適應(yīng)度代價(jià)對(duì)大腸桿菌藥物敏感性恢復(fù)的作用

孫碩　呂世明　譚艾娟　華夏　李博巖　焦亞琴

摘 要：通過(guò)測(cè)定野生型大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感的、耐藥的以及從耐藥誘導(dǎo)恢復(fù)敏感的3種菌株的生長(zhǎng)曲線，探討適應(yīng)度代價(jià)對(duì)細(xì)菌耐藥性變化的影響。結(jié)果表明：對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的大腸桿菌C02的生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)低于敏感菌株C01和恢復(fù)敏感性后菌株C03； 而敏感菌株C01和敏感性恢復(fù)菌株C03的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線相近，說(shuō)明在無(wú)藥物選擇壓力環(huán)境中，適應(yīng)度代價(jià)高的耐藥菌生存競(jìng)爭(zhēng)力低于適應(yīng)度代價(jià)低的敏感菌，敏感菌逐漸取代耐藥菌，使菌群對(duì)藥物的敏感性得以恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；氟喹諾酮類(lèi)藥物；適合度代價(jià)；生長(zhǎng)曲線；敏感性恢復(fù)

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.008

Abstract： To discuss the effect of the fitness cost on drug-resistanc reversal of Escherichia coli， the growth curves of three strains E.coli， which E. coli C01 was sensitivity to fluoroquinolones， E. coli C02 was resistance to fluoroquinolones and E. coli C03 was restored sensitivity to fluoroquinolones， were determined. The result showed that the growth velocity of E. coli C02 resistented to fluoroquinolones was far lower than E. coli C01 or E. coli C03， and the growth velocities of E. coli C01 or E. coli C03 were quit similar. It demonstated that the survival competitiveness of drug-resistant bacteria possessed the high fitness cost was lower than sensitive one armied low fitness cost in the environment of no drug selection pressure. The drug-resistant bacteria was gradually replaced by ensitive bacteria and the drug sensitivity of microbiome was restored.

Key words： Escherichia coli； fluoroquinolones； fitness cost； growth curve； sestore sensitivity

細(xì)菌耐藥性是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所面臨的一大重要難題，近幾年的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的耐藥率呈現(xiàn)普遍上升趨勢(shì)[1-2]。在養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥物的不規(guī)范用藥，導(dǎo)致動(dòng)物源細(xì)菌耐藥水平不斷升高，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅，并增加了動(dòng)物性食品的不安全性[3]，因此，探索降低或消除細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，高度耐藥的沙門(mén)氏菌在沒(méi)有藥物選擇壓力的環(huán)境中其適合度代價(jià)將升高[4]，其生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)力低于敏感菌，使得敏感菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，最終取代耐藥菌而恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性。故養(yǎng)殖場(chǎng)可通過(guò)停止使用某種抗菌藥物來(lái)恢復(fù)細(xì)菌對(duì)該藥物的敏感性[5]。本研究通過(guò)測(cè)定對(duì)耐氟喹諾酮類(lèi)藥物不同耐藥狀態(tài)大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，考察對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥大腸桿菌生存適合度代價(jià)在細(xì)菌耐藥性恢復(fù)上的作用，為養(yǎng)殖場(chǎng)制定合理的輪換用藥方案，降低細(xì)菌耐藥性的危害提供支持。

1 材料和方法

1.1 菌株、藥物和試劑

藥物：環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星，均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。試劑：LB培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂、MHB瓊脂均購(gòu)于上海博微生物科技有限公司。

菌株：大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；野生型豬源大腸桿菌由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌對(duì)五種氟喹諾酮類(lèi)藥物MIC的測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法，測(cè)定豬源大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星5種氟喹諾酮類(lèi)藥物的MIC。

1.2.2 耐藥大腸桿菌C02誘導(dǎo) 通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選得到野生型敏感大腸桿菌C01，將C01在含有1/2MIC喹諾酮類(lèi)藥物的LB肉湯培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)，使其對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星均表現(xiàn)為中度耐藥（C02）。

1.2.3 耐藥菌敏感性恢復(fù)誘導(dǎo) 將耐藥菌C02與敏感菌C01按95%：5%的比例混合后取1 mL加到4 mL的LB肉湯中，置于37 °C，傳代230代，測(cè)定MIC值。

1.2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 參照任慧英方法改進(jìn)，在600 nm的光密度下測(cè)量LB肉湯培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。將敏感的C01菌株和誘導(dǎo)耐藥的C02、C03菌株分別置于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C下分別培養(yǎng)0，0.5，1，1.5，2，2.5，3， 3.5，4，5，6，7，8，9，12 h，然后分別測(cè)定它們的OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表1可以看出，野生型敏感大腸桿菌C01對(duì)5種氟喹諾酮類(lèi)藥物均敏感，而C01經(jīng)短時(shí)間藥物誘導(dǎo)后得到的大腸桿菌C02對(duì)5種藥物呈現(xiàn)中度耐藥，耐藥的C02在無(wú)藥環(huán)境和有敏感菌存在條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)得到CO3，其對(duì)5種藥物的MIC值恢復(fù)至敏感性。

2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

從C01、C02、C03的生長(zhǎng)曲線（圖1）可以看出，對(duì)藥物敏感的C01和C03生長(zhǎng)趨勢(shì)和速率十分相近，而對(duì)藥物耐藥的C02的增長(zhǎng)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C01和C03，證明大腸桿菌的耐藥性可提高細(xì)菌的適合度代價(jià)，可降低細(xì)菌的生長(zhǎng)率。

3 討 論

細(xì)菌的適合度代價(jià)是指在沒(méi)有選擇壓力條件下，如果特定基因型個(gè)體的適合度低于種群平均的適合度，即可以認(rèn)為該基因型存在適合度代價(jià)。在藥物選擇壓力下，個(gè)別細(xì)菌可通過(guò)有意義的基因突變或接受其他耐藥菌的耐藥基因而獲得對(duì)藥物的耐藥性，提高了其在有藥物環(huán)境中的生存適應(yīng)度，成為優(yōu)勢(shì)菌，并逐漸取代敏感菌而表現(xiàn)對(duì)藥物耐藥 [6-8]。但在沒(méi)有藥物選擇壓力的環(huán)境中，耐藥菌由于生存適合度代價(jià)的升高，其適應(yīng)性、毒力及質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率均較敏感株明顯下降，敏感株處于主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，能抑制耐藥菌的生長(zhǎng)，甚至在一定時(shí)間內(nèi)將耐藥菌清除，使細(xì)菌群體對(duì)藥物的敏感性得以恢復(fù)[9]。

研究結(jié)果表明，耐藥菌在無(wú)藥環(huán)境中的生長(zhǎng)速率大大低于敏感菌，說(shuō)明獲得高度耐藥細(xì)菌在沒(méi)有抗菌藥物的選擇壓力時(shí)生存適合度高于敏感菌；將敏感菌參入耐藥菌中后置于無(wú)藥環(huán)境中傳代230代，可使細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性得以恢復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了細(xì)菌生存適應(yīng)度代價(jià)的高低對(duì)細(xì)菌種群進(jìn)化方向的影響，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)室條件下證實(shí)了養(yǎng)殖生產(chǎn)中和臨床治療中可采用輪換用藥來(lái)對(duì)抗細(xì)菌耐藥性危害的機(jī)制。

因此，規(guī)范用藥、建立合理的輪換用藥機(jī)制，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)中細(xì)菌耐藥率和耐藥水平的控制有很大意義。

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