助CYP71AV1將紫穗槐4，11二烯轉(zhuǎn)化成更氧化的產(chǎn)物[43]。CYP71AV1也特異地表達在分泌型腺毛中[35]，并且涂抹青蒿素或青蒿酸時會大大降低CYP71AV1的表達[55]。內(nèi)源CYP71AV1和CPR基因在黃花蒿中共同過表達時可以提高青蒿素產(chǎn)量38%[48，59]。FPS，CYP71AV1和CPR 3個基因分別通過CaMV35啟動子驅(qū)動，同時過表達能將青蒿素的產(chǎn)量提高到36倍[60]。ADS，CYP71AV1和CPR 3個基因同時過表達可提高青蒿素量到151 mg·g-1干重，是對照的24倍[61]。將長春花來源的HMGR基因和黃花蒿來源ADS同時過表達可大大提高青蒿素的產(chǎn)量，最高的轉(zhuǎn)基因植株可達到173 mg·g-1干重，比對照提高765倍[62]。將HMGR基因和FPS基因同時過表達后，同樣可以將青蒿素的量提高到9 mg·g-1干重，是對照的18倍[63]，但是HMGR和FPS同時過表達并沒有比HMGR或FPS單基因過表達更明顯地提高青蒿素含量[63]。

313通過阻斷青蒿素合成競爭性支路上的關(guān)鍵酶基因來提高青蒿素的含量法尼基焦磷酸（FPP）是青蒿素合成下游路徑的起始步驟，同時FPP也能被其它倍半萜合成酶催化生成不同的倍半萜，從而和青蒿素合成途徑競爭FPP底物。甾醇合酶SQS催化甾醇生物合成途徑的第一步，是青蒿素合成的競爭性支路[64]。當SQS基因的表達通過RNAi抑制時，青蒿素的量可大大提高到314 mg·g-1干重，是非轉(zhuǎn)基因植株的314倍[65]，但是4種主要甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇和麥角甾醇的含量都降低了，雖然甾醇的降低并沒有明顯影響青蒿的生長及植株的總生物量[65]。β石竹烯合成酶（CPS）能夠?qū)PP轉(zhuǎn)化成β石竹烯，也是青蒿素合成的競爭性支路[66]。CPS基因的表達被抑制后，β石竹烯的含量降低了40%～60%，而青蒿素的含量提高了549%[67]。因此抑制競爭性支路來提高青蒿素含量也是一種可行的提高青蒿素含量的辦法。

32轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子是通過轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控目的基因的表達來調(diào)控植物生長發(fā)育及生理代謝的。轉(zhuǎn)錄因子通過與被調(diào)控基因啟動子上順式作用元件結(jié)合，激活一個級聯(lián)或整個網(wǎng)絡(luò)的基因，這種特征使其成為代謝工程的強大工具，對藥用植物的育種改良有重要價值。利用不同家族的轉(zhuǎn)錄因子，可以實現(xiàn)對多個化合物合成途徑的調(diào)控，這在植物和動物的研究中已經(jīng)得到了充分的證實。目前已經(jīng)報道的能調(diào)控青蒿素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要集中在WRKY，AP2/ERF，bZIP，bHLH 4大家族。AaWRKY1特異地表達在腺毛中，并能被茉莉酸甲酯誘導，是第一個報道的能調(diào)控青蒿素合成的轉(zhuǎn)錄因子。AaWRKY1通過結(jié)合青蒿素合成途徑上ADS和CYP71AV1基因啟動子上的Wbox來激活ADS和CYP71AV1基因的表達。AaWRKY1的過表達可將青蒿素的量提高到19 mg·g-1干重，是對照的19倍[6869]。

AP2/ERF是一類在初生、次生代謝，植物的生長發(fā)育，應對環(huán)境刺激方面都有重要作用的家族[71]。目前已經(jīng)報道的能調(diào)控青蒿素合成的該家族成員有AaORA[7273]，AaERF1，AaERF2[74]和AaTAR1[75]4個。AaORA是青蒿素合成的正向調(diào)控子，GUS染色證實AaORA特異地表達在分泌型和非分泌型腺毛中，AaORA的過表達可將青蒿素和二氫青蒿酸的含量分別提高40%～53%和22%～35%[7273]。AaERF1，AaERF2來源于分泌型腺毛的cDNA文庫，屬于ERF亞家族成員的B3組（能響應茉莉酸和植物保護的正向調(diào)控因子）[70，74]。通過酵母單雜和EMSA實驗證實AaERF1，AaERF2可以和青蒿素合成路徑上的關(guān)鍵酶基因ADS，CYP71AV1啟動子上的CBF2，RAA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而來調(diào)控青蒿素的合成。AaERF1或者AaERF2的過表達都可顯著提高青蒿素和青蒿酸的含量[70，74]。AaTAR1是另外一個非常重要的調(diào)控青蒿素合成的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子[75]。TAR1在幼嫩葉片分生組織、幼嫩花苞及分泌型和非分泌型腺毛中表達，在TAR1GFP的轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株中，TAR1蛋白特異地定位在幼嫩葉片的細胞核。當TAR1基因通過RNAi抑制后，青蒿素、青蒿酸、二氫青蒿酸的含量大大降低，同時分泌型及非分泌型腺毛的形態(tài)出現(xiàn)異常，葉片表面角質(zhì)和蠟質(zhì)成分也發(fā)生改變，導致葉片的滲透性增強。當TAR1過表達時青蒿素、青蒿酸、二氫青蒿酸的含量升高，并且ADS，CYP71AV1基因的表達上調(diào)上千倍。并進一步通過EMSA、酵母單雜和體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C實TAR1也能夠與ADS，CYP71AV1基因啟動子上的CBF2，RAA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活這2個基因的表達，來促進青蒿素的合成[75]。此外AaTAR1除了可以直接調(diào)控青蒿素合成路徑基因ADS和CYP71AV1外，還可以控制蠟質(zhì)合成從而影響黃花蒿腺毛的發(fā)育[75]。

bZIP家族也是一類非常大且功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子家族，但是其調(diào)控植物次生代謝的報道卻很少。AabZIP1是從100多個黃花蒿bZIP家族成員中通過基因表達、系統(tǒng)進化分析和雙熒光素酶實驗篩選出的與ADS和 CYP71AV1有相似表達特征的bZIP家族基因，并進一步證明AabZIP1通過結(jié)合ADS和CYP71AV1基因啟動子上的ABRE結(jié)構(gòu)域來激活基因的表達，促進青蒿素的合成。AabZIP1基因過表達的植株對脫落酸（ABA）敏感，外源施加ABA能進一步促進青蒿素的積累[76]。

bHLH是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與許多重要的發(fā)育和生理過程。近年來越來越多bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員被報道能參與植物次生代謝的調(diào)控，例如擬南芥中花青素[71]和倍半萜[77]的合成，長春花中生物堿的合成[7879]。AabHLH1是從黃花蒿分泌型腺毛cDNA文庫中獲得的1個bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，AabHLH1能夠和ADS，CYP71AV1啟動子上的Ebox順式作用元件相結(jié)合，激活基因的表達，從而正向調(diào)控青蒿素的合成[80]。AaMYC2是黃花蒿中能夠響應茉莉酸誘導的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，它可以結(jié)合到CYP71AV1，DBR2啟動子上的Gbox順式作用元件，從而激活這2個基因的表達。在AaMYC2過表達的轉(zhuǎn)基因植株中，不僅青蒿素的含量增加了，黃花蒿對灰霉菌的抗性也有顯著的增強[81]。

33植物激素調(diào)控

植物激素茉莉酸及其衍生物是一類重要的信號分子，調(diào)控植物的次生代謝來增強植物對抗生物及非生物脅迫[8283]。外源施加茉莉酸甲酯不僅可以提高黃花蒿的次生代謝，提高青蒿素的產(chǎn)量49%[84]，而且可以增加分泌型腺毛的密度[8586]。茉莉酸產(chǎn)生于脂氧化物合成途徑上的一個特異分枝，其中丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC）催化其中的一個重要步驟[84]。AaAOC基因是從黃花蒿中克隆到的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因，在AaAOC基因過表達的植株中，茉莉酸的含量可以達到對照的2～47倍，青蒿素合成代謝途徑中多個基因的表達上調(diào)，同時分泌型腺毛的密度也增加了，在一些轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素的含量也提高了879%[12，87]。植物激素ABA在植物的生長及對抗環(huán)境脅迫，包括干旱、鹽、冷及滲透性等逆境中起到重要的作用[88]。外源ABA噴灑開花前的黃花蒿葉子可提高青蒿素含量[89]。AaPYL9是黃花蒿中的ABA受體，AaPYL9過表達的轉(zhuǎn)基因植株，相對于野生植株對ABA的敏感性顯著增加。在沒有ABA誘導時，其青蒿素含量和對照沒有差異，但是ABA的誘導可使其青蒿素含量增加74%～95%，明顯高于野生型的33%，并且蒸騰作用降低，對干旱的耐受性增強[90]。CRY1是擬南芥光信號通路中的重要受體，其過表達能促進許多物種中次生代謝物的積累[91]。在黃花蒿中過表達擬南芥CRY1基因不僅能提高青蒿素的含量30%～40%，同時也能提高花青素的積累[92]。

目前所做的青蒿素合成調(diào)控多是針對青蒿素合成代謝路徑的，而已經(jīng)報道的青蒿素合成相關(guān)的基因都在腺毛中高表達或特異性表達。分泌型腺毛是青蒿素的“生物合成器”。因此通過調(diào)控腺毛來提高青蒿素的含量有可能也是一種比較有前景的代謝工程手段。

4腺毛的生長發(fā)育及調(diào)控研究

腺毛的生理和代謝產(chǎn)物的特殊性以及相關(guān)生物合成酶基因在其中的高表達使其成為天然產(chǎn)物生物合成基因組研究的重要對象。例如由腺毛特異表達基因cDNA組成的EST數(shù)據(jù)庫已被用來確定薄荷Menthax piperita中負責萜類化合物的合成酶[19]；九層塔Ocimum basilicum中苯丙烯類的合成酶[94]；番茄Solanum lycopersicum中甲基酮的合成酶[95]；黃花蒿中倍半萜類的合成酶[9698]；啤酒花Humulus lupulus中烯類[99]和萜類的合成酶[100]。

作為青蒿素合成、分泌和貯存的器官，黃花蒿分泌型腺毛的研究還非常少，而非分泌型腺毛研究更少。盡管在模式植物擬南芥中報道了相對較多關(guān)于腺毛形態(tài)、密度和發(fā)育的信息，但是在擬南芥中只存在非分泌型腺毛。黃花蒿中存在非分泌型和分泌型腺毛，兩者的形態(tài)和功能完全不同，影響二者的因素也不完全相同，有研究指出二者由不同網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[16]。因此，擬南芥腺毛的研究成果只有部分的借鑒意義，黃花蒿腺毛的研究還需進一步深入地開展。通過總結(jié)腺毛研究較多的擬南芥、番茄、煙草、棉花等物種，可發(fā)現(xiàn)影響腺毛的因素歸結(jié)為3類，即基因，microRNA和植物激素。其中基因起主導作用，microRNA和植物激素都是通過調(diào)控腺毛有關(guān)基因來影響腺毛的形成和發(fā)育。

41基因?qū)ο倜挠绊?/p>

目前關(guān)于黃花蒿腺毛的研究還非常少，已經(jīng)報道的與黃花蒿腺毛相關(guān)的基因只有TAR1（trichome and artemisinin regulator 1）[75]，TTG1（transparenta testa Glabra 1）[101]，GL3（enhancer of Glabra3）[101]和TFAR1（trichomespecific fatty acylCoa reductase 1）[86]。其中TTG1，GL3只報道能參與黃花蒿腺毛產(chǎn)生[101]，TFAR1的研究相對完整，但主要是蠟質(zhì)方面，被證明與腺毛發(fā)育及倍半萜的生物合成相關(guān) [86]。TAR1是目前研究最為詳細的黃花蒿腺毛發(fā)育相關(guān)基因[75]。TAR1為AP2/ERF類的轉(zhuǎn)錄因子，表達在幼嫩的葉片、花以及腺毛中，并專一地定位于細胞核。當TAR1被敲除時，分泌型及非分泌型腺毛的形態(tài)都發(fā)生改變，青蒿素的含量大大降低，而過表達TAR1則會增加青蒿素的產(chǎn)量[75]。并進一步通過凝膠阻滯、酵母單雜交、瞬間轉(zhuǎn)化GUS等實驗證實TAR1可以直接調(diào)控青蒿素合成路徑上的關(guān)鍵酶基因ADS 和CYP71AV1來控制青蒿素的合成。因此TAR1是腺毛發(fā)育和青蒿素合成分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控者[75]。

Graham等[102]在2010年對黃花蒿進行了深度轉(zhuǎn)錄組測序，試圖尋找和青蒿素產(chǎn)量相關(guān)的基因和分子標記。希望通過分子生物學手段對黃花蒿進行改良，以期提高青蒿素產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。并希望可以將這種在中國已經(jīng)栽種了1 000多年的藥用植物改良成為一種種植范圍更廣的“全球性植物”。同時Graham也預測了7個可能與腺毛發(fā)育相關(guān)的基因[102]。此外，黃花蒿的全基因組測序?qū)榉肿铀降难芯刻峁椭捅憷?，也預示著黃花蒿功能基因組研究時代的來臨。目前，擬南芥、番茄和煙草中腺毛相關(guān)基因的研究比較詳細且完整，可作為研究黃花蒿腺毛的參考，特別是番茄和煙草中分泌型腺毛的研究。網(wǎng)站http：//www.planttrichome.org/包含了所有腺毛的ESTs（expressed sequence tags），也可以作為研究黃花蒿腺毛的參考工具[103]。

42microRNAs對腺毛的影響

microRNAs 是一種存在于動、植物和病毒中的只有22個堿基的小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。植物miRNAs通常能與它們所對應的信使RNA完全匹配或幾近完全匹配，最終導致基因抑制[104]。

目前在黃花蒿中通過計算機預測了幾個miRNA和它們的靶標，但沒有任何實驗證明。共預測了6個miRNA，屬于miR414 和miR1310家族，共有8個靶標基因，包括HMGR， ADS，F(xiàn)PS和細胞色素P450[105]。在擬南芥中報道的miRNA156可以靶向調(diào)控SPL（squamosa promoter ninding protein like）基因的表達，而SPL基因可以調(diào)控腺毛發(fā)育的負調(diào)控因子TCL1（trichomeless 1）和TRY（triptychon）[106]。miRNA390則被報道可以直接靶向調(diào)控腺毛的發(fā)育[107]。另外有報道稱卷心菜的miRNA172可以調(diào)控AP2 家族的基因[108]。這些研究說明植物體內(nèi)存在能夠調(diào)控腺毛發(fā)育的miRNA，這種調(diào)控尚需更多深入的研究。

43植物激素對腺毛的影響

植物激素作為一種信號分子，可以調(diào)節(jié)特定的細胞進程，對于植物生長發(fā)育和適應環(huán)境十分重要。通常來說植物激素可以分為5大類，包括脫落酸、植物生長素（auxin）、細胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）和赤霉素（GA）。除此之外，還有2類比較重要的激素，水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）。

研究表明，細胞分裂素和赤霉素可以影響黃花蒿腺毛發(fā)育，但不能促進青蒿素的生物合成。茉莉酸既能促進分泌型腺毛的發(fā)育又能提高青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達，最終導致青蒿素含量增加[86]。而其他植物激素影響黃花蒿腺毛發(fā)育的研究較少。與黃花蒿中激素作用相似，茉莉酸、細胞分裂素和赤霉素也能促進擬南芥中腺毛的形成[109]。水楊酸能負調(diào)控擬南芥腺毛發(fā)育，且減弱茉莉酸的作用[110]。

在黃花蒿中植物激素可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控WD40bHLHMYB復合物，調(diào)控腺毛形成[86]。WD40bHLHMYB復合物是由R2R3type MYB蛋白與bHLH蛋白相互結(jié)合，再與TTG1編碼的WD40蛋白結(jié)合，最終促進表皮細胞分化成腺毛。在擬南芥中細胞分裂素和赤霉素通過調(diào)控能促進GL1基因表達的C2H2轉(zhuǎn)錄因子，如GIS，GIS2和ZFP8，來調(diào)控莖和花序上腺毛發(fā)育[106]。

5結(jié)語

青蒿素的生物合成途徑屬于類異戊二烯代謝合成途徑，其上游途徑已較清楚，有公認的酶及催化步驟，但是從FPP開始的下游合成途徑仍存在爭議。主要是關(guān)于青蒿酸能否轉(zhuǎn)化成青蒿烯并進一步轉(zhuǎn)化成青蒿素，以及二氫青蒿酸如何轉(zhuǎn)化成青蒿素等，這些還有賴于青蒿素生物合成代謝途徑的進一步解析。

在青蒿素生物合成途徑代謝酶的調(diào)控方面已有較多研究，已經(jīng)進行的有將代謝路徑HMGR，F(xiàn)PS，DXR， DBR2，ALDH1，ADS等單基因過表達，或CYP71AV1/CPR，HMGR/ADS，HMGR/FPS，ADS/CYP71AV1/CPR，F(xiàn)PS/CYP71AV1/CPR等2個或3個基因的共同表達，或者阻斷競爭性支路上的SQS，CPS等基因都可不同程度地提高青蒿素含量，最高可提高到314 mg·g-1（DW）。已經(jīng)證實的能參與青蒿素代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有AaWRKY1，AaORA，AaERF1，AaERF2，AaTAR1，AabZIP1，AabHLH1，AaMYC2，它們大多通過調(diào)控青蒿素合成路徑上的關(guān)鍵酶基因來調(diào)控青蒿素的合成。此外，植物激素茉莉酸及其衍生物、脫落酸、光信號通路，以及參與到這些路徑中的基因AaAOC，AaPYL9，AaPP2C1，AtCRY1等都能影響青蒿素的合成。隨著黃花蒿功能基因組學研究的開展，將有更多的重要靶標基因被揭示出來，將對青蒿素的生物合成及調(diào)控有更深層次的理解。掌握這些基因資源，不僅有益于提高青蒿素含量，還能保護我國黃花蒿基因資源，擁有我國自主的基因知識產(chǎn)權(quán)。

化合物分析及重要基因的表達分析證明腺毛是青蒿素體內(nèi)合成、分泌、積累及儲存的場所，青蒿素由腺毛的分泌細胞合成并被存儲在皮下腔空間。但是腺毛如何合成青蒿素還不是非常清楚，2個頂細胞與4個下頂細胞是非常不同的，青蒿素是由2個頂細胞合成，還是在6個分泌細胞中都合成一直存在較大爭議。這些還有賴于細胞化學的研究證據(jù)來進一步確證。此外，非分泌型腺毛中也存在倍半萜和三萜類生物合成特異性基因的表達，因此非分泌型腺毛中是否也存在青蒿素合成，以及如何合成還需進一步研究。

對腺毛的研究或許能夠為青蒿素的體外生物合成提供環(huán)境條件，并有益于開發(fā)青蒿素的合成工廠。此外，黃花蒿腺毛是一種典型的分泌型腺毛，分泌型腺毛是許多重要次生代謝產(chǎn)物的合成場所，而模式植物擬南芥、水稻中并不具有這種特殊器官，因此黃花蒿腺毛可以作為分泌型腺毛的模式器官進行研究，并被其他物種借鑒。

[參考文獻]

[1]World Health Organization. World malaria report 2015[EB/OL].（201504） [20161027].http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/

[2]Dondorp A M， Nosten F， Yi P， et al Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum Malaria[J] N Engl J Med， 2009， 361：1807

[3]Peplow M Malaria drug made in yeast causes market ferment[J]. Nature， 2013， 494：160

[4]李斌，周紅.青蒿素及其衍生物藥理作用研究有關(guān)進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2010，15（5） ：572.

[5]楊丹，都艷玲，趙楠，等.青蒿素及其衍生物的藥理作用研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2014，35（2） ：132.

[6]中國藥典.一部[S]2015：198.

[7]張小波，趙宇平，黃曉巍，等 青蒿道地藥材研究綜述[J] 中國中藥雜志， 2016， 41（11）：2015

[8]Abdin M Z， Israr M， Rehman R U， et al Artemisinin， a novel antimalarial drug：biochemical and molecular approaches for enhanced production[J] Planta Med， 2003， 69：289

[9]Zhang X B， Guo L P， Huang L Q Climate suitable rank distribution of artemisinin content of Artemisia annua in China[J] Acta Pharm Sin， 2011， 46（4）：472

[10]Paddon C J， Westfall P J， Pitera D J， et al Highlevel semisynthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J] Nature， 2013， 496：528

[11]A2S2 Artemisinin imports into India[EB/OL] （201606） [20161027].http：//wwwa2s2org/marketdata/artemisininimportsintoindiahtml

[12]Tang K， Shen Q， Yan T， et al Transgenic approach to increase artemisinin content in Artemisia annua L[J] Plant Cell Rep， 2014， 33：605

[13]孫洪波，劉越，馮金朝 生物技術(shù)在中藥青蒿中的應用研究[J] 中國中藥雜志， 2011， 36（10）：1388

[14]Duke S O， Paul R N Development and fine structure of the glandular trichomes of Artemisia annuaL[J] Int J Plant Sci， 1993， 154：107

[15]Duke M V， Paul R N， Elsohly H N， et alLocalization of artemisinin and artemisitene in foliar tissues of glanded and glandless biotypes of Artemisia annua L[J] Int J Plant Sci， 1994， 155（3）：365

[16]Schilmiller A L， Last R L， Pichersky E Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds[J]. Plant J，2008， 54：702

[17]Olsson M E， Olofsson L M， Lindahl A L， et alLocalization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L[J] Phytochemistry， 2009， 70：1123

[18]Tissier A Glandular trichomes：what comes after expressed sequence tags？[J]Plant J， 2012， 70（1）：51

[19]Lange B M， Wildung M R， Stauber E J， et alProbing essential oil biosynthesis and secretion by functional evaluation of expressed sequence tags from mint glandular trichomes[J] Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97， 2934

[20]Kang J H， Shi F， Jones A D， et alDistortion of trichome morphology by the hairless mutation of tomato affects leaf surface chemistry[J] J Exp Bot， 2010， 61：1053

[21]Happyana N， Agnolet S， Muntendam R， et al Analysis of cannabinoids in lasermicrodissected trichomes of medicinal Cannabis sativa using LCMS and cryogenic NMR[J] Phytochemistry， 2013， 87：51

[22]Soetaert S， Neste C， Vandewoestyne M， et al Differential transcriptome analysis of glandular and filamentous trichomes in Artemisia annua[J]BMC Plant Biol，2013， 13：220

[23]Walford S A， Wu Y， Llewellyn D J， et al Epidermal cell differentiation in cotton mediated by the homeodomainleucine zipper gene， GhHD1[J] Plant J， 2012， 71：464

[24]Perazza D， Herzog M， Hülskamp M， et alTrichome cell growth in Arabidopsis thaliana can be derepressed by mutations in at least five genes[J] Genetics， 1999， 152（1）：461

[25]Glas J， Schimmel B， Alba J， et alPlant glandular trichomes as targets for breeding or engineering of resistance to herbivores[J] Int J Mol Sci， 2012， 13：17077

[26]Duke S O， Vaughn K C， Croom E M， et al Artemisinin， a constituent of annual wormwood （Artemisia annua）， is a selective phytotoxin[J] Weed Sci，1987， 35：499

[27]Kliebenstein D J Making new molecules—evolution of structures for novel metabolites in plants[J] Curr Opio Plant Biol， 2013， 16：112

[28]Ferreira J F S， Floral Janick J Morphology of Artemisia annua with special reference to trichomes[J] Int J Plant Sci， 1995， 156（6）：807

[29]Olofsson L， Lundgren A， Brodelius P E Trichome isolation with and without fixation using laser microdissection and pressure catapulting followed by RNA amplification：expression of genes of terpene metabolism in apical and subapical trichome cells of Artemisia annua L[J]. Plant Sci， 2012， 183：9

[30]Schramek N， Wang H， RmischMargl W， et alArtemisinin biosynthesis in growing plants of Artemisia annua A 13CO2 study[J]. Phytochemistry，2010， 71：179

[31]彭梅芳青蒿素代謝途徑中兩個關(guān)鍵酶基因的克隆及黃花蒿遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]重慶：西南大學，2009

[32]景福遠 利用基因工程技術(shù)提高青蒿中青蒿素含量的研究[D]上海：上海交通大學， 2008

[33]Nguyen K T， Arsenault P R， Weathers P J Trichomes+roots+ROS=artemisinin：regulating artemisinin biosynthesis in Artemisia annuaL[J] In Vitro Cell Dev Biol Plant，2011， 47（3）：329

[34]Wang H， Han J， Kanagarajan S， et al Trichomespecific expression of the amorpha4，11diene 12hydroxylase （cyp71av1） gene， encoding a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua， as reported by a promoterGUS fusion[J] Plant Mol Biol， 2013， 81（1/2）：119

[35]Wang Y， Yang K， Jing F，et alCloning and characterization of trichome specific promoter of cpr71av1 gene involved in artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L[J] Mol Biol （Mosk），2011， 45（5）：751

[36]Teoh K H， Polichuk D R， Reed D W， et al Artemisia annua L （Asteraceae） trichomespecific cDNAs reveal CYP71AV1， a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin[J] FEBS Lett， 2006， 580：1411

[37]Wu T， Wang Y， Guo D Investigation of glandular trichome proteins in Artemisia annua L using comparative proteomics[J] PLoS ONE，2012， 7（8）：e41822

[38]Teoh K H， Polichuk D R， Reed D W， et al Molecular cloning of an aldehyde dehydrogenase implicated in artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J] Botany， 2009， 87（6）：635

[39]Ryden A M， Carolien R S， Quax W， et alThe molecular cloning of dihydroartemisinic aldehyde reductase and its implication in artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J]Planta Med， 2010， 76（15）：1778

[40]AlejosGonzalez F， Qu G， Zhou L L， et al Characterization of development and artemisinin biosynthesis in selfpollinated Artemisia annua plants[J] Planta， 2011，234（4）：685

[41]Aquil S， Husaini A M， Abdin M Z， et al Overexpressionof the HMGCoA reductase gene leads to enhanced artemisininbiosynthesis in transgenic Artemisia annua plants[J] Planta Med，2009，75：1453

[42]Nafis T， Akmal M， Ram M， et alEnhancement of artemisinin content by constitutive expression of the HMGCoA reductase gene in highyielding strain of Artemisia annua L[J] Plant Biotechnol Rep，2011，5：53

[43]Ro D K， Paradise E M， Ouellet M， et al Production of theantimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J].Nature，2006， 440：940

[44]Chen D H， Ye H C， Li G F Expression of a chimeric farnesyldiphosphate synthase gene in Artemisia annua L transgenicplants via Agrobacterium tumefaciensmediated transformation[J].Plant Sci， 2000， 155：179

[45]Banyai W， Kirdmanee C， Mii M，et al Overexpression of farnesyl pyrophosphate synthase （FPS） gene affected artemisinin content and growth of Artemisia annua L[J] Plant Cell Tiss Organ Cult， 2010， 103：255

[46]Han J L， Liu B Y， Ye H C， et al Effects of overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthaseon the artemisinin content in Artemisia annua L[J] J Integr Plant Biol， 2006， 48：482

[47]CarreteroPaulet L， Ahumada I， Cunillera N， et al Expression and molecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding1deoxyDxylulose 5phosphate reductoisomerase， the first committed enzyme of the 2CmethylDerythritol 4phosphatepathway[J] Plant Physiol， 2002， 129：1581

[48]Xiang L E， Zeng L X， Yuan Y， et al Enhancement of artemisinin biosynthesis by overexpressing dxr， cyp71av1 and cpr in the plants of Artemisia annua L[J] Plant Omics J， 2012， 5：503

[49]Rodri′guezConcepcio′n M， Fore′s O， Marti′nezGarci′a J F， et al Distinct lightmediated pathways regulate the biosynthesis and exchange of isoprenoidprecursors during Arabidopsis seedling development[J] Plant Cell， 2004， 16：144

[50]Towler M J， Weathers P J Evidence of artemisinin production from IPP stemming from both the mevalonate and the nonmevalonatepathways[J] Plant Cell Rep， 2007， 26：2129

[51]Bouwmeester H J， Wallaart T E， Janssen M H， et al Amorpha4，11diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis[J] Phytochemistry，1999，52：843

[52]Mercke P， Bengtsson M， Bouwmeester H J， et al Molecular cloning， expression， and characterization of amorpha4，11diene synthase， a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L[J] Arch Biochem Biophys，2000，381：173

[53]Kim S H， Chang Y J， Kim S U Tissue specificity and developmental pattern of amorpha4，11diene synthase （ADS） proved by ADS promoterdriven GUS expression in the heterologous plant Arabidopsis thaliana[J] Planta Med， 2008， 74：188

[54]Wang H Z， Olofsson L， Lundgren A， et al Trichomespecific expression of amorpha4，11diene synthase， a keyenzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L， asreported by a promoterGUS fusion[J] Am J Plant Sci，2011， 2：619

[55]Arsenault P R， Vail D R，Wobbe K K， et al.Reproductive development modulates gene expression and metabolite levels with possible feedback inhibition of artemisininin Artemisia annua L[J] Plant Physiol， 2010，154：958

[56]Ma C， Wang H， Lu X， et alTerpenoidmetabolic profiling analysis of transgenic Artemisia annua L by comprehensive twodimensional gas chromatography timeofflight mass spectrometry[J] Metabolomics， 2009， 5：497

[57]唐克軒，沈乾，陳韻斐，等轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法：中國， CN2012100142272[P] 20120919

[58]唐克軒，陳韻斐，沈乾，等轉(zhuǎn)ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法：中國， CN2012100142427[P] 20120822

[59]Shen Q， Chen Y F， Wang T， et alOverexpression of thecytochrome P450 monooxygenase （cyp71av1） and cytochrome P450 reductase （cpr） genes increased artemisinin content in Artemisia annua（Asteraceae）[J] Genet Mol Res， 2012， 11：3298

[60]Chen Y， Shen Q， Wang Y， et al The stacked over expression of FPS， CYP71AV1 and CPR genes leads to the increase of artemisinin level in Artemisia annua L[J] Plant Biotechnol Rep， 2012，7：287

[61]Lu X， Shen Q， Zhang L， et al Promotion of artemisinin biosynthesis intransgenic Artemisia annua by overexpressing ADS， CYP71AV1 and CPR genes[J] Ind Crop Prod， 2013， 49：380

[62]Alam P， Abdin M Z Overexpression of HMGCoA reductase and amorpha4，11diene synthase genes in Artemisia annua Land its influence on artemisinin content[J] Plant Cell Rep，2011，30：1919

[63]Wang Y Y， Jing F Y， Yu S Y， et al Cooverexpression of the HMGR and FPS genes enhances artemisinin content in Artemisia annua L[J]. J Med Plants Res，2011，5：3396

[64]Liu Y， Ye H C， Wang H， et al Molecular cloning， Escherichiacoli expression and genomic organization of squalene synthasegene from Artemisia annua[J]Acta Bot Sin，2003，45：608

[65]Zhang L， Jing F Y， Li F P， et al Development of transgenic Artemisia annua （Chinese wormwood） plants with an enhanced content of artemisinin， an effective antimalarial drug， by hairpinRNAmediated genesilencing[J] Biotechnol Appl Biochem，2009，52：199

[66]Cai Y， Jia J W， Crock J， et al AcDNA clone for βcaryophyllene synthase from Artemisia annua[J] Phytochemistry， 2002，61：523

[67]Chen J L， Fang H M， Ji Y P， et alArtemisinin biosynthesisenhancement in transgenic Artemisia annua plants by downregulation of the betacaryophyllene synthase gene[J] Planta Med， 2011，77：1759

[68]Han J， Wang H， Lundgren A， et al Effects of overexpression of AaWRKY1 on artemisinin biosynthesis in transgenic Artemisia annua plants[J] Phytochemistry， 2014， 102：89

[69]Ma D， Pu G， Lei C， et alIsolation and characterization of AaWRKY1， an Artemisia annua transcription factor that regulates the amorpha4，11diene synthase gene， a key gene of artemisinin biosynthesis[J] Plant Cell Physiol， 2009，50：2146

[70]Lu X， Jiang W， Zhang L， et al AaERF1 positively regulates the resistance to Botrytis cinerea in Artemisia annua[J] PLoS ONE， 2013， 8：e57657

[71]Lorenzo O， Chico J M， SanchezSerrano J J， et al Jasmonateinsensitive1 encodes a MYC transcription factor essentialto discriminate between different jasmonateregulated defenseresponses in Arabidopsis[J] Plant Cell， 2004， 16：1938

[72]Lu X， Zhang L， Zhang F， et al AaORA， a trichomespecific AP2/ERF transcription factor of Artemisia annua， is a positive regulator in the artemisinin biosynthetic pathway and in disease resistance to Botrytis cinerea[J] New Phytol， 2013， 198（4）：1191

[73]Shen Q， Yan T， Fu X， et al Transcriptional regulation of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L[J]Sci Bull，2016， 61（1）：18

[74]Yu Z X， Li J X， Yang C Q， et al The jasmonateresponsive AP2/ERF transcription factors AaERF1 and AaERF2 positively regulate artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L[J] Mol Plant， 2012， 5：353

[75]Tan H， Xiao L， Gao S， et alTrichome and Artemisinin Regulator 1 is required for trichome development and artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J] Mol Plant，2015， 8：1396

[76]Zhang F， Fu X， Lv Z， et alA basic leucine zipper transcription factor， AabZIP1， connects abscisic acid signaling with artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L[J] Mol Plant， 2015， 8：163

[77]Hong G J， Xue X Y， Mao Y B， et al Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthasegene expression[J] Plant Cell， 2012， 24：2635

[78]Van Moerkercke A， Steensma P， Schweizer F， et al ThebHLH transcription factor BIS1 controls the iridoid branch of themonoterpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus[J]Proc Natl Acad Sci USA， 2015， 112：8130

[79]Zhang H， Hedhili S， Montiel G， et al The basic helixloophelix transcription factor CrMYC2 controls the jasmonate—responsiveexpression of the ORCA genes that regulate alkaloidbiosynthesis in Catharanthus roseus[J] Plant J， 2011， 67：61

[80]Ji Y， Xiao J， Shen Y， et al Cloning and characterization of AabHLH1， a bHLH transcription factor that positively regulates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J] Plant Cell Physiol， 2014， 55（9）：1592

[81]唐克軒，沈乾，陸續(xù)，等 一種青蒿MYC2轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列及其應用：中國， 2013104131553[P] 20130911

[82]Galis I， Gaquerel E， Pandey S P， et al Molecularmechanisms underlying plant memory in JAmediated defenceresponses[J] Plant Cell Environ， 2009， 32：617

[83]Wasternack C， Kombrink E Jasmonates：structural requirementsfor lipidderived signals active in plant stress responsesand development[J] ACS Chem Biol， 2010， 5：63

[84]Wang H H， Ma C F， Li Z Q， et al Effects of exogenous methyl jasmonate on artemisinin biosynthesis and secondary metabolites in Artemisia annua L[J]Ind Crop Prod， 2010， 31（2）：214

[85]Maes L， Goossens A Hormonemediated promotion of trichome initiation in plants is conserved but utilizes speciesand trichomespecific regulatory mechanisms[J] Plant Signal Behav，2010，5：205

[86]Maes L， Van Nieuwerburgh F C， Zhang Y， et al Dissection of the phytohormonal regulation of trichome formation and biosynthesis of the antimalarial compound artemisinin in Artemisia annuaplants[J] New Phytol， 2010， 189（1）：176

[87]Lu X， Zhang F， Shen Q， et alOverexpression of allene oxide cyclaseimproves the biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua L[J] PLoS ONE， 2014， 9（3）：e91741

[88]Zhu J K Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annu Rev Plant Biol， 2002，53：247

[89]Jing F， Zhang L， Li M， et al Abscisic acid （ABA） treatment increasesartemisinin content in Artemisia annua by enhancing theexpression of genes in artemisinin biosynthetic pathway[J] Biologia，2009， 64：319

[90]Zhang F， Lu X， Lv Z， et alOverexpression of the artemisia orthologue of ABA receptor， AaPYL9， enhances ABA sensitivity and improves artemisinin content in Artemisia annua L[J] PLoS ONE， 2012， 8（2）：e56697

[91]Chatterjee M， Sharma P， Khurana J PCryptochrome 1 from Brassica napus is upregulated by blue light and controlshypocotyl/stem growth and anthocyanin accumulation[J] Plant Physiol， 2006，141：61

[92]Hong G J， Hu W L， Li J X， et alIncreasedaccumulation of artemisinin and anthocyanins in Artemisiaannua expressing the Arabidopsis blue light receptor CRY1[J]Plant Mol Biol Rep， 2009， 27：334

[93]Zhang F， Fu X， Lv Z， et alType 2C Phosphatase 1 of Artemisia annua L is a negative regulator of ABA signaling[J] Biomed Res Int， 2014， 2014：1

[94]Gang D R， Wang J， Dudareva N， et alAn investigation of the storage and biosynthesis of phenylpropenes in sweet basil[J] Plant Physiol， 2001， 125：539

[95]Fridman E， Wang J， Iijima Y， et al Metabolic， genomic， and biochemical analyses of glandular trichomes from the wild tomato species Lycopersicon hirsutum identify a key enzyme in the biosynthesis of methylketones[J] Plant Cell， 2005， 17：1252

[96]Bertea C M， Voster A， Verstappen F W A， et al Isoprenoid biosynthesis in Artemisia annua：cloning and heterologous expression of a germacrene A synthase from aglandular trichome cDNA library[J]. Arch Biochem Biophys， 2006， 448：3

[97]Bertea C M， Freije J R， Woude H， et alIdentification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J] Planta Med， 2005，71：40

[98]Zhang Y， Teoh K H， Reed D W， et alThe molecular cloning of artemisinic aldehyde Δ11（13） reductase and its role in glandular trichomedependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua[J]. J Biol Chem， 2008， 283：21501

[99]Wang G， Tian L， Aziz N， et alTerpene biosynthesis in glandular trichomes of hop[J] Plant Physiol， 2008，148：1254

[100]Nagel J， Culley L K， Lu Y， et alEST analysis of hop glandular trichomes identifies an Omethyltransferase that catalyzes the biosynthesis of xanthohumol[J] Plant Cell， 2008，20：186

[101]Liu S， Tian N， Li J，et alIsolation and identification of novel genes involved in artemisinin production from flowers of Artemisia annuausing suppression subtractive hybridization and metabolite analysis[J]. Planta Med， 2009，75：1542

[102]Graham I A， Besser K， Blumer S， et al The genetic map of Artemisia annua L identifies loci affecting yield of the antimalarial drug artemisinin[J] Science， 2010， 327：328

[103]Dai X， Wang G， Yang D S，et al TrichOME：a comparative omics database for plant trichomes[J] Plant Physiol， 2010，152：44

[104]Wikipedia MicroRNA[EB/OL] [20161027] http：//en.wikipedia.org/wiki/MicroRNA

[105]Pani A， Mahapatra R K， Behera N， et al Computational identification of sweet wormwood （Artemisia annua） microRNA and their mRNA targets[J]Genomics Proteomics Bioinformatics， 2011， 9（6）：200

[106]Yu N， Cai W J， Wang S， et alTemporal control of trichome distribution by microRNA156targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana[J] Plant Cell， 2010， 22：2322

[107]Pe′rezQuintero A L， Sablok G， Tatiana V T， et al Mining of miRNAs and potential targets from gene oriented clusters of transcripts sequences of the antimalarial plant， Artemisia annua[J]. Biotechnol Lett， 2012， 34：737

[108]Song X， Li Y， Hou X Genomewide analysis of the AP2/ERF transcription factor superfamily in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp pekinensis）[J] BMC Genomics， 2013， 14：573

[109]Maes L， Goossens A Hormonemediated promotion of trichome initiation in plants is conserved bututilizes species and trichomespecific regulatory mechanisms[J] Plant Physiol， 2008，148：1453

[110]Traw M B， Bergelson J Interactive effects of jasmonic acid， salicylic acid， and gibberellin on induction of trichomes in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2003，133：1367

[責任編輯丁廣治]