• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    信號分子與葉銹菌誘導下小麥病程相關蛋白1基因的表達分析

    2015-10-20 21:04栗小英等
    江蘇農業(yè)科學 2015年9期
    關鍵詞:表達分析原核表達

    栗小英等

    摘要:病程相關蛋白1(pathogenesis-related proteins1,PR1)是一類以基因家族形式存在的重要病程相關蛋白,在前期研究中,在小麥抗葉銹病近等基因系材料TaLr35中成功獲得了1個小麥病程相關蛋白1基因TaLr35PR1,具有植物防御體系中的SCP保守結構域。利用生物信息學方法進一步明確,該基因含有信號肽,定位于細胞間隙,可能含有跨膜結構域,相對分子量為17.3 ku,與多個植物病程相關蛋白1序列具有較高同源性;利用半定量RT-PCR方法結合genetools、SPSS軟件分析TaLr35PR1基因表達模式,結果表明,信號分子水楊酸(salicylic acid,SA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)明顯誘導該基因表達,且用信號分子預處理后接種葉銹菌,基因表達量明顯增加;構建了TaLr35PR1基因的原核表達載體pEASY-PR1,在大腸桿菌中高效表達分子量約為17 ku的融合蛋白,明確其最佳誘導條件為在 0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

    關鍵詞:葉銹菌;信號分子;病程相關蛋白1;表達分析;原核表達

    中圖分類號: Q756文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2015)09-0028-04

    收稿日期:2014-08-27

    基金項目:國家重點基礎研究發(fā)展計劃(編號:2013CB127700);河北省自然科學基金(編號:C2012204005)。

    作者簡介:栗小英(1988—),女,河北張家口人,碩士研究生,研究方向為分子植物病理。E-mail:506112516@163.com。

    通信作者:王海燕,副教授,主要從事分子植物病理學研究。E-mail:ndwanghaiyan@163.com。植物在長期的進化過程中,為了抵抗病害對自身生長的不良影響,在一定程度上發(fā)展了感受生物脅迫信號的機制,通過體內的信號傳導途徑,激發(fā)轉錄因子與相應的順式作用元件的結合,進而啟動特定基因的轉錄和表達,最后導致植物對脅迫作出反應[1]。病程相關(pathogenesis-related,PR)蛋白質在信號傳遞與脅迫應答中起調節(jié)作用。PR 基因的最初發(fā)現主要是由于它們在植物受到病原物侵染時會大量表達。PR蛋白質除了在抗病反應中發(fā)揮重要作用外,在植物抗衰老、傷害、非生物逆境脅迫和激素處理,以及正常生長中也發(fā)揮重要作用。在PR蛋白家族中,PR1是一類重要的蛋白,但對其作用機制以及靶物質還尚不了解[2]。水楊酸(salicylic acid,SA)或乙烯(ethylene) 可誘導PR1基因的表達,常被作為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)的分子標記[3],因此,PR1基因編碼的蛋白質成為目前的研究熱點。

    PR1蛋白最早從煙草中發(fā)現,隨后從許多單子葉和雙子葉植物中鑒定出PR1基因。PR1是一類可經病原菌和SA大量誘導表達的PR蛋白,蛋白分子量為14~17 ku,有酸性和堿性,大多呈堿性。PR1 被證實具有抗病毒擴散、限制真菌入侵和保護植物抵御逆境脅迫等功能[4-5]。Agrawal 等研究證明OsPR1a、OsPR1b基因受茉莉酸(jasmonic acid,JA)、SA、過氧化氫(H2O2)、蛋白酶抑制劑斑蝥素(cantharidin,CN)、草藻滅(endothall,EN)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的誘導,對光傷害及磷酸酶抑制劑等環(huán)境脅迫和化學處理作出反應[6-8]。楊德翠等研究發(fā)現,PR1基因表達量與水楊酸的積累密切相關,表達量的升高增強了牡丹對柱枝孢葉斑?。–ylindrocladium canadense)的抗性,并且發(fā)現該病侵染牡丹 24 h 后,PR1基因的表達顯著提高[9]。

    小麥(Triticum aestivum)是重要的糧食作物,是全世界一半以上人口的主糧。小麥生產經常受到病蟲害的威脅,尤其由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是威脅全球小麥穩(wěn)產高產的主要病害之一。小麥抗葉銹病基因Lr35,其抗性從2葉期開始表達,6葉期完全表達,是1個十分有效的成株抗葉銹病基因。筆者前期利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術從含有小麥抗葉銹病基因Lr35的近等基因系材料TcLr35中獲得1個PR1基因的cDNA全長,命名為TaLr35PR1[10]。本研究擬利用半定量RT-PCR明確TaLr35PR1基因在受葉銹菌和信號分子誘導后核酸水平的表達特征,為進一步探究其在生物與非生物脅迫過程中的功能及了解生物脅迫應答機理提供線索。

    1材料與方法

    1.1試驗材料

    供試植物材料為攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系材料TcLr35,及與其遺傳背景相同的感病親本“Thatcher”;供試小麥葉銹菌菌株為07-10-426-1(PHNT),該菌株對TcLr35呈非親和反應(反應型為1型),對Thatcher呈親和反應(反應型為4型)。各種限制性內切酶、質粒、膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶購自生工生物工程上海(股份)有限公司;原核表達載體pEASYTM-E1購自北京全式金生物技術有限公司。

    1.2試驗方法

    化學試劑處理:參考Zambounis等的方法[11]配制50 μmol/L SA溶液、50 μmol/L ABA溶液,噴灑于六葉期的成株小麥葉片表面至溶液滴下,于18~25 ℃、光照時間10~14 h的溫室培養(yǎng),處理3 d后,開始接種葉銹菌07-10-426-1(孢子萌發(fā)率為80%以上),以未接菌處理為對照,分別在接種后0、6、12、24、36、48、72、120 h取0.1 g葉片,液氮速凍后于-80 ℃儲藏備用。

    1.3總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

    采用Bio-Flux公司的BIOZOL試劑盒提取小麥各處理樣品總RNA,按照寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄酶試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。反轉錄合成的模板直接用于PR1基因的半定量RT-PCR分析。

    1.4小麥TaLr35PR1生物信息學分析

    利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.)、ProtScale(http://expasy.org/tools/)和Spidey(http://www. nebi. nlm. nih. Gov/spidey)在線工具完成對基因結構模式的分析。分別利用SOPMA程序和Phyre2在線工具完成對蛋白質二級、三級結構的預測。

    1.5小麥TaLr35PR1基因表達模式分析

    根據TaLr35PR1基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)設計特異引物TaLr35PR1-F、TaLr35PR1-R(TaLr35PR1-F:5′- CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′;TaLr35PR1-R:5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′),以小麥中組成型表達的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank登錄號:AF251217;GAPDH-F:5′-AACTGCCTTGCTCCTCTTGC-3′;GAPDH-R:5′-CTGTTGTCACCCTGGAAGTCA-3′)作為內標基因。以葉銹菌、ABA,SA處理后不同時間點的小麥葉片的cDNA為模板進行半定量RT-PCR。PCR反應條件為:94 ℃預變性1 min;94 ℃變性30 s,51 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán)。每個樣品設3個重復。試驗數據通過genetools軟件得出表達量大小,利用SPSS軟件計算方差和顯著性,綜合進行分析,獲得TaLr35PR1基因的相對表達量。

    1.6小麥TaLr35PR1原核表達載體的構建與誘導表達

    設計原核表達特異引物YTaLr35PR1-F:5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′、YTaLr35PR1-R:5′-CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′;PCR產物與表達載體pEASY-E1進行連接并轉化。首先使用PCR擴增用引物驗證目的片段與載體連接是否成功,再利用上游引物YTaLr35PR1-F和載體自帶T7終止子引物T7terminator(5′-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3′)驗證目的片段插入的方向性,然后轉入表達載體BL21(DE3)感受態(tài)細胞后進行誘導表達。

    2結果與分析

    2.1小麥TaLr35PR1基因特征分析

    ProtScale軟件[12]預測TaLr35PR1編碼的蛋白總體表現為疏水性;SignalP 4.1[13]預測TaLr35PR1氨基酸序列具有信號肽,信號肽酶切位點在第1~24個氨基酸殘基之間。利用 SMART在線軟件對TaLr35PR1基因進行結構分析,結果表明該基因具有保守的抗真菌結構域SCP(圖1);利用Phyre2軟件分析,結果表明該基因由4條α螺旋、4條β折疊構成,呈三明治般的ɑβɑ結構。

    2.2小麥TaLr35PR1基因表達模式

    2.2.1SA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L SA脅迫處理后,TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加,并達到最大,約為對照組(0 h)表達量的7.6倍;之后隨著時間延長,表達量減少,到120 h又略有增加,約為對照組(0 h)表達量的2.6倍(圖2)。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用,50 μmol/L水楊酸脅迫處理3 d后,再接種葉銹菌,TaLr35PR1基因表達量在接種12 h極顯著增加并達到最大(P<0.01),約為對照組(0 h)的2.6倍;之后隨著接種時間延長,表達量顯著減少,到120 h又略有增加,約為未接種對照組(0 h)表達量的1.8倍。水楊酸預處理后再接種葉銹菌的表達趨勢與未接菌處理基本一致,但整體表達水平高于未接菌處理,接菌0 h后,TaLr35PR1基因表達量約為未接菌處理5.9倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

    2.2.2ABA誘導葉片中TaLr35PR1基因的表達譜分析50 μmol/L ABA脅迫處理后,TaLr35PR1基因表達量在處理 12 h 明顯增加,72 h達到表達高峰,約為對照組(0 h)表達量的3.6倍,至120 h表達量減少(圖3)。為了明確信號分子與葉銹菌的協(xié)調作用,在50 μmol/L脫落酸脅迫預處理后,再接種葉銹菌。結果表明,TaLr35PR1基因表達量在接種12 h后顯著增加,至72 h達到最大(P<0.05),約為未接種對照組(0 h)的1.8倍;之后隨著接種時間延長,表達量稍有減少,整體表達趨勢與未接菌處理一致,但表達量明顯高于未接菌處理;接菌0 h后,TaLr35PR1基因表達量約為脫落酸處理(0 h)的3.2倍。上述結果均扣除了Thatcher的表達量。

    2.3TaLr35PR1基因原核表達載體的構建

    利用pEASY-E1表達試劑盒構建表達載體TaLr35PR1-pEASY,為驗證目的片段是否與載體成功連接,利用YTaLr35PR1-F、YTaLr35PR1-R引物進行PCR擴增,對重組子進行初篩,獲得約420 bp左右的片段,與該引物對TcLr35總RNA的PCR擴增產物大小一致,說明目的基因已經整合到pEASY-E1載體上。為驗證目的片段插入載體的方向是否正確,使用YTaLr35PR1-F、T7terminator重組引物對重組子進行篩選,預期擴增產物為目的片段與載體序列的重組片段,獲得約500 bp左右的片段(圖4),證明插入載體的方向正確。測序結果進一步表明,目的片段插入表達載體的位置和讀碼框正確。

    2.4TaLr35PR1基因的體外誘導表達

    以不同溫度、不同IPTG濃度、不同時間誘導轉化了表達載體pEASY-PR1的大腸桿菌BL21(DE3)。經SDS-PAGE

    分析可見,在25 ℃溫度下,誘導的pEASY-PR1在17 ku左右產生1條新的誘導條帶,大小與理論值推算相符,而在27 ℃溫度下未見明顯誘導條帶(圖5-A);以未經誘導的pEASY-PR1為對照,0.01~0.80 mmol/L IPTG誘導菌體均產生1條約17 ku的新條帶,確定0.80 mmol/L IPTG為最佳的誘導濃度(圖5-B);隨著誘導時間的延長,誘導2 h蛋白表達量增加明顯,6 h至過夜趨于穩(wěn)定,最佳誘導時間為8 h(圖5-C)。結果表明,小麥TaLr35PR1基因在大腸桿菌中得到了高效表達,獲得了分子量約為17 ku的融合蛋白,最佳誘導條件為在0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導8 h。

    3結論與討論

    有報道證明擬南芥在抵抗病原物后的茉莉酸(JA)、SA信號轉導網絡協(xié)調擬南芥抗病性[14]。此外,在病原物侵染前用SA處理擬南芥,發(fā)現可以誘導SAR反應以及PR蛋白的表達,以增強抗病能力[15]。PR1基因能被病菌侵染和信號分子脅迫所誘導[16-17],PR1基因的表達增強了植物抵御病害和其他各種脅迫的能力。機械損傷、植物激素(JA、SA、ET)、蛋白磷酸酶抑制劑斑蝥素(CN)、草藻滅(EN)都能誘導水稻OsPR1a基因的表達[18]。SA介導的SAR反應主要對活體營養(yǎng)型病菌起作用,而JA/ET介導的抗病信號途徑對抵抗腐生型真菌侵染起到作用[19]。棉花的PR3、PR10、GST18基因在轉錄水平上不僅受JA、SA的誘導,而且受棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)誘導后表達水平顯著上調[11]。小麥葉銹菌為典型的活體營養(yǎng)型病菌。本研究旨在明確SA和葉銹菌誘導對TaLr35PR1基因表達的影響,結果發(fā)現TaLr35PR1基因表達受SA單獨誘導;同時,在SA脅迫處理后再接種葉銹菌,TaLr35PR1基因表達趨勢與SA誘導表達趨勢一致,而且SA與葉銹菌協(xié)同作用顯著增加了TaLr35PR1表達量,且其表達量明顯高于葉銹菌單獨誘導。

    ABA是調節(jié)植物生長發(fā)育的一種激素。當植物面臨不利的自然環(huán)境時,植物體內ABA的含量會增加,進而促進植物生長。植物體內存在ABA、非ABA 2種調節(jié)系統(tǒng)[20]。實現這種調節(jié)必須能夠順利完成從刺激到準確反應的一系列信號轉導過程,這主要包括以受體為中心的脫落酸信號的細胞識別、以第二信使為中心的胞內信號轉換,以及以蛋白磷酸化為中心的信號放大與傳導等過程[14]。在前期研究中證明ABA可以誘導病程相關蛋白的表達[21],在本研究中發(fā)現TaLr35PR1基因表達受ABA誘導,而且脫落酸與葉銹菌協(xié)同作用明顯誘導TaLr35PR1基因的表達,而且表達量顯著高于SA和葉銹菌單獨誘導?;?種信號分子對TaLr35PR1基因的誘導表達模式,推測小麥TaLr35PR1基因在參與小麥抗葉銹病防御反應時,可能通過SA、ABA 2種信號途徑,但具體作用機制還需進一步探討。

    水稻、小麥等作物中關于病程相關蛋白從蛋白水平驗證抗病性的研究報道較多。李雪姣等研究發(fā)現,在水稻與白葉枯病菌互作時,病程相關蛋白1家族在接菌后不同時間點、不同生長期都發(fā)揮作用[22];關明俐等的研究有力地證明了不同的病程相關蛋白在水稻與白葉枯病菌互作時發(fā)揮作用[23];此外,牛吉山等應用RT-PCR和cDNA文庫篩選技術,從抗白粉病小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系中分離到1個小麥類甜蛋白基因的全長cDNA,Western分析表明其可能與小麥 6VS/6AL 易位系的抗白粉病性相關[24];余宇克隆得到了小麥類甜蛋白基因的全長序列,并利用原核表達得到純度較高的類甜蛋白[25]。后續(xù)研究將進一步制備單克隆抗體,從蛋白水平分析其表達模式,并分析其他信號分子對該基因的影響,探析信號傳遞途徑。

    參考文獻:

    [1]Fujita M,Fujita Y,Noutoshi Y,et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses:a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Current Opinion in Plant Biology,2006,9(4):436-442.

    [2]Hou M,Xu W,Bai H,et al. Characteristic expression of rice pathogenesis-related proteins in rice leaves during interactions with Xanthomonas oryzae pv. oryzae[J]. Plant Cell Reports,2012,31(5):895-904.

    [3]van Loon L C,van Strien E A. The families of pathogenesis-related proteins,their activities and comparative analysis of PR-1 type proteins[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology,1999,55(2):85-97.

    [4]Cutt J R,Harpster M H,Dixon D C,et al. Disease response to tobacco Mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis-related PR1b gene[J]. Virology,1989,173(1):89-97.

    [5]Rauscher M,Adám A L,Wirtz S,et al. PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean[J]. The Plant Journal,1999,19(6):625-633.

    [6]Agrawal G K,Jwa N S,Rakwal R. A novel rice(Oryza sativa L.) acidic PR1 gene highly responsive to cut,phytohormones,and protein phosphatase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,274(1):157-165.

    [7]Agrawal G K,Rakwal R,Jwa N S. Rice(Oryza sativa L.) OsPR1b gene is phytohormonally regulated in close interaction with light signals[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,278(2):290-298.

    [8]Agrawal G K,Rakwal R,Jwa N S,et al. Signalling molecules and blast pathogen attack activates rice OsPR1a and OsPR1b genes:a model illustrating components participating during defence/stress response[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2001,39(12):1095-1103.

    [9]楊德翠,張玉喜,鄭國生. 牡丹病程相關蛋白1基因的克隆及表達分析[J]. 園藝學報,2013,40(8):1583-1590.

    [10]王海燕,劉大群,楊文香,等. TcLr35小麥中病程相關蛋白1基因的克隆及分析[J]. 植物遺傳資源學報,2007,8(1):16-20,29.

    [11]Zambounis A G,Kalamaki M S,Tani E E,et al. Expression analysis of Defense-Related genes in cotton(aossypium hirsutum) after Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum infection and following chemical elicitation using a salicylic acid analog and methyl jasmonate[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2012,30(1):225-234.

    [12]Kyte J,Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology,1982,157(1):105-132.

    [13]Nielsen H,Engelbrecht J,Brunak S,et al. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites[J]. Protein Engineering,1997,10(1):1-6.

    [14]Berrocal-Lobo M,Molina A. Arabidopsis defense response against Fusarium oxysporum[J]. Trends in Plant Science,2008,13(3):145-150.

    [15]Edgar C I,Mcgrath K C,Dombrecht B,et al. Salicylic acid mediates resistance to the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum in the model host Arabidopsis thaliana[J]. Australas Plant Pathology,2006,35(6):581-591.

    [16]Tang Y,Kuang J F,Wang F Y,et al. Molecular characterization of PR and WRKY genes during SA- and MeJA-induced resistance against Colletotrichum musae in banana fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2013,79:62-68.

    [17]Agrawal G K,Jwa N S,Rakwal R. A novel rice(Oryza sativa L.) acidic PR1 gene highly responsive to cut,phytohormones,and protein phosphatase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,274(1):157-165.

    [18]von Dahl C C,Baldwin I T. Deciphering the role of ethylene in plant herbivore interactions[J]. Journal of Plant Growth Regulation,2007,26:201-209.

    [19]Glazebrook J. Contrasting mechanism of defence against biotrophic pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology,2005,43:205-227.

    [20]Chinnusamy V,Schumaker K,Zhu J K. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants[J]. Journal of Experimental Botany,2004,55(395):225-236.

    [21]栗小英,高琳,張艷俊,等. 葉銹菌及信號分子誘導小麥 TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表達分析[J]. 中國農業(yè)科學,2014,47(14):2774-2783.

    [22]李雪姣,范偉,牛東東,等. 水稻病程相關PR1家族蛋白質在葉片生長及與白葉枯病菌互作反應中的表達[J]. 植物學報,2014,49(2):127-138.

    [23]關明俐,竇世娟,李雪姣,等. 病程相關蛋白質在水稻與白葉枯病菌互作過程中的表達[J]. 中國農業(yè)科學,2013,46(20):4179-4188.

    [24]牛吉山,于玲,陳佩度,等. 小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系葉片cDNA文庫構建及鑒定[J]. 南京農業(yè)大學學報,2001,24(1):5-8.

    [25]余宇. 小麥類甜蛋白TLP基因的克隆與原核表達[D].

    猜你喜歡
    表達分析原核表達
    人FOXA1蛋白的原核表達、純化及蛋白互作分析
    花生AhSOS2基因原核表達載體的構建及表達
    亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲av二区三区四区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 成人黄色视频免费在线看| 精品一区在线观看国产| 精品人妻熟女av久视频| 国产午夜精品一二区理论片| 久久热精品热| 亚洲国产欧美人成| 日本欧美国产在线视频| 特大巨黑吊av在线直播| 伦精品一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 人妻系列 视频| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩人妻高清精品专区| 久久久精品94久久精品| 国产精品一二三区在线看| 青春草视频在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲中文av在线| av免费观看日本| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 水蜜桃什么品种好| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产男女内射视频| 99久国产av精品国产电影| 涩涩av久久男人的天堂| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99热网站在线观看| 大香蕉97超碰在线| 99热这里只有是精品50| 1000部很黄的大片| 亚洲精品国产成人久久av| 下体分泌物呈黄色| 在线播放无遮挡| 2022亚洲国产成人精品| 超碰av人人做人人爽久久| 国产探花极品一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久性生活片| 国产 精品1| 能在线免费看毛片的网站| 99久国产av精品国产电影| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产成人精品一,二区| 蜜桃在线观看..| 伦理电影大哥的女人| 精品熟女少妇av免费看| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 中文天堂在线官网| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av在线观看视频网站免费| 久久久久久伊人网av| 国产精品精品国产色婷婷| 91久久精品国产一区二区成人| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲人与动物交配视频| 中文字幕亚洲精品专区| 丝袜喷水一区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日本爱情动作片www.在线观看| 六月丁香七月| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲第一av免费看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 男女免费视频国产| 久久99热这里只有精品18| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久热久热在线精品观看| 午夜视频国产福利| 五月开心婷婷网| 亚洲av欧美aⅴ国产| 色吧在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 天天躁日日操中文字幕| 久久人人爽人人片av| 免费少妇av软件| 久久久久久久久久人人人人人人| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清国产精品国产三级 | 久久久精品免费免费高清| 亚洲久久久国产精品| 久久人妻熟女aⅴ| 国产伦精品一区二区三区视频9| 激情 狠狠 欧美| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产69精品久久久久777片| 国产精品久久久久成人av| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲真实伦在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一二三四中文在线观看免费高清| 高清欧美精品videossex| 99热全是精品| 国产v大片淫在线免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 九九在线视频观看精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av男天堂| 超碰av人人做人人爽久久| 成年人午夜在线观看视频| 欧美高清性xxxxhd video| 尾随美女入室| 久久热精品热| 黑人高潮一二区| av在线播放精品| 国产成人aa在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品亚洲成国产av| 黄色配什么色好看| 街头女战士在线观看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 国产永久视频网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 内地一区二区视频在线| av网站免费在线观看视频| 中国国产av一级| 久热久热在线精品观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 日日啪夜夜爽| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产久久久一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲三级黄色毛片| 99热国产这里只有精品6| 日韩欧美精品免费久久| 免费黄频网站在线观看国产| 国产黄片美女视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99热网站在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产在线免费精品| 精品午夜福利在线看| 午夜激情福利司机影院| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品久久久久久av不卡| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 观看免费一级毛片| 日日啪夜夜撸| 国产精品久久久久成人av| 18+在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 国产人妻一区二区三区在| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产av新网站| 国产亚洲一区二区精品| av在线蜜桃| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久精品国产a三级三级三级| 91久久精品电影网| 国产高清有码在线观看视频| 联通29元200g的流量卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产又色又爽无遮挡免| 视频区图区小说| 国产片特级美女逼逼视频| 高清视频免费观看一区二区| 大码成人一级视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 在线天堂最新版资源| 有码 亚洲区| 亚洲av不卡在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 免费观看a级毛片全部| 久久精品久久精品一区二区三区| 在现免费观看毛片| 亚洲国产精品999| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| av线在线观看网站| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 丰满少妇做爰视频| 99久久人妻综合| 看免费成人av毛片| 美女主播在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲av免费高清在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 国产一区二区三区av在线| 日韩三级伦理在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品一区蜜桃| 国产在线免费精品| 亚洲美女视频黄频| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲国产精品国产精品| av天堂中文字幕网| 久久久久久久久大av| 亚洲高清免费不卡视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黑丝袜美女国产一区| 色婷婷av一区二区三区视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲中文av在线| 黑人猛操日本美女一级片| 国产在线一区二区三区精| 婷婷色麻豆天堂久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲性久久影院| 亚洲精品乱久久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美少妇被猛烈插入视频| 香蕉精品网在线| 老司机影院毛片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级黄片播放器| 全区人妻精品视频| 欧美zozozo另类| a级一级毛片免费在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 少妇熟女欧美另类| 91久久精品电影网| 午夜老司机福利剧场| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 搡老乐熟女国产| av在线老鸭窝| 国产成人91sexporn| 性色av一级| 欧美xxⅹ黑人| 午夜老司机福利剧场| 99国产精品免费福利视频| 久久久国产一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩人妻高清精品专区| 麻豆成人午夜福利视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲国产最新在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 日韩一区二区视频免费看| www.色视频.com| 免费看日本二区| 亚洲精品亚洲一区二区| av女优亚洲男人天堂| 亚洲成人av在线免费| 久久综合国产亚洲精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久这里有精品视频免费| 99热网站在线观看| 直男gayav资源| 精品人妻视频免费看| 麻豆成人午夜福利视频| 日本黄大片高清| 欧美成人a在线观看| 日韩成人伦理影院| 91久久精品国产一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 亚洲av男天堂| 97在线人人人人妻| 观看av在线不卡| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久久久久电影| 免费观看性生交大片5| 18+在线观看网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品色激情综合| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品偷伦视频观看了| 人妻少妇偷人精品九色| 国产有黄有色有爽视频| 99久久综合免费| 欧美人与善性xxx| 欧美国产精品一级二级三级 | av在线蜜桃| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久国产网址| 尾随美女入室| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产色婷婷99| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲伊人久久精品综合| 日日啪夜夜爽| 99热网站在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 色婷婷av一区二区三区视频| 97在线人人人人妻| 七月丁香在线播放| 国产 一区 欧美 日韩| 视频区图区小说| 香蕉精品网在线| 国产精品成人在线| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲国产色片| av网站免费在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产成人a区在线观看| 一区二区av电影网| 免费黄网站久久成人精品| 久久国产乱子免费精品| 亚洲成人一二三区av| 日日啪夜夜撸| 国产精品一二三区在线看| 男人舔奶头视频| 乱系列少妇在线播放| 成人毛片60女人毛片免费| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 色5月婷婷丁香| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 男女边吃奶边做爰视频| 精品视频人人做人人爽| 一级片'在线观看视频| 亚洲人成网站高清观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| av黄色大香蕉| 中国三级夫妇交换| 在线观看一区二区三区激情| 七月丁香在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲精品色激情综合| 老女人水多毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 高清在线视频一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 成人综合一区亚洲| 精品午夜福利在线看| 亚洲av成人精品一区久久| 一级毛片 在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产熟女欧美一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 成人亚洲精品一区在线观看 | 欧美激情国产日韩精品一区| 久久97久久精品| 国产成人freesex在线| 久久99热这里只频精品6学生| 免费看光身美女| 亚洲色图综合在线观看| .国产精品久久| 99久久综合免费| 免费av不卡在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| av天堂中文字幕网| 2021少妇久久久久久久久久久| 九九在线视频观看精品| 最近手机中文字幕大全| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一本一本综合久久| 亚洲第一区二区三区不卡| av不卡在线播放| 亚洲av日韩在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av国产av综合av卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 一区在线观看完整版| 欧美日韩亚洲高清精品| 少妇人妻 视频| 国产乱人偷精品视频| 我的女老师完整版在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 2018国产大陆天天弄谢| 蜜桃在线观看..| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久久久久成人| 国产成人a∨麻豆精品| av天堂中文字幕网| 99久国产av精品国产电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产 精品1| 亚洲一区二区三区欧美精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 伊人久久国产一区二区| xxx大片免费视频| 久久这里有精品视频免费| 伦理电影免费视频| 国产在线视频一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 99热全是精品| 最黄视频免费看| 直男gayav资源| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 激情 狠狠 欧美| 日韩国内少妇激情av| 午夜福利视频精品| 制服丝袜香蕉在线| 99热全是精品| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费av中文字幕在线| 国产伦理片在线播放av一区| 91精品国产国语对白视频| 国产av精品麻豆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩一区二区三区影片| 日本午夜av视频| 久久精品国产亚洲av天美| av免费在线看不卡| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产视频首页在线观看| 国产成人精品福利久久| 日韩免费高清中文字幕av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 色视频www国产| 少妇丰满av| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久久久久九九精品二区国产| 一级黄片播放器| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚州av有码| h视频一区二区三区| 久久影院123| 色综合色国产| 老司机影院成人| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 18禁动态无遮挡网站| 日日撸夜夜添| av视频免费观看在线观看| 青青草视频在线视频观看| 国产在线免费精品| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品人妻少妇| 久久久久久久国产电影| 精品午夜福利在线看| 免费看不卡的av| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲成人av在线免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美 日韩 精品 国产| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久精品性色| av免费观看日本| 国产大屁股一区二区在线视频| 有码 亚洲区| 亚洲在久久综合| 一级毛片我不卡| 边亲边吃奶的免费视频| 久热久热在线精品观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av卡一久久| 边亲边吃奶的免费视频| 国产v大片淫在线免费观看| 成人国产av品久久久| 一级黄片播放器| 精品国产乱码久久久久久小说| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩国内少妇激情av| 亚洲综合精品二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美成人午夜免费资源| 精品久久久久久久久av| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲四区av| 久久99精品国语久久久| 亚洲国产精品国产精品| 欧美精品国产亚洲| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久 成人 亚洲| 男女免费视频国产| 成人二区视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产毛片在线视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩人妻高清精品专区| 免费黄网站久久成人精品| 一边亲一边摸免费视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 一级爰片在线观看| 97在线视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲国产色片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 如何舔出高潮| 少妇的逼好多水| 亚洲在久久综合| 国内精品宾馆在线| av免费观看日本| 国产一区有黄有色的免费视频| 97超视频在线观看视频| 欧美人与善性xxx| 日韩免费高清中文字幕av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久影院123| 插逼视频在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲av男天堂| 久久av网站| 我要看黄色一级片免费的| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩强制内射视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人国产麻豆网| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美成人a在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产深夜福利视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产毛片在线视频| 日本欧美国产在线视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲av.av天堂| 美女中出高潮动态图| 天美传媒精品一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99热这里只有精品一区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费av不卡在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩大片免费观看网站| 免费看光身美女| 国产精品一区www在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av视频免费观看在线观看| videossex国产| 久久99精品国语久久久| 免费少妇av软件| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产久久久一区二区三区| 中国国产av一级| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av不卡在线观看| 丰满乱子伦码专区| 欧美区成人在线视频| 妹子高潮喷水视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 中文字幕av成人在线电影| 国产乱人偷精品视频| 久久综合国产亚洲精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 舔av片在线| 大话2 男鬼变身卡| 欧美成人午夜免费资源| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人精品久久久久久| 国产精品伦人一区二区| 少妇人妻久久综合中文| 欧美97在线视频| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人aa在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 老女人水多毛片| 亚洲精品久久午夜乱码| 制服丝袜香蕉在线| 中文字幕免费在线视频6| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 赤兔流量卡办理| 高清欧美精品videossex|