基于數(shù)據(jù)挖掘的國家名老中醫(yī)抗腫瘤用藥規(guī)律及核心復(fù)方解析

謝丹楓 王能 陳紫瑩

摘要 目的：基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究國家名老中醫(yī)抗腫瘤方劑的用藥規(guī)律、核心處方及藥物靶標(biāo)，探討核心處方防治腫瘤的機(jī)制。方法：收集國家名老中醫(yī)抗腫瘤方劑，采用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（TCMISSV 2.5）分析用藥規(guī)律及挖掘核心復(fù)方，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測核心復(fù)方靶點(diǎn)，并使用GO分析和KEGG分析探索核心復(fù)方抗腫瘤的機(jī)制。結(jié)果：本研究收集方劑296條，中藥383味。統(tǒng)計(jì)高頻藥物、藥物組合及計(jì)算出10種核心藥物。在核心藥物的基礎(chǔ)上按照君臣佐使配伍規(guī)律確定核心復(fù)方“白花蛇舌草-黃芪-莪術(shù)-甘草”。對核心復(fù)方運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩得118種化合物、95個(gè)藥物活性成分及52個(gè)核心靶點(diǎn)。KEGG通路分析主要與炎性反應(yīng)、凋亡及免疫等生物學(xué)過程相關(guān)，與前期抗腫瘤活性研究數(shù)據(jù)相符。結(jié)論：名老中醫(yī)治療腫瘤多以扶正祛邪、攻補(bǔ)兼施為治則，核心復(fù)方的挖掘?yàn)橹嗅t(yī)藥抗腫瘤治療標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和國際化提供新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示核心復(fù)方的抗腫瘤機(jī)制主要包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)控免疫平衡，抑制缺氧和炎性微環(huán)境，阻斷腫瘤新生血管形成。

關(guān)鍵詞 名醫(yī)經(jīng)驗(yàn);惡性腫瘤;數(shù)據(jù)挖掘;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);中醫(yī)藥

Abstract Objective：To explore the medication rules of famous national traditional Chinese medicine（TCM）masters for cancer treatment，and to determine the core formula and cancer prevention mechanism based on data mining and network pharmacology.Methods：The formulas for anti-cancer of national TCM masters were collected.TCMISSV 2.5 software was adopted for the analysis of prescription rules and core formula.We predicted the core compound target through network pharmacology，and used GO analysis and KEGG analysis to explore the anti-tumor mechanism of the core compound.Results：A total of 296 formulas and 383 kinds of Chinese medicines were collected.We counted the high frequency medicines，medicine pairs and calculated 10 critical medicines.A core formula consisting of Oldenlandia Diffusa，Astragali Radix，Curcumae Rhizoma and Glycyrrhizae Radix was found according to monarch，minister compatibility rule principle.The core formula was used by network pharmacology to screen 118 kinds of compounds，95 medicianl active components and 52 molecular targets.KEGG pathway analysis was mainly related to biological processes such as inflammation，apoptosis and immunity，which is consistent with the data of previous anti-tumor activity research.Conclusion：The main principle of cancer-related prescriptions by famous national TCM masters is focused on strengthening healthy qi to eliminate pathogens，both reinforcement and supplementation.The discovery of the core formula provides a new idea for the standardization，modernization and internationalization of TCM anti-cancer therapy.Network pharmacology results indicates that the anti-cancer mechanisms of the core formula mainly focus on apoptosis induction，immune balance regulation，hypoxia and inflammation inhibition，as well as neoangiogenesis inhibition.

Keywords Traditional Chinese medicine master experience; Malignant cancer; Data mining; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine

中圖分類號(hào)：R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.010

惡性腫瘤是威脅世界人民健康和生命的重大病種，2018年全球約有1 800萬新發(fā)腫瘤患者和960萬腫瘤死亡人數(shù)，2019年我國國家癌癥中心最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.91%，且發(fā)病率保持每年約3.9%的增長，死亡率每年保持約2.5%的增長，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費(fèi)超過2 200億，防控形勢及其嚴(yán)峻[1]。目前惡性腫瘤的主要治療方式仍然是以“殺死性”治療策略為主的對抗方式，耐藥轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因。隨著“帶瘤生存，重視生命質(zhì)量的改善”等治療理念的深入，中醫(yī)藥在腫瘤治療中的作用和地位愈加重要，大量臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)中醫(yī)藥可以滲透到腫瘤治療的各個(gè)環(huán)節(jié)，在此過程中眾多國家名老中醫(yī)提出多種治則，如扶正培本法、清熱解毒法、活血祛瘀法、軟堅(jiān)散結(jié)法、消腫止痛法，并積累了諸多經(jīng)方驗(yàn)方，在臨床上發(fā)揮了良好療效。然而正是由于理法方藥流派眾多，組成復(fù)雜，大規(guī)模的臨床研究和機(jī)制探討很難進(jìn)行，造成中醫(yī)藥抗腫瘤的有效性和安全性在國際上認(rèn)可度較低，所以總結(jié)國家名老中醫(yī)用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)核心復(fù)方是中醫(yī)藥進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和國際化的必要步驟。本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，以歷代國家名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方為參考，旨在溯源分析中醫(yī)藥抗腫瘤復(fù)方的配伍規(guī)律及用藥思路的科學(xué)性，挖掘核心復(fù)方，并初步探索可能的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 處方來源 本研究以國家級名老中醫(yī)?？茖２矔赌[瘤病名中醫(yī)良方驗(yàn)案》[2]及《國家級名老中醫(yī)腫瘤病驗(yàn)案良方》[3]為處方遴選來源。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入中醫(yī)藥內(nèi)服湯劑治療腫瘤的古籍經(jīng)方、名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方及病例報(bào)告。需明確記載有藥物的組成及用量，療效確切;有復(fù)診的方劑只取首次處方;有中藥加減的方劑只取基礎(chǔ)方。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除外用中藥、注射液等非內(nèi)服湯劑治療的方劑;排除中藥劑量不明確的方劑;不同腫瘤所用方劑相同者，只錄入一次

1.4 藥名規(guī)范 參考《中華人民共和國藥典》[4]，統(tǒng)一規(guī)范所錄入的中藥名稱。比如“蚤休”“七葉一枝花”統(tǒng)一為“重樓”;“沙參”統(tǒng)一為“南沙參”;“云苓”“茯神”統(tǒng)一為“茯苓”。

1.5 數(shù)據(jù)的規(guī)范與數(shù)據(jù)庫的建立

采用中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究提供的中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)（Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System，TCMISS）軟件V2.5版，將篩選并規(guī)范后的296首處方及383味中藥錄入“方劑管理”模塊，采用雙人復(fù)核錄入的方法以確保數(shù)據(jù)錄入無誤，并使用“數(shù)據(jù)分析”模塊中的“方劑分析”功能，進(jìn)行組方規(guī)律的統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 處方數(shù)據(jù)分析

頻次統(tǒng)計(jì)分析：對每首方劑中每味中藥的用藥頻次從大到小排序。同時(shí)統(tǒng)計(jì)XX味藥物的四氣（寒、涼、溫、熱、平）、五味（酸、苦、甘、辛、咸、淡）、歸經(jīng)（肝、心、脾、肺、腎、膽、小腸、胃、大腸、膀胱、三焦及心包經(jīng)）屬性，最后分別將結(jié)果導(dǎo)出?；陉P(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析：“支持度”指將前項(xiàng)與后項(xiàng)在一個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)出現(xiàn)的頻率，“置信度”指前項(xiàng)出現(xiàn)時(shí)后項(xiàng)出現(xiàn)的概率。將“支持度個(gè)數(shù)”設(shè)置為26，“置信度”設(shè)置為0.55，基于關(guān)聯(lián)規(guī)則將藥物組合分別按頻次與置信度由高到低進(jìn)行排序，點(diǎn)擊“規(guī)則分析”并導(dǎo)出結(jié)果，并導(dǎo)出核心藥物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.7 活性化學(xué)成分的收集

本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別檢索并收集核心單味藥的化學(xué)成分信息。TCMSP可提供每種化合物的藥代動(dòng)力學(xué)信息，例如藥物相似性（Drug-likeness，DL）和口服生物利用度（Oral Availability，OB）等。OB和DL是評估ADME（Absorption and Distribution and Metabolism and Excretion）吸收、分布、代謝、特性的重要指標(biāo)[5]。OB≥30%可以反映其中藥成分被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度較高，DL≥0.18的化學(xué)成分與已知藥物的相似性較高，作為藥物主要活性成分的可能性較大。因此以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)來收集癌毒清中具有良好ADME特性的活性化學(xué)成分。然后利用TCMSP系統(tǒng)藥物靶向預(yù)測模型確定核心復(fù)方的潛在靶點(diǎn)，建立“化合物-靶點(diǎn)”模型圖。

1.8 潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測

把從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索所得的核心用藥的活性化學(xué)成分蛋白質(zhì)靶標(biāo)輸入U(xiǎn)niProt（https：//www.uniprot.org/），使用UniProt KB檢索功能，將物種設(shè)定為人類，提取相應(yīng)的官方基因名稱。在Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中檢索腫瘤的的相關(guān)靶點(diǎn)，篩選關(guān)鍵詞設(shè)置為tumor，收集腫瘤相關(guān)發(fā)病機(jī)制基因。對腫瘤相關(guān)發(fā)病機(jī)制基因與藥物活性化合物靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射并篩選出共同靶點(diǎn)，由此預(yù)測核心復(fù)方治療腫瘤的潛在作用靶點(diǎn)。

1.9 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?/p>

把潛在作用靶點(diǎn)基因輸入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl），得到擴(kuò)展的蛋白互作（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，下載PPI網(wǎng)絡(luò)交互信息表?！癉egree”為某節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的鏈接數(shù)，可以反映節(jié)點(diǎn)之間的交互信息。利用Cytoscape V3.7.1中的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA以自由度degree>50（所有節(jié)點(diǎn)自由度中位數(shù)的2倍）篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，獲得核心復(fù)方作用于腫瘤的核心基因。

1.10 靶點(diǎn)通路注釋分析

用David 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）和KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）對核心復(fù)方作用于腫瘤的核心基因進(jìn)行GO（Gene ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。GO富集分析指在某一功能層次上統(tǒng)計(jì)蛋白或者基因的數(shù)目或組成的一個(gè)有向無環(huán)圖，包括3個(gè)分支：生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）。KEGG分析可以用于推斷蛋白質(zhì)之間的新關(guān)聯(lián)，從而豐富蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。設(shè)定以人類基因?yàn)榉秶訮<0.05為篩選值，可獲得相應(yīng)的數(shù)據(jù)。選擇具有最多相應(yīng)目標(biāo)點(diǎn)數(shù)量的相關(guān)生物過程或相關(guān)途徑，繪制條形圖展示GO分析結(jié)果，并選擇氣泡圖呈現(xiàn)KEGG通路分析。

1.11 “化合物-靶點(diǎn)-通路”（Compound-Target Pathway Network，CTP）網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

結(jié)合核心復(fù)方有效活性成分、預(yù)測作用靶點(diǎn)與通路注釋分析的結(jié)果，采用CytoscapeV3.7.1建立“化合物—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)模型，以不同顏色的節(jié)點(diǎn)表示藥物成分、潛在作用靶點(diǎn)及作用通路，并采用線來表示藥效成分、預(yù)測的作用靶點(diǎn)、作用通路之間存在關(guān)聯(lián)或映射關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 藥物使用頻次統(tǒng)計(jì)

本研究收集治療腫瘤方劑296條，共使用中藥383味。對處方中的藥物頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，藥物使用頻次≥30的藥物有27味，小于10的有284，在兩者之間的有72味。使用頻次最多的藥物是黃芪，使用了116次。使用頻率最高的前10味藥物依次為：黃芪、白術(shù)、茯苓、甘草、白花蛇舌草、當(dāng)歸、黨參、莪術(shù)、半枝蓮、熟地黃。見表1。

2.2 藥物性味歸經(jīng)

在383味藥物的屬性中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)得出：四氣性寒的藥物最多，頻數(shù)高達(dá)143，占40.5%;以味苦為主，使用199次，占45.5%，其次味甘、味辛，分別占23.3%、20.9%。藥物歸肝經(jīng)最多，有202次，占22.9%;其次為肺經(jīng)151次，占16.5%。見表2。

2.2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析

設(shè)定支持度個(gè)數(shù)為26，置信度為0.55，得到10種核心藥物，共組成26組常用組合。按照藥物組合出現(xiàn)頻次由高到低排序。見表3。使用頻率最高的5種藥物組合依次為“白術(shù)-茯苓”“黃芪-白術(shù)”“黃芪-茯苓”“黨參-黃芪”“白花蛇舌草-黃芪”。選擇“規(guī)則分析”，根據(jù)藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則得出藥物組合規(guī)律共27組，其中“黨參，茯苓->白術(shù)”“黃芪，茯苓->白術(shù)”“甘草，茯苓->白術(shù)”“白花蛇舌草，白術(shù)->黃芪”為置信度較高的4種藥物組合規(guī)律。藥物組合按照置信度由高到低排序。見表4。并根據(jù)支持度與置信度繪制10種核心藥物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。見圖1。根據(jù)君臣佐使配伍規(guī)律及臨證經(jīng)驗(yàn)，我們從核心藥物中推導(dǎo)出核心復(fù)方“癌毒清”（白花蛇舌草-黃芪-莪術(shù)-甘草），并進(jìn)行后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。

2.4 ADQ活性化合物的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選并去除重復(fù)項(xiàng)，癌毒清中四味中藥共有118種化合物通過篩選，其中甘草有92種，莪術(shù)有3種，黃芪有20種，白花蛇舌草有7種。在118種化合物中，有8種化合物未能在TMCSP中找到對應(yīng)靶點(diǎn)，故將其剔除。使用TMCSP查找剩余的110種化合物的對應(yīng)靶點(diǎn)共計(jì)有255個(gè)。將255個(gè)靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niprot，限定”human”為篩查范圍，篩得能在Uniprot中找到對應(yīng)基因的靶點(diǎn)共240個(gè)，剩余15個(gè)未能在Uniprot中找到對應(yīng)基因的靶點(diǎn)予以剔除。重新整理剩余化合物與靶點(diǎn)基因的關(guān)系，剔除無對應(yīng)基因靶點(diǎn)的化合物，剩余化合物統(tǒng)計(jì)共108種。表5為靶點(diǎn)數(shù)最多的20個(gè)活性化合物信息。

2.5 構(gòu)建ADQ化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖及獲取核心基因

在中藥研究中，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖是一種展示化合物與其對應(yīng)靶點(diǎn)關(guān)系的手段。癌毒清的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖如圖2A所示。由圖可知，對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)最多的4種化合物分別是quercetin（353種）、kaempferol（83種）、naringenin（66種）和isorhamnetin（60種）。Gene Cards數(shù)據(jù)庫共有21 669種基因與腫瘤相關(guān)。將癌毒清中240種潛在的活性靶標(biāo)與21 669種腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行映射，得到230個(gè)共同靶基因，即潛在的ADQ抗腫瘤作用基因。將230個(gè)癌毒清潛在抗腫瘤基因輸入String11.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2B。PPI網(wǎng)絡(luò)由163個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 287條邊組成。通過Cytoscape CytoNCA的可視化拓?fù)浞治霁@得“degree”，“betweenness”和“closeness”3個(gè)拓?fù)涮匦浴Ｒ詃egree>50（中位數(shù)的兩倍）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到52個(gè)核心基因，其中IL6相關(guān)性最高，其次為TP53，MAPK3，VEGFA，TNF、CASP3、JUN、MAPK8、EGF、EGFR、MYC等。見表6。

2.6 GO分析及KEGG通路富集分析

使用David數(shù)據(jù)庫對52個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。見圖3A、圖3B、圖3C。選取P<0.05為是有顯著相關(guān)度的通路。GO富集結(jié)果顯示：生物學(xué)過程（Biological Process，BP）有關(guān)通路共有432條，其中P小于0.05的共有351條，主要與“藥物反應(yīng)（Response to Drug）”“凋亡的負(fù)反饋（Negative Regulation of Apoptotic）”“RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase II Promoter）”“血管生成（Angiogenesis）”和“轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA模板（Positive Regulation of Transcription，DNA-templated）”等相關(guān)。細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）相關(guān)通路有42條，其中P小于0.05的共有36條，主要與“細(xì)胞外間隙（Extracellular Space）”“細(xì)胞外液（Extracellular Region）”和“胞質(zhì)成分（Cytosol）”等相關(guān)。分子功能（Molecular Function，MF）相關(guān)通路有64條，其中P值小于0.05的共52條，主要與分子與蛋白的結(jié)合過程和蛋白活性的調(diào)節(jié)相關(guān)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，交集基因共參與106條通路的調(diào)節(jié)，其中P<0.05的有98條，與腫瘤相關(guān)的有50條。選取與腫瘤相關(guān)度最高的20條富集結(jié)果（圖3D）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路主要包括炎性反應(yīng)相關(guān)通路（TNF SignalingPathway，HIF-1 Signaling Pathway，F(xiàn)oxO Signaling Pathway，PI3K-Akt Signaling Pathway，NOD-like Receptor Signaling Pathway，MAPK Signaling Pathway，ErbB Signaling Pathway）、細(xì)胞凋亡相關(guān)通路（p53 Signaling Pathway）、免疫因子相關(guān)通路（Toll-like Receptor Signaling Pathway，T cell Receptor Signaling Pathway）、營養(yǎng)因子相關(guān)通路（VEGF Signaling Pathway），主要涉及膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌等的生物學(xué)過程。

2.7 藥物活性成分、核心靶點(diǎn)及通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)KEGG富集結(jié)果，選擇與腫瘤相關(guān)度最大的通路“Pathway in Cancer”，分析白花蛇舌草、莪術(shù)、甘草、黃芪與腫瘤相關(guān)的作用靶點(diǎn)與該通路的關(guān)系。見圖4。其中紅色星號(hào)標(biāo)記的為化合物與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。白花蛇舌草、莪術(shù)、甘草和黃芪可以調(diào)節(jié)通路圖中55個(gè)節(jié)點(diǎn)，可以作用于“持續(xù)性血管生成（Sustained angiogenesis）”“增殖（Proliferation）”和“逃避凋亡（Evading apoptosis）”等多條信號(hào)通路，這說明了白花蛇舌草、莪術(shù)、甘草和黃芪活性成分對腫瘤的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)模式是多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制的。我們通過上述分析，最終篩選出95個(gè)藥物活性成分，52個(gè)核心靶點(diǎn)與98個(gè)通路。通過對應(yīng)的關(guān)系建立癌毒清的藥物活性成分-核心靶點(diǎn)-通路圖。見圖5。

3 討論

本研究運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則、聚類算法和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析對國家名老中醫(yī)治療腫瘤的用藥規(guī)律進(jìn)行了深入分析。結(jié)果顯示名老中醫(yī)經(jīng)方、驗(yàn)方中的常用藥物以補(bǔ)氣健脾（黃芪、白術(shù)、甘草、黨參、人參）、清熱解毒（白花蛇舌草、半枝蓮、生地黃、山慈菇）、補(bǔ)益氣血（當(dāng)歸、熟地黃、白芍）、破血消癥（莪術(shù)、穿山甲）、利水滲濕藥（茯苓、薏苡仁）為主;藥性則多屬寒、溫;藥味多為苦、甘。藥物歸經(jīng)頻率最高的前五位依次為肝經(jīng)、肺經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，常用藥物與調(diào)和臟腑有關(guān)，或?qū)Ω纳颇[瘤病機(jī)具有較強(qiáng)針對性。中醫(yī)認(rèn)為正氣虧虛為腫瘤的發(fā)病基礎(chǔ)，熱毒內(nèi)蘊(yùn)阻滯氣機(jī)則為腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)。機(jī)體臟腑功能失調(diào)，以脾胃虛弱為甚，易釀生濕、熱、痰、瘀、虛等病邪，病邪相互膠結(jié)，使氣血不暢、脈絡(luò)瘀阻，或兼痰濕凝滯，故久而成積。病邪愈熾，破血妄行，機(jī)體損陰耗陽加重正虛，故形成惡性因果循環(huán)，使癌腫遷延進(jìn)展[6-7]。故歷代醫(yī)家對腫瘤辨證論治多以扶正祛邪為主要治則，時(shí)時(shí)健脾補(bǔ)腎扶助正氣，兼顧活血化瘀、清熱解毒、化痰散結(jié)等法以改善氣滯血凝。以攻補(bǔ)兼施之法貫穿始終，方能達(dá)到“養(yǎng)正積自消”的目的。

以國家名老中醫(yī)“驅(qū)邪扶正、攻補(bǔ)兼施”用藥思路為綱，并結(jié)合臨證經(jīng)驗(yàn)，我們從大數(shù)據(jù)所得核心藥物中選取白花蛇舌草、莪術(shù)、黃芪、甘草組成核心復(fù)方“癌毒清”。數(shù)據(jù)研究提示，方中用藥為高頻藥對（白花蛇舌草-黃芪、甘草-黃芪、莪術(shù)-黃芪頻次均大于30），且具有較高的置信度（莪術(shù)->黃芪、白花蛇舌草->黃芪置信度均大于0.58）。方中以白花蛇舌草為君藥，其性寒味苦，行清熱解毒、化痰散結(jié)之功;黃芪補(bǔ)而不塞、溫而不燥，故為佐藥，補(bǔ)中益氣，以扶正氣;佐以莪術(shù)活血通絡(luò)，取其破血不留瘀，活血不傷正的特點(diǎn)，恰能協(xié)助白花蛇舌草軟堅(jiān)散結(jié)，協(xié)同黃芪補(bǔ)益氣血，三藥相伍，化瘀通絡(luò)，以消癌毒阻滯。甘草生用以作使藥，既取其調(diào)和全方諸藥之性，又用其清熱解毒抗腫瘤之功，亦可補(bǔ)益脾氣。四藥相合，共奏健脾益氣，清熱解毒、活血化瘀之效。

諸多研究證實(shí)癌毒清中4味單藥均具抗腫瘤作用，且其作用機(jī)制與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測所得的富集通路、核心靶點(diǎn)、相關(guān)生物學(xué)過程等密切相關(guān)。白花蛇舌草可通過協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲、凋亡等多種生物學(xué)過程抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8]白花蛇舌草乙醇提取物可靶向作用于ERK/p38-MAPK信號(hào)通路，抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞中MMP-9和ICAM-1的表達(dá)，從而阻斷乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。亦有研究證實(shí)[9]類黃酮提取物下調(diào)TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA水平，并降低MAPK信號(hào)通路的相關(guān)分子磷酸化，從而發(fā)揮抗炎活性。臨床上黃芪廣泛用于抗腫瘤免疫療法輔助用藥，起減輕不良反應(yīng)、提高免疫力之效，目前廣泛認(rèn)為黃芪的抗癌機(jī)制為直接抗腫瘤作用與宿主免疫應(yīng)答的激活。研究發(fā)現(xiàn)[10]黃芪多糖以劑量依賴性的方式激活巨噬細(xì)胞釋放NO、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），并通過增加Bax/Bcl-2比例來誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡。在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡上，黃芪多糖不僅能通過CXCR4/CXCL12靶向抑制Treg細(xì)胞募集至腫瘤微環(huán)境，還可上調(diào)IFN-γ，IL-4的水平以促進(jìn)Th1分化過程，從而抑制肝細(xì)胞癌逃避免疫監(jiān)視[11]。此外，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可下調(diào)MDR1 mRNA和P-GP，提高化療藥物敏感性，從而減少多藥耐藥的發(fā)生[12]。大量研究表明莪術(shù)具有強(qiáng)大的抗癌活性，其主要機(jī)制為激活癌細(xì)胞中的凋亡途徑和抑制促癌過程如炎性反應(yīng)、腫瘤血管的生成與轉(zhuǎn)移。莪術(shù)中活性化合物β-欖香烯能通過Fas/FasL途徑直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]，亦能通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A（cyclin A）、cyclin B1及上調(diào)p21WAF1/CIP1、p53蛋白使腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期阻滯[14]。與此同時(shí)，莪術(shù)在調(diào)節(jié)腫瘤的炎性環(huán)境中具有強(qiáng)大的能力。β-欖香烯可調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎性因子如TNF-α，IL-6，IL-10的表達(dá)水平，并抑制IL-6/STAT3途徑從而發(fā)揮抗炎作用[15]。同時(shí)大量研究證實(shí)β-欖香烯可通過抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成[16-17]，并通過下調(diào)MMP-2、MMP-9、生長因子-β（TGF-β），上調(diào)E-鈣粘蛋白來減少上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[18-20]。甘草有扶助正氣之效，其抗腫瘤作用與調(diào)節(jié)免疫平衡相關(guān)。甘草酸抑制DC/巨噬細(xì)胞釋放IFN-γ，IL-6，TNF-α和IL-17等炎性反應(yīng)遞質(zhì)，影響T輔助細(xì)胞（Th17、Th1、Th2、Treg）的發(fā)育分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2和Treg/Th17平衡并趨于向Th1和Treg為主導(dǎo)的方向發(fā)展[21-22]。亦有研究發(fā)現(xiàn)甘草能靶向癌細(xì)胞自噬與凋亡過程。甘草活性成分異甘草素通過抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激活與上調(diào)自噬因子Atg5，使腺囊癌細(xì)胞發(fā)生mTOR依賴性自噬和凋亡細(xì)胞死亡[23]，同時(shí)大量研究證實(shí)[24-25]異甘草素可通過下調(diào)Bcl-2，cycD1及上調(diào)Bax，p53，p21水平，直接發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞凋亡作用。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)[26]，癌毒清顯著增強(qiáng)了紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡能力，并通過作用于核心靶點(diǎn)caveolin-1改善了乳腺癌耐藥細(xì)胞的化學(xué)敏感性，與此同時(shí)還進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21/cyclinB1及凋亡相關(guān)蛋白PARP1，BAX和Bcl-2的表達(dá)變化，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。我們結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果與參考單味中藥的研究結(jié)論，并根據(jù)核心基因的生物學(xué)功能與相關(guān)通路，將癌毒清治療腫瘤的機(jī)制歸納為4類：1）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;2）調(diào)控免疫平衡;3）抑制缺氧和炎性微環(huán)境;4）抑制新生血管形成。但癌毒清涉及多通路多靶點(diǎn)，其抗腫瘤作用、靶點(diǎn)和分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步臨床和基礎(chǔ)驗(yàn)證。

中藥方劑成分復(fù)雜，歷代醫(yī)家治療腫瘤經(jīng)驗(yàn)豐富，本研究通過總結(jié)名老中醫(yī)治療腫瘤臨床遣方用藥規(guī)律，挖掘核心復(fù)方并探討其配伍的科學(xué)性，為中醫(yī)方劑的溯源分析、傳承中醫(yī)用藥經(jīng)驗(yàn)、提高中醫(yī)藥臨床療效提供了方法學(xué)參考。本研究還利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測癌毒清主要活性成分、核心靶點(diǎn)、核心通路，在系統(tǒng)層面上揭示癌毒清治療腫瘤可能的信號(hào)通路與生物學(xué)過程，為后續(xù)分子機(jī)制進(jìn)一步研究與新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭榮壽，孫可欣，張思維，等.2015年中國惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019，41（1）：19-28.

[2]楊建宇，邢曉彤，魏素麗.國家級名老中醫(yī)腫瘤病驗(yàn)案良方[M].鄭州：中原農(nóng)民出版社，2010：1-193.

[3]周禎祥.唐德才.中藥學(xué)[M].2版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2016：1-484.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1-1748.

[5]Xu X，Zhang W，Huang C，et al.A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J].Int J Mol Sci，2012，13（6）：6964-6982.

[6]程海波，王俊壹.癌毒病機(jī)的生物學(xué)基礎(chǔ)探討[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，35（3）：241-244.

[7]胡熙文，齊元富，李慧杰.癌毒內(nèi)生要旨解析[J].四川中醫(yī)，2018，36（6）：45-47.

[8]Chung TW，Choi H，Lee JM，et al.Oldenlandia diffusa suppresses metastatic potential through inhibiting matrix metalloproteinase-9 and intercellular adhesion molecule-1 expression via p38 and ERK1/2 MAPK pathways and induces apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells[J].J Ethnopharmacol，2017，195：309-317.

[9]Chen Y，Lin Y，Li Y，et al.Total flavonoids of Hedyotis diffusa Willd inhibit inflammatory responses in LPS-activated macrophages via suppression of the NF-κB and MAPK signaling pathways[J].Exp Ther Med，2016，11（3）：1116-1122.

[10]Li W，Song K，Wang S，et al.Anti-tumor potential of astragalus polysaccharides on breast cancer cell line mediated by macrophage activation[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2019，98：685-695.

[11]Li Q，Bao JM，Li XL，et al.Inhibiting effect of Astragalus polysaccharides on the functions of CD4+CD25 highTreg cells in the tumor microenvironment of human hepatocellular carcinoma[J].Chin Med，2012，125（5）：786-793.

[12]Tian QE，Li HD，Yan M，et al.Astragalus polysaccharides can regulate cytokine and P-glycoprotein expression in H22 tumor-bearing mice[J].World J Gastroenterol，2012，18（47）：7079-7086.

[13]Li CL，Chang L，Guo L，et al.β-elemene induces caspase-dependent apoptosis in human glioma cells in vitro through the upregulation of Bax and Fas/FasL and downregulation of Bcl-2[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（23）：10407-10412.

[14]Lee RX，Li QQ，Reed E.β-elemene effectively suppresses the growth and survival of both platinum-sensitive and-resistant ovarian tumor cells[J].Anticancer Res，2012，32（8）：3103-3113.

[15]Xie Q，Li F，F(xiàn)ang L，et al.The Antitumor Efficacy of β-Elemene by Changing Tumor Inflammatory Environment and Tumor Microenvironment[J].Biomed Res Int，2020，2020：6892961.

[16]Chen W，Lu Y，Wu J，et al.Beta-elemene inhibits melanoma growth and metastasis via suppressing vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis[J].Cancer Chemother Pharmacol，2011，67（4）：799-808.

[17]Yan B，Zhou Y，F(xiàn)eng S，et al.β-Elemene-Attenuated Tumor Angiogenesis by Targeting Notch-1 in Gastric Cancer Stem-Like Cells[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：268468.

[18]Zhang X，Zhang Y，Li Y.β-elemene decreases cell invasion by upregulating E-cadherin expression in MCF-7 human breast cancer cells[J].Oncol Rep，2013，30（2）：745-750.

[19]Zhang X，Li Y，Zhang Y，et al.Beta-elemene blocks epithelial-mesenchymal transition in human breast cancer cell line MCF-7 through Smad3-mediated down-regulation of nuclear transcription factors[J].PLoS One，2013，8（3）：e58719.

[20]Shi H，Liu L，Liu L，et al.β-Elemene inhibits the metastasis of B16F10 melanoma cells by downregulation of the expression of uPA，uPAR，MMP-2，and MMP-9[J].Melanoma Res，2014，24（2）：99-107.

[21]Chen X，F(xiàn)ang D，Li L，et al.Glycyrrhizin ameliorates experimental colitis through attenuating interleukin-17-producing T cell responses via regulating antigen-presenting cells[J].Immunol Res，2017，65（3）：666-680.

[22]Tu CT，Li J，Wang FP，et al.Glycyrrhizin regulates CD4+T cell response during liver fibrogenesis via JNK，ERK and PI3K/AKT pathway[J].Int Immunopharmacol，2012，14（4）：410-21.

[23]Chen G，Hu X，Zhang W，et al.Mammalian target of rapamycin regulates isoliquiritigenin-induced autophagic and apoptotic cell death in adenoid cystic carcinoma cells[J].Apoptosis，2012，17（1）：90-101.

[24]李弋，彭靜，張蕾，等.異甘草酸鎂對乳腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2018，56（1）：38-44.

[25]Li C，Zhou X，Sun C，et al.Isoliquiritigenin inhibits the proliferation，apoptosis and migration of osteosarcoma cells[J].Oncol Rep，2019，41（4）：2502-2510.

[26]Wang N，Yang B，Zhang X，et al.Network Pharmacology-Based Validation of Caveolin-1 as a Key Mediator of Ai Du Qing Inhibition of Drug Resistance in Breast Cancer[J].Front Pharmacol，2018，9：1106.

（2020-03-24收稿 責(zé)任編輯：徐穎）