基于“配伍-拼合”理論中藥新藥發(fā)現(xiàn)模式的構建與應用

崔鶴蓉 李磊 郭文博

摘要 藥物研發(fā)在近幾十年來雖然取得了許多技術進步，但是其研發(fā)過程依然緩慢、昂貴且風險高。日前，我國已把新藥研究列入國家發(fā)展戰(zhàn)略的重大專項，建立一套高效低耗的藥物研發(fā)模式迫在眉睫。“配伍-拼合”系指將中藥復方的配伍原則和化藥設計中的結構拼合原理相結合，從經典藥對中選擇有效成分進行拼合，有機組合不同的藥物單元，以達到增效、減毒的目的，進而發(fā)現(xiàn)可開發(fā)為臨床新藥的先導化合物，基于“配伍-拼合”的研究思路，國內外學者完成了諸多實踐。本觀察組以“配伍-拼合”理論為指導，長期致力于中藥先導化合物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)研究，以臨床經典方藥中有效成分為先導，結合現(xiàn)代藥學評價手段，篩選出多個高效、低毒、靶向中藥先導化合物?；诖耍谡{研國內外相關研究的基礎上，雷海民教授原創(chuàng)性地提出基于“配伍-拼合”理論的中藥新藥發(fā)現(xiàn)模式，以期為現(xiàn)代新藥研發(fā)創(chuàng)制提供新的思路。

關鍵詞 新藥研發(fā);配伍;拼合;研究模式;中藥;新藥;復方;先導化合物

Abstract Despite technological advances in recent decades，drug research and development remains slow，expensive and has high risks.Nowadays，our country has already included new drug research on the major special project of national development strategy，thus establishing a research mode for drug discovery with high efficiency and low consumption is extremely urgent.“compatibility and combination”refers to the combination of compatibility in Chinese compound medicines and the structural combination in the design of chemical drugs.The effective components are selected from the classical compatibility for combination，and different units are organically combined to achieve the purpose of enhancing efficacy and reducing toxicity，so as to discover the leading compounds that can be developed as new clinical drugs.Guided by the theory of“compatibility and combination”，our research group has long been committed to the discovery and development of leading Chinese compounds，taking the effective components of classic clinical medicine as the lead and combining with modern drug evaluation methods，to screen out a number of high-efficiency，low-toxicity and targeted leading compounds of Chinese medicine.Based on this，based on the investigation of relevant research at home and abroad，Prof.LEI creatively proposed a new drugs of Chinese medicine discovery mode in order to provide new ideas for modern drug research and development.

Keywords Drug discovery; Compatibility; Combination; Research mode; Traditional Chinese medicine; New drugs; Compound; Leading compounds

中圖分類號：R283文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.029

藥物研發(fā)在近幾十年來雖然取得了許多技術進步，但是其研發(fā)過程依然緩慢、昂貴且風險高。從一個小分子篩選到成為候選藥物通常需要4～5年時間，耗費成本14百萬至25百萬美元，損失率約50%或更高[1]。最近估算結果顯示，從候選藥物到推出商業(yè)化產品，損失率高達97%，藥物開發(fā)的總成本（包括損失成本和資本成本）超過26億美元[2]。生物靶標的選擇是損失的關鍵來源。因此，全世界新藥研發(fā)中心在轉化科學方面進行了大量投資，以便更有效地驗證生物靶點在人類疾病中的作用，并確定用于評估潛在藥物的最合適的患者群體。為了尋找有效的治療方法，新的藥物研發(fā)模式已被成功地開發(fā)出來，最著名的是基于抗體的療法。然而，一些具有強大生物學基礎的靶點，包括各種轉錄因子和細胞內蛋白-蛋白相互作用，無論對目前的小分子藥物發(fā)現(xiàn)技術還是大分子方法都是非常具有挑戰(zhàn)性的。因此，建立一套高效低耗的藥物研發(fā)模式迫在眉睫。

天然產物和中藥是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源，國家對中醫(yī)藥的研究投入逐漸增加，屠呦呦獲得諾貝爾獎更表明了中醫(yī)藥對維護人類健康的深刻意義，國際醫(yī)學界對中國醫(yī)學研究的關注也更加深切，中藥領域正在實現(xiàn)從跟跑、并跑、到領跑的跨越，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物有很大的潛力。因此，構建具有中國特色、時代特色的新藥發(fā)現(xiàn)技術體系，結合中醫(yī)藥配伍理論，通過應用高內涵分析技術（HCA）、網絡藥理學、基因組學、功能基因組學等新方法、新技術進行新藥多靶點篩選，發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化先導化合物作為候選藥物，對現(xiàn)代新藥研發(fā)創(chuàng)制和中醫(yī)藥國際化有重要意義。

“配伍-拼合”理論系指將中藥復方的配伍原則和化藥設計中的結構拼合原理相結合，從臨床有效的經典藥對中選擇有效成分進行拼合，有機組合不同的藥物單元，以達到增效、減毒的目的，進而發(fā)現(xiàn)可開發(fā)為臨床新藥的先導化合物[3]。我們以“配伍-拼合”理論為指導，長期致力于中藥先導化合物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)研究，以臨床經典方藥中有效成分為先導，結合現(xiàn)代藥物評價手段，篩選出多個高效、低毒、靶向中藥先導化合物[4-10]?；诖?，雷海民教授提出基于“配伍-拼合”理論的中藥新藥發(fā)現(xiàn)模式，將中醫(yī)傳統(tǒng)用藥思想、現(xiàn)代藥物設計的拼合原理及現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)的其他相關方法應用到中藥創(chuàng)新藥物設計中，以期獲得符合中藥作用特點（多成分、多靶點、多途徑）的先導化合物，以期為現(xiàn)代新藥研發(fā)創(chuàng)制提供新的思路。

1 現(xiàn)狀與問題

1.1 藥物研發(fā)模式亟待創(chuàng)新

經典的藥物研發(fā)流程在概念上可以分為兩部分[1]。第一個組成部分是藥物發(fā)現(xiàn)，通過初始篩選實現(xiàn)——通常是一種高通量的體外試驗，可篩選多達106種化合物，設置和分析這樣的篩選工作通常需要1年時間。第二部分是通過設計-制造-測試-分析循環(huán)（DMTA循環(huán)）確定候選藥物。除了預期的生物活性之外，這種優(yōu)化還必須考慮對候選藥物至關重要的其他特性，包括藥代動力學和安全性。大型制藥公司的化學團隊通?？梢栽?～2個先導序列上并行執(zhí)行DMTA循環(huán)，每次循環(huán)需要4～6周。近年來藥物研發(fā)基本策略的進展主要集中在初始篩選部分，使第一部分的藥物發(fā)現(xiàn)并不完全依賴于大規(guī)模篩選（盡可能規(guī)避損失成本），探索更高效低耗的藥物發(fā)現(xiàn)思路與新方法[11]。高通量的化學實驗和分析工具的發(fā)展，使得在1 d內進行超過1 500次的微克級同步實驗成為可能，能夠快速識別合適的反應條件，探索化學空間，加速藥物發(fā)現(xiàn)[12]。然而，預測化學合成領域仍處于起步階段，通過機器學習過程構建預測算法的技術仍需在未來幾年進一步提高[13]，并且，上述這種主流的藥物發(fā)現(xiàn)模式局限于多學科交叉背景的專業(yè)人才和科研平臺，難以被廣泛應用[14]。

1.2 亟需構建具有中國特色的新藥發(fā)現(xiàn)研究模式

盡管我國的新藥研究領域近年來有了長足的進步，從“仿制”階段轉向“仿創(chuàng)”階段，然而，在研發(fā)思路、生物學技術等方面與西方國家仍存在較大差距[14]。我國從20世紀80年代開始，全國科研單位相繼開展了基于動物模型的藥物篩選工作，但是尚未形成規(guī)模化[15-17]。直到1996年，中國醫(yī)學科學院藥物研究所引進了國內第一臺Biomek2000型實驗室自動化工作站，標志著全國性的大規(guī)模藥物篩選拉開序幕[18]。目前，我國各大科研機構引進以高通量藥物篩選模式為主的相關新理論、新方法、新技術來發(fā)展我國的新藥研發(fā)，缺乏源頭創(chuàng)新[19-20]。

中醫(yī)藥學具有數千年的臨床應用基礎，其整體觀、辨證論治思想、組方配伍理論與當今現(xiàn)代醫(yī)學對診治疾病的認識趨勢一致，為我們提供了一個巨大的天然產物資源庫，減少篩選的盲目性[21]。我國的藥物篩選工作應該充分利用我國豐富的中醫(yī)藥臨床經驗、獨特的理論和中藥資源，借鑒國際先進的科學技術，開展高水平的符合國情的藥物篩選工作，為推動中醫(yī)藥國際化作出貢獻[21-24]。日前，我國已把新藥研究列入國家發(fā)展戰(zhàn)略的重大專項，建立一套高效低耗的藥物研發(fā)模式迫在眉睫。見圖1。

2 符合中醫(yī)藥特點的新藥發(fā)現(xiàn)模式的提出

2.1 “配伍-拼合”理論

“配伍-拼合”理論屬于中藥化學學科范疇。“配伍-拼合”系指將中藥復方的配伍理論和化藥設計中的結構拼合原理相結合，從經典藥對中選擇有效成分進行拼合，有機組合不同的藥物單元，以達到增效、減毒的目的，進而發(fā)現(xiàn)可開發(fā)為臨床新藥的先導化合物。配伍理論和拼合原理形式相似、目的相同，能相對高效快速地發(fā)現(xiàn)具有開發(fā)潛力的先導化合物[25-34]。

2.2 基于“配伍-拼合”理論的新藥發(fā)現(xiàn)模式的提出

“配伍-拼合”理論提出之前，課題組主要從事傳統(tǒng)中藥化學研究模式為主的中藥/復方物質基礎發(fā)現(xiàn)、分離及結構修飾研究，在完成Ⅰ類治療乙型肝炎新藥海鞘醇的臨床前研究過程中，認為傳統(tǒng)中藥化學研究模式存在從中藥/復方中分離活性物質存在含量低、富集純化困難、生物效價低存在安全性風險等問題，基于此，雷海民教授提出“配伍-拼合”理論，并以此為核心主持完成國家自然科學基金面上項目——基于川芎系列對藥的先導化合物的發(fā)現(xiàn)研究（No.81173519），奠定了課題組創(chuàng)新中藥新藥研發(fā)模式（圖2），旨在完善基于“配伍-拼合”理論為關鍵技術的中藥復方新藥創(chuàng)制研究平臺，構建確有療效的先導化合物庫，建立符合中醫(yī)藥特點的新藥創(chuàng)制新模式。

3 研究思路

基于“配伍-拼合”理論的中藥新藥發(fā)現(xiàn)模式，旨在結合拼合原理，將經典方藥中的功效組分拼合在一個分子中，以高效獲得不良反應小、藥理活性更好的創(chuàng)新藥物。具體而言，研究思路（圖3）可概括為：經典中醫(yī)方藥功效組分系統(tǒng)分析，結合現(xiàn)代藥物設計和化學合成技術，現(xiàn)代藥物體內外篩選方法（藥效學、毒理學研究），現(xiàn)代藥物代謝動力學研究，完成成藥性評價等各項臨床前研究工作，獲得符合中醫(yī)藥特點的先導化合物，開展臨床試驗研究，獲得具有自主知識產權的國家Ⅰ類創(chuàng)新藥物?；谏鲜鲅芯克悸匪玫降南盗行禄瘜W實體，無論是通過分離還是合成，其來源均是經典方藥的功效成分，因此其藥效評價建立在中藥復方的臨床應用基礎上，以方藥臨床治療疾病類型作為藥理活性篩選模型選擇的依據，不僅體現(xiàn)中藥經典名方有效物質功能主治病/證特色，更能有效地減少藥物前期篩選的盲目性，可以更加有的放矢的對得到的系列化合物的進行藥效學評價。

4 應用示例

這部分以具有神經保護活性的候選藥物，川芎嗪-安息香酸拼合物T-VA為例，詳細介紹新藥研發(fā)模式。川芎嗪-安息香酸系列拼合物的設計源于《太平惠民和劑局方》中收載的安息香圓，選擇安息香中主要活性成分安息香酸及川芎中川芎嗪作為基本結構單元，在化藥拼合原理的指導下，合成系列川芎嗪-安息香酸拼合物，并通過體外篩選、體內評價等環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)確有療效的神經保護候選藥物T-VA，該化合物有望實現(xiàn)成果轉化。

4.1 川芎嗪-安息香酸系列拼合物的合成、結構及體外活性表征

川芎嗪-安息香酸系列拼合物都是通過圖4A概述的路線合成的。2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪和3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酸是本研究的重要中間體。1a-5a的典型合成步驟包括在堿性條件下通過形成酯鍵和醚鍵，將溴-川芎嗪與其他羥基苯甲酸拼合，然后在20%（w/v）KOH水溶液中水解相應的川芎嗪氧基苯甲酸酯1a-5a，得到化合物1b-5b。上述拼合物的結構式如圖4B所示。

基于CoCl2致PC12細胞損傷模型，采用MTT法，初步評價上述拼合物的保護作用。4C中列舉了川芎嗪-安息香酸系列拼合物對PC12損傷細胞的EC50值，結果表明，合成的衍生物能有效保護CoCl2損傷的PC12細胞，大部分拼合物的活性高于川芎嗪（EC50=64.459 μmol/L）。其中，拼合物4a具有最強的保護活性（EC50=4.25 μmol/L），該化合物被命名為T-VA，待進一步評價其體內外神經保護作用。

4.2 T-VA的體內外神經保護活性評價及機制研究

本部分采用經典大腦中動脈閉塞SD大鼠模型及CoCl2致PC12細胞損傷模型，以尼莫地平（NMDP）為陽性對照藥，研究T-VA的神經保護活性及主要機制。結果顯示，T-VA能通過抑制損傷神經細胞的炎性反應，發(fā)揮體內外神經保護活性。

體內實驗部分，雄性SD大鼠隨機分組，用尼龍絲（直徑0.25 mm）結扎頸總動脈導致腦缺血模型，采用神經功能缺損評分、握力試驗等指標，評價T-VA的神經保護活性。結果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)了嚴重的神經系統(tǒng)損傷，而T-VA給藥（60、120 mg/kg）能有效保護這種損傷。體外實驗對T-VA的機制進行研究，采用免疫組織化學技術檢測PC12細胞中核因子-κB/p65、COX-2表達，結果顯示，模型組胞質中核因子-κB/p65、COX-2顯著升高，而T-VA給藥（60 μmol/L）能下調胞質中核因子-κB/p65、COX-2的異常表達，顯示出良好的抗炎活性[10]。

4.3 T-VA的體內代謝產物及急性毒性研究

儀器采用Accela 600 pump高效液相色譜-LTQ-Orbitrap XL質譜聯(lián)用儀，色譜柱為Agilent Zorbax SBC18（205 mm×4.6 mm×5 μm），電噴霧離子源（ESI）。色譜條件為流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇;梯度洗脫程序：0～20 min，70%B～85%B，流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量10 μL。質譜條件為ESI正離子模式，質量掃描范圍50～1 000 m/z;噴霧電壓30 kV;毛細管溫度300 ℃;輔助氣流速180 L/h;分析時，先采用高分辨傅里葉全掃描采集以及質譜，采用二維線性離子阱（LTQ）采集二級和三級質譜，自動選取上一級最強例子峰進行碰撞誘導解離裂解，碰撞能量為30%。雄性SD大鼠灌胃給藥T-VA（120 mg/kg），腹主動脈采血，收集血漿，離心、沉淀蛋白、氮吹后以甲醇溶解，0.45 μm過濾后進樣。根據裂解規(guī)律及代謝圖譜[35]，結果顯示，給藥大鼠血漿中除原型藥（RT=6.25 min）外，還能檢測到1種主要代謝產物M1（m/z 317.148 6）。

急性毒理學試驗采用ICR小鼠雌雄各半，每組15只，12 h內3次以最大耐受劑量（45 mg/mL）的T-VA給藥，0.4 mL/10 g，觀察給藥后14 d小鼠的行為學、毒理學及死亡情況。結果顯示，給藥后小鼠無毒性癥狀及異常行為，平均體質量和正常組小鼠沒有差異。

5 基于“配伍-拼合”理論中藥新藥發(fā)現(xiàn)模式的意義及應用價值

本研究思路能體系中醫(yī)藥的作用特點，將中醫(yī)傳統(tǒng)用藥思想、現(xiàn)代藥物設計的拼合原理及現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)的其他相關方法應用到中藥創(chuàng)新藥物設計中，以期獲得符合中藥作用特點（多成分、多靶點、多途徑）的先導化合物，該研究思路和研究方法對中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化有一定借鑒意義。本課題組以“配伍-拼合”理論為指導，依托北京市中藥基礎與新藥研究重點實驗室，長期致力于中藥先導化合物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)研究，以臨床療效確切的經典方藥中有效成分為先導，如異葉敗醬、姜黃、人參、蜂膠、加味西黃丸、十全大補湯等中的抗腫瘤活性成分，進行結構拼合研究，并在初步的藥理活性篩選工作基礎上，合成化合物并進行結構修飾或改造，獲得全新的化學實體，再結合現(xiàn)代藥物評價手段，篩選出高效、低毒、靶向中藥先導化合物。我們在長達7年多的實踐中，共在國內外高水平雜志上發(fā)表論文200余篇，申請國家發(fā)明專利6項，獲得國內外授權發(fā)明專利，并完成成果轉化[4-10]。

其中，基于原創(chuàng)研發(fā)思路，本團隊運用“中藥復方配伍法則·拼合原理”對“西黃丸”抗癌先導化合物開發(fā)與發(fā)現(xiàn)研究，歷時5年，完成千余新化合物設計、合成、活性篩選及成藥性評價工作，具體包括全新的化學實體的合成及結構修飾或改造，綜合多種體內外活性篩選模型評價其藥效活性，最后，經過構-效關系分析，獲得高效、低毒、選擇性好的抗癌先導化合物TBA-X，并成功將其專利ZL201110055102.X轉讓于上海思路迪醫(yī)藥科技公司，有望成功研制成為抗腫瘤Ⅰ類新藥。TBA-X的誕生正是源于傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶貴財富與和現(xiàn)代研究技術有機結合，也證實了“中藥復方配伍法則·拼合原理”理論指導下中藥創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)模式具有較大潛力。從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中挖掘新藥開發(fā)素材，運用多種手段進行中藥創(chuàng)新藥物開發(fā)研究，對中醫(yī)藥源頭創(chuàng)新具有重要意義。

6 結語

人類基因組計劃完成之后，生命科學的發(fā)展正面臨著從還原分析向系統(tǒng)整合的轉型[36-37]，各類組學、系統(tǒng)生物學、系統(tǒng)醫(yī)學、系統(tǒng)藥學的結合和應用成為目前新藥研發(fā)領域的重點發(fā)展方向[38-39]。然而，新藥發(fā)現(xiàn)方法體系依然在知識整合、功能分析方面面臨嚴峻的挑戰(zhàn)[40-46]。中藥學建立在中醫(yī)藥宏觀認識的基礎之上，采用“司外揣內”的分析和綜合方法[47]，與生物醫(yī)學的對接將為現(xiàn)代新藥研發(fā)帶來具有引領性的學術發(fā)展方向[48-50]。在傳承現(xiàn)代中藥研發(fā)“理法方藥，劑工質效”理論的基礎上，結合系統(tǒng)科學動態(tài)分析和經典藥物研發(fā)前沿技術[51-54]，建立符合中國特色的藥物發(fā)現(xiàn)技術體系，將為現(xiàn)代新藥研發(fā)領域帶來新的機遇。

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